一種油田嗜熱降解長鏈烴芽孢桿菌hnmc 11117及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種油田嗜熱降解長鏈烴芽孢桿菌HNMC11117及其應用,該菌株保藏編號為CGMCC No.12204。HNMC 11117菌株為以河南中原油田油藏底層溫度大于60℃充氣井的采出液為分菌樣品,經分離純化、篩選復檢,得到對鏈長C16~C30的烷烴有選擇性降解作用的高效菌株。本發明的菌株可用于提高高溫條件下的原油采收率及修復石油污染的土壤等領域。CGMCC No.1220420160311
【專利說明】
一種油田嗜熱降解長鏈烴芽孢桿菌HNMC 11117及其應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及石油開采及石油污染的土壤生物處理技術領域,具體涉及在高溫環境 下降解長鏈烴的菌株,菌株分離、篩選的方法,及其在提高原油采收率及修復石油污染的土 壤中的應用。
【背景技術】
[0002] 我國是一個能源消耗大國,石油供需矛盾十分突出,已經成為制約我國國民經濟 發展的重要因素之一。目前,我國陸上大多數主力油田已進入中后期開發階段,石油產量逐 年遞減,平均采收率不足30 %,采用新的技術來提高石油產量和采收率是當務之急。油藏微 生物一般是在特殊的溫度、壓力、鹽度、PH地質環境下,自然選擇出的一類種群結構和代謝 方式相適應的微生物,主要通過其代謝過程和代謝產物作用于原油、巖油、水界面以提高原 油采收率。利用油藏環境中的微生物資源提高采收率技術,通過調控油藏中微生物和微生 物群落、充分發揮其有利于采油的功能,可以很好地提高原油采收率和產量,適合于我國多 數油藏,在我國具有巨大的發展潛力。
[0003] 隨著各地油井開采深度的增加,大多數油井溫度已達50°C以上,原油中膠質、瀝青 質含量也越來越高,之前篩選和投入使用的采油微生物菌劑大多數是常溫菌,對油田長鏈 烴(膠質、瀝青質等)的降解不盡如人意,人們對井下油藏嗜熱微生物種群研究較少,配伍效 應研究不夠,而且不同油田環境存在差異較大的嗜熱菌群,用原來的采油微生物菌劑遠不 能滿足深井采油的需要。
[0004] 同時,在石油開采的過程中,由于井噴事故、輸油管和貯油罐的泄漏等原因,各種 石油制品不可避免的進入環境而造成污染。石油污染物進入土壤后,會破壞土壤結構,影響 土壤的通透性,影響植物生長,還可能污染地表水和地下水。
[0005] 基于以上因素,亟需優化、篩選、培養出群體效應好、可有效降解長鏈烴的耐熱或 嗜熱微生物用于降解原油中的膠質、瀝青來提高原油采收率,或者用于修復被石油污染的 土壤。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是針對上述高溫條件下降解石油存在的難題以及石油污染土壤的 問題,提供能高效降解石油的菌株。
[0007] 本發明的目的在于提供以下方面:
[0008] (1)-種油田嗜熱降解長鏈烴芽孢桿菌HNMC 11117,該菌為蒼白空氣芽孢桿菌 (Aeribacillus pallidus),芽孢桿菌屬,已于2016年3月11日保藏于中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心,保藏地址:北京市朝陽區北辰西路1號院,中國科學院微生物 研究所,郵政編碼:1〇〇1〇1,保藏編號:CGMCC No. 12204。
[0009] (2)根據上述(1)所述的菌,可有效降解石油烴,優選長鏈烷烴,更優選鏈長C16~ C30的烷烴。
[0010] (3)根據上述(1)或(2)所述的菌的分離、篩選方法,包括以下步驟:
[0011] 1)分離純化:直接取油田采出液,涂布于培養基平板上,恒溫培養,待菌落生長穩 定,接入培養基上,繼續恒溫培養,采用劃線法,多次挑取單菌落純化,直至獲得菌落形態一 致的純菌株;
