一種利用納米鉻生產酵母鉻的方法

一種利用納米鉻生產酵母鉻的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用納米鉻生產酵母鉻的方法。該方法以納米鉻為鉻源，利用酵母發酵技術，通過生物轉化將納米鉻轉變成酵母鉻，具體可包括以下步驟：(1)將酵母于32℃?36℃的溫度下，根據發酵體系中乙醇和溶解氧的變化，通過補料?分批操作對酵母進行高密度發酵培養。(2)通過補鉻?分批操作添加納米鉻，控制發酵培養基中納米鉻的濃度為100?500mg/L。(3)發酵結束后，將含有酵母的發酵液離心收集菌體，洗滌菌體，采用多聯酶解和高壓勻漿等技術對酵母進行破壁，將破壁后的酵母經提純干燥即獲得酵母鉻。本工藝生產的酵母鉻有機鉻含量達5000?9000mg/kg，適用于畜牧業，其生產方法實用性強，易于產業化生產。CGMCC No.1145320150923
【專利說明】
一種利用納米鉻生產酵母鉻的方法
技術領域
[0001]本發明屬于飼料添加劑領域，涉及一種利用納米鉻生產酵母鉻的方法。
【背景技術】
[0002]絡是動物的必需微量元素，是葡萄糖耐量因子(Glucose Tolerance Factor，GTF)的重要活性成分，能協助胰島素維持正常糖耐量，參與了機體的糖類代謝和脂類代謝，進而影響動物的生長、繁殖和胴體品質，具有降低熱應激，改善飼料轉化率，提高畜禽生產性能和繁殖力等功效。因此，動物補鉻很有必要。
[0003]作為飼料添加劑的鉻一般分為無機鉻和有機鉻兩大類，無機鉻為氯化鉻、硫酸鉻等;有機鉻在農業部《飼料添加劑品種目錄》中允許添加的有煙酸鉻、酵母鉻、蛋氨酸鉻、吡啶甲酸鉻和丙酸鉻共5個品種，瑞士聯邦學院畜牧所的Gebert和Wenkin發現酵母鉻的效果最好。酵母鉻是利用酵母具有富集微量元素的能力，將無機鉻吸收轉化為有機鉻，與無機鉻相比，有機鉻毒性低，動物更容易吸收利用。
[0004]酵母鉻作為飼料添加劑使用，添加量為200_800g/噸，三價鉻的毒性遠低于六價鉻，有機鉻毒性低于無機鉻。大量試驗表明，日糧中添加鉻可提高特定組織器官中鉻的含量如肝和腎。Brockman (1986)報道，三價鉻的用量與中毒量之比是1:1000，可見三價鉻的使用是非常安全的。wayne等(1988)報道，大鼠日糧中添加5%氧化鉻持續飼喂SOd未見引起毒性效應。健康大鼠每天飼吡啶羧酸鉻含量為10mg/kg的日糧5個月，結果發現肝臟含有近750ug/kg的鉻，但未發現任何組織學和生化的毒性證據。嚴乾臨等(2000)報道，給20-25kg豬飼喂鉻濃度為500ug/kg的煙酸鉻日糧105d后，未發現對豬產生毒性作用，特別是鉻沉積量較多的器官如肝臟，試驗組鉻沉積量與對照組相比，有升高的趨勢，但差異不顯著。AnderSon(1997)給豬日糧添加濃度為300ug/kg的吡啶羧酸鉻，增加了肝臟和腎臟中的鉻含量，但心臟和其他組織鉻不受影響。董曉慧(2001)用氯化鉻、蛋氨酸鉻及煙酸鉻等3種鉻源對280只14日齡AA肉仔雞進行為期3w的飼養試驗，結果表明不同形式和水平的鉻不影響心臟、肝臟和胰臟相對重量。沈建忠(2002)以吡啶羧酸鉻對Wi star大鼠進行毒性試驗，其口服半數致死量(LD5q)大于5000mg/kg BW，說明吡啶羧酸鉻安全性大，對動物無明顯毒性。
[0005]當前酵母鉻的生產效率低下，無法做到高密度發酵。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是介紹利用納米鉻生產酵母鉻的方法。
[0007]本發明要求保護一種酵母菌菌株(Saccharomyces boulardii)GB15，其保藏編號為CGMCC N0.11453，保藏日期為2015年9月23日。