[0012] 2)篩選:活化菌體細胞,將菌體細胞接入液體搖瓶篩選基礎培養基中,恒溫培養, 選取使原油分散明顯、培養基濁度增加顯著的菌株;
[0013] 3)重復上述分離純化、篩選實驗,直至篩選到原油降解效果好的菌株。
[0014] (4)根據上述(3)所述的方法,其中,所述步驟1)中菌的培養溫度為45-65Γ,優選 50-60°C ;所述步驟2)中菌的培養溫度為45-65°C,優選50-60°C。
[0015] (5)根據上述(3)所述的方法,其中,步驟1)中H培養基包括以下重量配比的組分: 酵母膏 8-12份, 乳酸 0.5-2份,
[0016] NaCl 8-1.2份,' H2O 1000 份,
[0017] 調節其 pH 為 7.0-7.5。
[0018] (6)根據上述(3)所述的方法,其中,步驟2)中的液體搖瓶篩選基礎培養基包括以 下重量配比的組分: NaCl 4-6份, K3PO4 0.8-1.2份, NHvHaPOi 0.8-1,2份,
[0019] (NH4)2SO1 0.8-1.2 份, MgSOt 7H2O 0,1_0..3份, KNOs 2-4份, HjO 1000 份,
[0020] 調節 pH至 7.5-8.5。
[0021] (7)根據上述(3)所述的方法,其中,步驟2)中的液體搖瓶篩選基礎培養基中加入 原油,其添加量為培養基總重量的〇. 5wt %-2. Owt %。
[0022] (8)根據上述(1)或(2)所述的菌用于降解長鏈烷烴的用途。
[0023] (9)根據上述(8)所述的菌的用途,其中,菌的降解條件如下:
[0024]溫度45-65°(:,優選50-60°(:,更優選55°(:;和/或
[0025] pH6 · 0-8 · 5,優選 pH6 · 5-7 · 5,更優選 pH7 · 0;和/或
[0026] NaCl 濃度0.1%-2.0%,優選0.5%_1.5%,更優選1.0%。
[0027]根據本發明提供的一種油田嗜熱降解長鏈烴芽孢桿菌HNMC 11117,具有以下有益 效果:
[0028] I、耐熱性:本發明成功地從油田高溫采出液中分離、篩選出在高溫條件下生長良 好的蒼白空氣芽孢桿菌(Aeribacillus pallidus),可有效提高高溫條件下長鏈烴降解率;
[0029] 2、群體效應:本發明中菌株在高溫高壓油藏環境中,和環境中自然存在的菌株產 生配伍,協同作用原油,提高了原油中長鏈烴降解效率;
[0030] 3、對長鏈烷烴的選擇性降解:能夠利用石油烴和多種烷烴為唯一碳源和能源生 長,可選擇性的降解長鏈烷烴;
[0031] 4、高降解能力:在高溫條件下,相比于已有的采油微生物菌,無論是常溫菌還是耐 熱菌,本發明菌株具有更好的長鏈烷烴降解能力。
【附圖說明】
[0032] 圖1為HNMC 11117菌株顯微鏡觀察(40X100)下的菌體形態;
[0033]圖2為AlkB基因的烴類降解途徑;
[0034] 圖3為HNMC 11117菌株基于16SrDNA相似性構建的系統進化樹;
[0035] 圖4為原油空白對照氣相全烴色譜圖;
[0036] 圖5為HNMC 11117菌株以原油為唯一碳源氣相全烴色譜圖;
[0037]圖6為HNMC 11117菌株以原油和1 %酵母粉為碳源氣相全烴色譜圖。
【具體實施方式】
[0038] 下面通過對本發明進行詳細說明,本發明的特點和優點將隨著這些說明而變得更 為清楚、明確。
[0039] 在這里專用的詞"示例性"意為"用作例子、實施例或說明性"。這里作為"示例性" 所說明的任何實施例不必解釋為優于或好于其它實施例。盡管在附圖中示出了實施例的各 種方面,但是除非特別指出,不必按比例繪制附圖。