[0008]該菌株的保藏單位為隸屬中國微生物菌種保藏館里委員會普通微生物中心的地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國科學院微生物研究所，郵編為100101。
[0009]該菌株是鉻的耐受菌株且富鉻能力強。
[0010]另外，由上述本發明提供的酵母菌菌株GB15發酵培養而得的酵母鉻產品，也屬于本發明的保護范圍。
[0011]具體的，所述酵母鉻產品中，每kg產品中含酵母鉻5000-8000mg。
[0012]本發明還提供了兩種制備所述酵母鉻產品的方法。
[0013]其中，方法一包括如下步驟:
[0014]I)將所述酵母菌菌株GB15活化后于一級種子培養基中進行發酵培養，發酵完畢得到一級種子液；
[0015]所述一級種子培養基由鉻液a和下述兩種培養基中的任意一種組成:麥芽汁培養基或YI3D培養基；
[0016]其中，所述鉻液a為濃度為50_80mg/L的納米鉻的水溶液；
[0017]2)將步驟I)所得一級種子液加入到二級種子培養基中進行發酵培養，得到二級種子液；
[0018]所述二級種子培養基由鉻液b、碳源、氮源和無機鹽組成；
[0019]其中，所述鉻液b為濃度為50_80mg/L的納米鉻的水溶液；
[0020]3)將步驟2)所得二級種子液加入到由鉻液C、碳源、氮源和無機鹽組成三級培養基中進行發酵培養，發酵開始后，當有乙醇生成，溶解氧上升的時候開始補加補料培養基，并以維持乙醇的量不上升、溶解氧不上升控制流加的營養物質，當溶解氧低至15%-35% (具體可為15-25 %或25-35 %或20_30 % )時，控制營養物質流加量，維持溶氧不上升，在發酵8-12h(具體可為Sh或1h)時補加所述鉻液C，發酵完畢后，將所得發酵液離心，收集酵母菌體，破壁，干燥得到所述酵母鉻產品；
[0021]所述鉻液c為濃度為50-250g/L的納米鉻的水溶液，具體為200或250g/L的納米鉻的水溶液；
[0022]所述補料培養基由糖蜜和淀粉酶解產生的葡萄糖液組成，且所述糖蜜中的還原糖含量占總還原糖含量的20-60 %，具體可為20-30 % ,40-50%或50-60 % ;總還原糖的濃度為400-800g/L，具體可為 500-600g/L、600-700g/L 或 700-800g/L ；
[0023]所述鉻液c的補加量為使發酵體系中納米鉻的終濃度為100_500mg/L，具體可為400-500mg/L、350-450mg/L或400-450mg/L。
[0024]上述方法的步驟I)-步驟3)所述絡液a至絡液c中，納米絡的粒徑均為40-70nm;該納米鉻可通過可變電流激光離子束氣相法工藝生產，純度高，粒度均勻，表面結構完整，易分散，比表面積大，表面活性高。
[0025]所述步驟I)發酵培養步驟中，培養溫度為32-36°C;培養方式為振蕩培養;培養時間為 16-20h; pH 值為 5.0-6.0；
[0026]該步驟所用一級種子培養基可按照如下方法制得:將大麥芽粉與水混合、保溫糖化、過濾澄清后加水將濃度調節至10° Bx，納米鉻120mg，將此培養基定容到2400ml，調節pH5.0-6.0，用12個1000ml的三角瓶各裝培養基200ml，115°C滅菌30min而得；
[0027]所述步驟2)發酵培養步驟中，培養溫度為32_36°C;培養時間為10-15h;pH值為5.0-6.0 ；轉速為 200-350r/min ；
[0028]該步驟所用培養基中，碳源選自葡萄糖、糖蜜、玉米粉和淀粉水解糖中至少一種；氮源選自尿素、玉米漿和花生餅粉中至少一種;無機鹽選自磷酸、磷酸二氫鉀和硫酸鎂中至少一種；
[0029]具體的，該步驟所用培養基可按照如下方法制得:
[0030]在Im3種子罐上培養，葡萄糖12kg，糖蜜3kg，玉米漿1kg，尿素2kg，kH2P040.6kg，MgS04.7H2O0.3kg，納米絡20g，調節pH5.0-6.0，定容400L，實罐滅菌，121 °C滅菌20min，冷卻32°C而得;或者，
[0031 ] 在2m3種子罐上培養，葡萄糖37kg，糖蜜1kg，玉米漿20kg，尿素4kg，kH2P04l.2kg，MgSO4.7H200.6kg，消泡劑0.1kg，納米鉻50g，調節pH5.0-6.0，定容800L，實罐滅菌，121°C滅菌20min，冷卻32°C而得；
[0032]所述步驟3)發酵培養步驟中，培養溫度為32-36°C，pH值為5.0-6.0;攪拌轉速為250-350r/min，具體為 300r/min 或 350r/min ；
[0033]該步驟中，所用糖蜜為經過稀釋、調酸、煮沸、加堿中和和澄清處理的糖蜜;所述總還原糖的濃度具體可為400-500g/L、500-600g/L或700-800g/L;
[0034]該步驟中所用培養基具體可按照如下方法制得:
[0035]將葡萄糖600kg，糖蜜4kg，玉米楽10kg，kH2P047kg，MgS04.7H207kg，納米絡300g，消泡劑0.3kg，調節pH5.0-6.0，定容6m3，實罐滅菌，121°C滅菌30min而得；
[0036]鉻液的添加方式為周期補鉻；
[0037]所述補加鉻液步驟中，補加時間在5_7h內完成，具體可為6h或7h;
[0038]所述離心步驟中，轉速為8000-8500r/min，離心力為7000-8000g;
[0039]所述破壁的方法包括如下步驟:
[0040]先用復合酶解所述酵母菌體的細胞壁，再進行高壓勻漿；
[0041]所述復合酶具體為由葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶中的至少兩種組成，均可購自諾維信公司；
[0042]所述復合酶的用量為每kg酵母菌體用0.1-0.5g所述復合酶；
[0043]所述復合酶可為由質量比為1:4:4的葡聚糖酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶組成的復合酶或由質量比為1:8:4:4的葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶組成的復合酶；
[0044]所述葡聚糖酶的酶活為30000u/g;該酶活的定義為:在50°C、pH4.8條件下，I分鐘水解大麥β-葡聚糖產生Iymol還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量為I個酶活單位(U);
[0045]所述溶菌酶的酶活為500000u/g;該酶活的定義為:在25°C、pH6.2條件下，于450nm處每分鐘使吸光度值降低0.001為I個酶活力單位(U);
[0046]所述木瓜蛋白酶的酶活為lOOOOOu/g;該酶活的定義為:在25°C下、pH6.2條件下，每分鐘內能催化分解IumolN-苯甲酰-L-精氨酸乙酯所需的酶量，稱為I個酶活力單位(U);
[0047]所述堿性蛋白酶的酶活為200000u/g;該酶活的定義為:Ig固體酶粉(或Iml液體酶)在40°C、pH10.5下，Imin水解酪蛋白產生Iug酪氨酸，定義為I個蛋白酶活力單位(U)；
[0048]所述高壓勻漿步驟中，壓力為40_80Mpa，具體為55或60MPa;勻漿的次數為1-5次；具體可為2次；
[0049]所述干燥步驟中，干燥的方法為冷凍干燥，溫度具體為O至-50°C，真空度為1Pa，時間為2-4小時，具體為2小時或4小時。
[0050]方法二包括如下步驟:
[0051]I)將所述酵母菌菌株GB15活化后于一級種子培養基中進行發酵培養，發酵完畢得到一級種子液；
[0052]所述一級種子培養基由鉻液a和下述兩種培養基中的任意一種組成:麥芽汁培養基或Yro培養基；
[0053]其中，所述鉻液a為濃度為50_80mg/L的納米鉻的水溶液；
[0054]2)將步驟I)所得一級種子液加入到由碳源、氮源和無機鹽組成的二級培養基中進行發酵培養，發酵開始后，當有乙醇生成，溶解氧上升的時候開始補加補料培養基，并以維持乙醇的量不上升、溶解氧不上升來控制流加的營養物質，當溶解氧低至15%_35% (具體可為15-25 %或25-35 %或20_30 % )時，控制營養物質流加量，維持溶氧不上升;在所述發酵培養的同時將鉻液d以對數關系遞增的速度流加，流加的速度與酵母的生長速度相同，在對數生長期結束時停止流加，將所得發酵液離心，收集酵母菌體，破壁，干燥得到所述酵母鉻
τ?: 口廣PR ；
[0055]所述鉻液d為濃度為10_20g/L的納米鉻的水溶液，具體為15g/L的納米鉻的水溶液；
[0056]所述補料培養基由糖蜜和淀粉酶解產生的葡萄糖液組成，且所述糖蜜中的還原糖含量占總還原糖含量的20-60 %，具體可為20-30 %、40-50%或50-60 % ；所述總還原糖的濃度具體可為400-500g/L、500-600g/L 或 700-800g/L ；
[0057]所述鉻液d的補加量為使發酵體系中納米鉻的終濃度為100_500mg/L，具體可為400-500mg/L、350-450mg/L或400-450mg/L。
[0058]上述方法的步驟I)-步驟2)所述絡液a和絡液d中，納米絡的粒徑均為40-70nm;該納米鉻可通過可變電流激光離子束氣相法工藝生產，純度高，粒度均勻，表面結構完整，易分散，比表面積大，表面活性高。
[0059]所述步驟I)發酵培養步驟中，培養溫度為32-36°C;培養方式為振蕩培養;培養時間為16-20h ;pH值為5.0-6.0；該步驟所用一級種子培養基可按照如下方法制得:將大麥芽粉與水混合、保溫糖化、過濾澄清后加水將濃度調節至10° Bx，納米鉻60mg，將此培養基定容至Ijl200ml，調節pH5.0-6.0，用6個1000ml的三角瓶各裝培養基200ml，115°C滅菌30min而得；
[0060]所述步驟2)發酵培養步驟中，培養溫度為32-36°C，pH值為5.0-6.0;轉速為200-350r/min，具體為 300r/min ；
[0061]該步驟中，所用糖蜜為經過稀釋、調酸、煮沸、加堿中和和澄清處理的糖蜜;所述總還原糖的濃度具體可為400-500g/L、500-600g/L或700-800g/L;
[0062]具體的，該步驟所用培養基可按照如下方法制得:
[0063]將葡萄糖6000g，糖蜜40g，玉米楽80g，85%H3P0440g，MgS04.7H2044g置于 100L全自動發酵罐中，調節pH5.0-6.0，定容35L，實罐滅菌，121°C滅菌20min，冷卻32°C而得；
[0064]離心步驟中，轉速為8000-8500r/min，離心力為7000-8000g;
[0065]所述破壁的方法包括如下步驟:
[0066]先用復合酶解所述酵母菌體的細胞壁，再進行高壓勻漿；
[0067]其中，所述復合酶具體為由葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶中的至少兩種組成，均可購自諾維信公司；
[0068]所述復合酶的用量為每kg酵母菌體用0.1-0.5g所述復合酶；
[0069]所述復合酶具體為由質量比為2:1的溶菌酶和木瓜蛋白酶組成的復合酶；
[0070]所述葡聚糖酶的酶活為30000u/g;該酶活的定義為:在50°C、pH4.8條件下，I分鐘水解大麥β-葡聚糖產生Iymol還原糖(以葡萄糖計)所需的酶量為I個酶活單位(U);