[0040] 本發明提供了一種油田嗜熱降解長鏈烴芽孢桿菌HNMC 11117菌株。所述菌株為蒼 白空氣芽孢桿菌(Aeribacillus pallidus),芽孢桿菌屬,保藏編號為CGMCC No. 12204。 HNMC 111 17菌株的菌體形態如圖1所示,芽孢橢圓到柱狀,大小為(0·6μπι~0·9μπι) X (1 ·Ομπι ~1.5μπι),菌落表面粗糙不透明,乳白色類圓狀,直徑為2mm~4mm。本發明中,HNMC 111 17菌 株可降解石油烴,優選長鏈烷烴,更優選鏈長C16~C3q的烷烴。
[0041] HNMC 11117菌株來源于河南中原油田油藏底層溫度大于60°C充氣井的采出液,菌 株經分離純化,篩選復檢,從多株優選菌株中篩選出一株能有效利用石油烴生長,對長鏈烷 烴有選擇性降解能力的高效菌株。
[0042]本發明中,所述油田嗜熱降解長鏈烴芽孢桿菌HNMC 11117的分離、篩選方法,包括 以下步驟:
[0043] 1)分離純化:取油田采出液,在培養基平板上培養,多次挑取單菌落純化,直至獲 得純菌株;
[0044] 2)篩選:純化菌體細胞,將菌體細胞接入液體搖瓶篩選基礎培養基中培養,選取降 解率高的菌株。
[0045] 在一種優選的實施方式中,HNMC 11117菌株的分離、篩選方法為:
[0046] 1)菌株的分離純化:直接取油田高溫采出液,均以200yL涂布于H培養基平板上,于 45-65Γ恒溫培養,觀察菌落生長情況。待菌落生長穩定,從每個樣品的分離平板中,挑選單 菌落生長較清晰的平板,盡可能挑去平板上所有單菌落,全部轉接入H培養基上,45-65Γ恒 溫培養。采用平板3區劃線法,多次挑取單菌落純化,直至獲得菌落形態一致的純菌株。 [0047] 2)原油降解菌的多項篩選試驗:應用H培養基活化純培養細胞,45-65 °C恒溫培養1 天,離心收集新鮮的菌體細胞,無菌水清洗3次以除去殘留碳源。按1 %接種量,將菌體細胞 轉接入以原油為唯一碳源的液體搖瓶篩選基礎培養基中,以不接菌的液體搖瓶篩選基礎培 養基做空白對照,120r/min、45-65°C恒溫培養21天,觀察搖瓶中原油在水溶液中的分散狀 況、培養基濁度變化等表觀現象,并記錄試驗結果。選取原油分散較明顯、培養基濁度增加 顯著的菌株。
[0048] 其中,所述H培養基,包括8-12重量份酵母膏、0.5-2重量份乳酸、8-12重量份NaCl 和 1000 重量份H2O,調節 pH至 7 · 0-7 · 5,121°C 滅菌 25min。
[0049] 所述液體搖瓶篩選基礎培養基,包括4-6重量份NaCl、0.8-1.2重量份K3P〇4、0.8-1 ·2重量份ΝΗ4Η2Ρ〇4、0·8-1 ·2重量份(NH4)2S〇4、0· 1-0·3重量份MgS〇4 · 7Η20、2-4重量份ΚΝ〇3、 以及1000重量份H2O,調節pH至7.5-8.5;所述搖瓶篩選培養基中還加入原油,添加量為培養 基總重量的〇.5%-2.0%,加入原油后,121°(:滅菌3〇11^11,滅菌3次。
[0050] 在進一步優選的實施方式中,重復上述分離純化、篩選試驗,直至篩選到效果穩定 的菌株。對該功能菌株做進一步經降解特性分析,同時進行菌種多項分類鑒定。
[0051] 本發明中主要通過基因篩選和搖瓶篩選兩種方法對石油烴進行降解功能特性的 研究,通過對其實驗結果的判定篩選出高效的石油烴降解菌株,并確定其降解效率。
[0052] 在基因篩選實驗中,主要研究途徑是通過對純化得到的菌株基因組DNA中石油烴 降解功能基因 AlkB的篩選,判斷其是否含有石油烴降解基因片段。首先利用AlkB功能基因 的引物對樣品基因組DNA進行擴增,陽性擴增序列的表達呈現,說明此菌株具有潛在的含有 石油烴降解的基因片段,再通過分子克隆技術,測出該系列的全部系列長度,與GenBank數 據庫中信息進行比對,從而確定該菌株對石油烴降解的潛力。AlkB基因為烴類降解的單加 氧酶基因,主要是合成烴類降解的單加氧酶,是目前所有研究發現的烴類降解途徑中最主 要的、必須經過的途徑,具體降解途徑如圖2所示。
[0053]在搖瓶篩選實驗中,主要研究途徑是將純化得到的菌種活化后加到以原油為唯 一碳源的無機鹽培養基中,在55°C條件下培養21天后,搖瓶培養120r/min,通過觀察原油分 散于培養基水相、并使培養基逐漸渾濁的表觀現象的初步判斷其降解功能。收集微生物降 解原油的反應液,采用三氯甲烷進行萃取,氣相色譜一質譜(GC-MS)聯用技術進行全烴組分 的測定,確定原油組分中正構烷烴的濃度變化。具體方法如下:
[0054]在IOOmL培養液中加入ImL鹽酸水(I: 1)酸化,使pH降至2.0以下;將全部水樣倒入 分液漏斗中,部分原油黏附在三角瓶的瓶壁上,用三氯甲烷將該部分原油從瓶壁上洗脫后 倒入分液漏斗中,每IOOmL水樣加入20mL三氯甲烷,充分振蕩,倒入250mL分液漏斗中,240r/ min振蕩5min,靜置。待分層完全后,先將水樣放出,然后放出下層油樣至50mL離心管中;重 復三氯甲烷萃取步驟兩次;將萃取液于SOOOrpm離心10min,吸去上層水相,將油相轉移至已 知重量的IOOmL三角瓶中;放于通風櫥內蒸干溶劑,殘油稱重,常溫保存在三角瓶中;萃取回 收后,用氣相色譜分析其與對照樣品組分的全烴成分變化情況,通過對其全烴組分含量的 測定判斷其降解效率。從而優選出最佳降解菌株。
[0055] 篩選出的菌株基因測序結果與GenBank中的已有序列進行Blast比對,采用MEGA軟 件繪制系統進化樹以確定菌株的種屬關系,如圖3所示,其中括號內的編號為菌株的 GenBank登錄號。顯MC 11117基因序列與蒼白空氣芽抱桿菌(Aeribacillus pallidus) DSM3670T(GenBank登錄號為Z26930)的16SrDNA基因同源性最高,相似性為100%,結合菌種 形態以及多項分類鑒定試驗結果,確定H N M C I I I 1 7菌株為蒼白空氣芽孢桿菌 (Aeribacillus pallidus)。
[0056] 在更進一步優選的實施方式中,由于原油中可能存在耐高溫菌,在搖瓶培養基制 備的滅菌過程中,重復滅菌3次。盡管如此,為確認搖瓶篩選培養效果是轉接的目標菌株作 用的結果,重新分離純化培養21天后的搖瓶篩選基礎培養液中的菌株,即取培養21天后搖 瓶培養液20此,涂布于H培養基平板,45-65 °C培養24h,挑取多個單菌落純化,分別提取各純 培養物細胞的基因組DNA,PCR擴增、測序,比對16 SrDNA。所述PCR反應體系(2 5yL)包括:0.5μ 1正向引物組(2(^]\〇,0.541^反向引物組(2(^]\〇,2.541^10\?〇1?緩沖液,1.541^]\^(:12 (25mM),0·5yL dNTP( IOmM),0· 5yL TaqDNA聚合酶(2· 5U/yL),DNA模板lyL,H2O補充至25yL。 PCR擴增反應程序為:蓋溫:98 °C,IOmin;預變性:95 °C,IOmin;變性:94 °C,Imin;退火:55 °C, 40s;延伸:72°C,lmin;72°C,5min;降溫至4°C ;其中2-4步運行30個循環。經凝膠電泳分析 后,進行測序,16SrDNA(片段)測序結果一致,如SEQ ID N0.1所示。
[0057] 試驗例
[0058]實驗中所用各培養基配制分別為:
[0059] H培養基由IOg酵母膏、Ig乳酸、IOgNaCl和1000 gH2O配置而成,調節pH至7.0。
[0060]液體搖瓶篩選基礎培養基由 5gNaCl、lgK3P〇4、lgNH4H2P〇4、lg(NH4)2S〇4、 0.2gMgS〇4 · 7H20、3gKN03、以及1000 gH2O配置而成,調節pH至8.0。
[0061]無機鹽培養基由58似(:1、181(2冊〇4、18順4112?〇4、18(順4)23〇4、0.28]\^5〇4.7!12〇、 3g KNO3和1000 gH2O配制而成,調節pH至7.0。
[0062] 含1 %酵母膏的無機鹽培養基由無機鹽培養基添加 lwt%酵母膏配制而成,調節pH 至 7·0〇
[0063] 上述各培養基加入原油后,需121°C滅菌30min,滅菌3次。
[0064] 實驗中所用各培養基中組分來源分別為:
[0065] 原油,來源于河南中原油田油藏底層溫度大于60°C充氣井的采出液;酵母膏,購自 北京奧博星生物技術有限公司;乳酸,分析純,購自北聯精細化學品有限公司;NaCl,分析 純;K 3P〇4,分析純;NH4H2P〇4,分析純;(NH4) 2S〇4,分析純;MgS〇4 · 7H20,分析純;KNO3,分析純; K2HPO4,分析純;H2O,一級水。
[0066] 試驗例1溫度對HNMC 11117生長的影響
[0067]溫度梯度實驗采用無機鹽培養基,菌株轉接量為1 %,每個梯度3個平行,恒溫培養 24h后測得其0D630值。結果如表1所示,可見菌株在55°C生長最佳。本菌株投入高溫高壓油 藏環境,和環境中自然菌株產生配伍,可通過信號分子協同作用原油。
[0068] 表1溫度梯度菌液OD值
[0070] 試驗例2pH對HNMC 111 17生長的影響
[0071] 以無機鹽培養基為基礎,滅菌后,采用無菌的NaOH溶液和HCl溶液調整培養基pH為 不同的梯度,并分裝入無菌試管中(3mL/支)。轉接量1%,每個梯度3個平行,恒溫55°C培養, 24h后測得其OD 63q值。結果如表2所示,可見菌株在pH為7時生長最佳。
[0072] 表2pH梯度菌液OD值
[0074] 試驗例3NaCl濃度對HNMC 11117生長的影響
[0075]以不含NaCl的無機鹽培養基為基礎,添加不同濃度的NaCl,配制成NaCl%(w/v)梯 度培養基,pH7.0,滅菌備用。轉接活化好的菌液1 %接種量于NaCl %梯度培養液中,每個梯 度3個平行,恒溫55°C培養,24h后測得其OD63q值。結果如表3所示,可見菌株在1 %的NaCl含 量時生長最佳。
[0076] 表3鹽度梯度菌液OD值
[0078] 實施例
[0079] 實施例1HNMC 11117菌株的分離、篩選
[0080]本發明中油田嗜熱降解長鏈烴芽孢桿菌HNMC 11117的分離、篩選方法,包括以下 步驟:
[0081 ] 1)分離純化:直接取油田高溫采出液,均以200yL涂布平板,涂布與于H培養基平板 上,置于55°C恒溫培養,觀察菌落生長情況。待菌落生長穩定,從每個樣品的分離平板中,挑 選單菌落生長較清晰的平板,盡可能挑去平板上所有單菌落,全部轉接入H培養基上,55°C 恒溫培養。采用平板3區劃線法,多次挑取單菌落純化,直至獲得菌落形態一致的純菌株。 [0082] 2)多項篩選試驗:應用H培養基活化純培養細胞,55 °C恒溫培養1天,離心收集新鮮 的菌體細胞,無菌水清洗3次以除去殘留碳源。按1 %接種量,將菌體細胞轉接入液體搖瓶篩 選基礎培養基中,以不接菌的液體搖瓶篩選基礎培養基做空白對照,120r/min、55 °C恒溫 培養21天,觀察搖瓶中原油在水溶液中的分散狀況、培養基濁度變化等表觀現象,并記錄試 驗結果。選取原油分散較明顯、培養基濁度增加顯著的菌株,重復上述篩選試驗,直至篩選 到效果穩定的菌株,即為蒼白空氣芽孢桿菌(Aeribacillus pallidus)HNMC 11117。
[0083] 實施例2HNMC 111 17菌株的原油降解性能
[0084] 分別采用H培養基、無機鹽培養基和含1%酵母膏的無機鹽培養基,均添加 lwt%原 油,以不同的溫度、鹽度和pH值的條件,120r/min,恒溫培養21天,從菌株對原油分散的表觀 現象和培養液的渾濁程度,分析菌株對原油降解的最佳作用條件。即部分搖瓶中的培養液 呈現渾濁狀態,原油無掛壁現象,能夠完全分散于液體培養基中。
[0085] 綜合其培養條件和理化因素可以看出,菌株HNMC 11117在pH7.0、55°C、1.0%NaCl 含量條件下,以無機鹽培養基和含1%酵母膏的無機鹽培養基為降解培養基,對原油降解的 表觀現象最為顯著。結果如表4所示,其中,表示無明顯分散,"+"表示明顯分散,"++"表 示顯著分散。
[0086] 表4在不同的溫度、鹽度和pH值下的原油降解性能
[0088] 石油烴降解率和選擇性的測定方法采用氣相色譜法。氣相色譜法由于原油組分測 定條件的限制,將在搖瓶實驗中選擇樣品進行原油組分的測定,主要為原油中全烴含量的 變化。以不接入菌種的樣品做對照,采用GC-MS聯用技術進行全烴組分的測定,確定原油組 分中正構烷烴的濃度變化。
[0089]全烴色譜測定采用執行標準:SY/T 5779-2008《原油全烴氣相色譜分析方法》。氣 相色譜儀為\^1^113700(細61';[0311),色譜柱為彈性石英毛細柱,長30111,內徑0.221]11]1。設置氣 相色譜儀和色譜數據處理機的分析條件:載氣:99.999 %氮氣;進樣口 : 300 °C ;檢測器FID: 300 °C ;色譜柱:HP-I彈性石英毛細柱(60m X 0 · 25mm X 0 · 25μπι);柱溫:初溫40°C保持IOmin,4 °C/min升溫至70°C,8°C/min升溫至300°C,保持30min;載氣流速:恒流lmL/min;分流60:1。 [0090]通過搖瓶篩選后,對石油烴的降解作用采用GC-MS測得石油全烴組分的變化圖譜。 如圖4、圖5和圖6所示,通過測定全烴相關成分、相對含量和數據分析發現,原油處理前后C 16 和C17顯著增加,C3q有所減少,盡管C3q在處理前后的比值并不明顯低于其他的烴類,但由于 長鏈烴分子量大的原因,因而認為該比值表明C 3q較顯著地減少;又由于C3q減少的同時C16和 Cn增加,認為C16和C17應是C3q降解的部分產物。HNMC 11117菌對石油烴,特別是鏈長C16~C30 的長鏈烴有較好的降解能力。
[0091 ]實施例3與常溫菌株原油降解性能比較
[0092] 本發明中,以小于C16的液態烴類為唯一碳源,采用液體搖瓶篩選基礎培養基,通過 接入相同的菌體量,經過一段時間的培養后,通過OD值測定其菌體最終的生長量,以比對常 溫菌株SHY-33和菌株HNMC 11117的生長差異,進而確定原油降解性能的差異。液態烷烴為 正己烷,正辛烷,正癸烷,十二烷,十四烷,十六烷。
[0093] 將菌株在最適溫度下,活化培養12h。實驗前先將液態烷烴用0.22μπι濾膜過濾之 后,以2%的量加入到經過高溫滅菌后的50mL液體搖瓶篩選基礎培養基中,然后將目標菌株 活化后的菌體細胞收集后用無菌水清洗三次,以除去菌體細胞中殘留的碳源,以10%的接 種量接入液體搖瓶基礎培養基中培養。裝有烷烴培養基的三角瓶用橡皮塞封口,以防止高 溫和光照的條件下,液態烷烴的揮發。接種完畢的搖瓶,常溫菌株SHY-33在30 °C,菌株HNMC 11117在55 °C,150r/min條件下,搖床培養7d后,以相應不加任何烷烴的接菌液體搖瓶篩選 基礎培養基做空白對照,取樣測定各樣品的OD 63q值,結果如表5所示。菌株HNMC 11117能高 效利用C6-C16直鏈烷烴進行生長,而代表菌株SHY-33利用率較低。OD63Q值測定是以空白樣品 為"0"進行計算的。
[0094] 表5HNMC 11117與常溫菌株原油降解性能比較
[0096] 實施例4與耐熱菌株原油降解性能比較
[0097] 本發明中,以小于C16的液態烴類為唯一碳源,采用液體搖瓶篩選基礎培養基,通過 接入相同的菌體量,經過一段時間的培養后,通過OD值測定其菌體最終的生長量,以比對耐 熱菌株P388-53和菌株HNMC 11117的生長差異,進而確定原油降解性能的差異。液態烷烴為 正己烷,正辛烷,正癸烷,十二烷,十四烷,十六烷。
[0098]將代表菌株在最適溫度下,活化培養12h。實驗前先將液態烷烴用0.22μπι濾膜過 濾之后,以2%的量加入到經過高溫滅菌后的50mL液體搖瓶篩選基礎培養基中,然后將目標 菌株活化后的菌體細胞收集后用無菌水清洗三次,以除去菌體細胞中殘留的碳源,以10% 的接種量接入液體搖瓶基礎培養基中培養。裝有烷烴培養基的三角瓶用橡皮塞封口,以防 止高溫和光照的條件下,液態烷烴的揮發。接種完畢的搖瓶在55°C,150r/min條件下,搖床 培養7d后,以相應不加任何烷烴的接菌液體搖瓶篩選基礎培養基做空白對照,取樣測定各 樣品的OD 63q值,結果如表6所示。菌株HNMC 11117能高效利用C6-C16直鏈烷烴進行生長,而代 表菌株P388-53利用率較低。OD 63q值測定是以空白樣品為"0"進行計算的。
[0099] 表6HNMC 11117與耐熱菌株原油降解性能比較
[0101] 由上述實施例可知,分離出的具有烷烴降解功能的嗜熱蒼白空氣芽孢桿菌HNMC 11117,在最適降解原油條件為55°(:,?!17.0,似(:1濃度1.0%下,比已有的采油微生物菌,無 論是常溫菌還是耐熱菌,對原油和石油污染中的長鏈烴類具有更好的選擇性降解能力。
[0102] 以上結合【具體實施方式】和范例性實例對本發明進行了詳細說明,不過這些說明并 不能理解為對本發明的限制。本領域技術人員理解,在不偏離本發明精神和范圍的情況下, 可以對本發明技術方案及其實施方式進行多種等價替換、修飾或改進,這些均落入本發明 的范圍內。本發明的保護范圍以所附權利要求為準。
【主權項】
1. !1匪(:11117菌,保藏編號為〇61〇:叱.12204。2. 根據權利要求1所述的菌,其特征在于,所述菌為蒼白空氣芽孢桿菌,芽孢桿菌屬。3. 根據權利要求1或2所述的菌,其特征在于,所述菌可降解石油烴,優選長鏈烷烴,更 優選鏈長Cl6~C3Q的烷烴。4. 根據權利要求1至3之一所述菌的分離、篩選方法,包括以下步驟: (1) 分離純化:取油田采出液,在培養基平板上培養,多次挑取單菌落純化,直至獲得純 菌株; (2) 篩選:純化菌體細胞,將菌體細胞接入液體搖瓶篩選基礎培養基中培養,選取原油 降解率高的菌株。5. 根據權利要求4所述的方法,其特征在于,步驟(1)中菌的培養溫度為45-65°C,優選 50-60°C ;步驟(2)中菌的培養溫度為45-65°C,優選50-60°C。6. 根據權利要求4所述的方法,其特征在于,步驟(1)中所述培養基包括以下重量配比 的組分: 酵母膏 8-12份, 乳酸 0.5-2份, NaCl 8'12份, H2〇 1000 份, 其pH為7.0-7.5。7. 根據權利要求4所述的方法,其特征在于,步驟(2)中所述液體搖瓶篩選基礎培養基 包括以下重量配比的組分: NaCl i 6份, K;5P〇t 0.8-1.2份, NH tHaPO t 0.8_1·2份, (NH Ji-iSO -t 0.8-1.2份, MgSOrTH^J 0.1-0.3 份, KNOs 2-4 份, Η20 1000 份, 其pH為7.5-8.5。8. 根據權利要求4所述的方法,其特征在于,步驟(2)中所述液體搖瓶篩選基礎培養基 中加入原油,基于培養基的總重量,原油為〇.5*1:%-2.(^1:%。9. 根據權利要求1至3之一所述的菌用于降解長鏈烷烴的用途。10. 根據權利要求9所述的菌的用途,其特征在于,菌的降解條件如下: 溫度45-65 °C,優選50-60 °C,更優選55 °C ;和/或 pH6 · 0-8 · 5,優選 pH6 · 5-7 · 5,更優選 pH7 · 0;和/或
【文檔編號】C12N1/20GK105861388SQ201610361364
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月26日
【發明人】王亞南, 安明理, 何蔚葒
【申請人】河南省科學院生物研究所有限責任公司