[0071]所述溶菌酶的酶活為500000u/g;該酶活的定義為:在25°C、pH6.2條件下，于450nm處每分鐘使吸光度值降低0.001為I個酶活力單位(U);
[0072]所述木瓜蛋白酶的酶活為100000U/g;該酶活的定義為:在40°C下、pH7.5條件下，每分鐘內能催化分解酪蛋白生成Iug酪氨酸所需的酶量，稱為I個酶活力單位(U);
[0073]所述堿性蛋白酶的酶活為200000u/g;該酶活的定義為:Ig固體酶粉(或Iml液體酶)在40°C、pH10.5下，Imin水解酪蛋白產生Iug酪氨酸，定義為I個蛋白酶活力單位(U)；
[0074]所述高壓勻漿步驟中，壓力為40_80Mpa，具體為55MPa;勻漿的次數為1-5次；具體可為2次；
[0075]所述干燥步驟中，干燥的方法為冷凍干燥，溫度具體為O至-50°C，真空度為1Pa，時間為2-4小時。
[0076]所述方法二在所述步驟2)中還包括:在所述發酵培養過程中，采用流加氨水的方式補充氮源并控制發酵pH為5.0-6.0，控制攪拌轉速為250-350r/min ；
[0077]另外，可根據泡沫情況添加消泡劑控制泡沫。
[0078]另外，上述兩方法步驟I)之前，可對按照常規方法對酵母菌菌株GB15進行活化;如可按照如下方法進行活化:將酵母菌菌株GB15接種在含有I %酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、鉻(納米鉻)濃度為50-10(^111、？!14.5-6.0的固體培養基上，32°(:培養3211。
[0079]所述經過高密度發酵后酵母菌的濕重為200-300g/L。
[0080]本發明將酵母細胞培養在含鉻的培養基中，通過生物轉化將無機鉻轉轉變成有機絡，采用的絡源為納米絡(CrNano，納米級氯化絡，粒徑40-70nm)，納米絡由于具有更小的粒徑，更多的表面活性中心和比表面積，與氯化鉻相比，更容易實現跨膜運輸，可以更好的被酵母吸收，在酵母體內有更高的生物轉化率和酵母鉻產量。
[0081]酵母鉻產品由于酵母的細胞壁較厚較堅韌，很難被動物消化，被富集的鉻也很難被動物吸收利用，本發明在制得酵母鉻產品后采用多聯酶解和高壓勻漿等技術對酵母進行破壁，將酵母內的有機鉻被釋放出來，同時釋放出來的還有酵母本身的蛋白質、核糖核酸、B族維生素和多種氨基酸等，這些都是動物很好的營養來源。將破壁后的酵母經提純干燥即獲得最終的酵母鉻產品，從而使得本發明提供的酵母鉻產品同時具有補鉻和補酵母營養的雙重功效。
【具體實施方式】
[0082]下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但本發明并不限于以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業途徑獲得。
[0083]實施例1、在100L發酵罐上發酵(方法二)
[0084]斜面菌種培養:將保藏編號為CGMCC N0.11453的酵母菌菌株(Saccharomycesboulardii )GB15接種在含有I %酵母膏、2%蛋白胨、2%葡萄糖、絡(納米絡)濃度為80ppm、PH4.5-6.0的固體培養基上，在32°C培養32h。
[0085]—級搖瓶種子的培養:將大麥芽粉與水混合、保溫糖化、過濾澄清后加水將濃度調節至10° Bx，納米鉻60mg，將此培養基定容到1200ml，調節pH5.0-6.0，用6個1000ml的三角瓶各裝培養基200ml，115°C滅菌30min。冷卻32°C時接入新鮮斜面菌種，于32°C、200r/min下振蕩培養20h。
[0086]補料培養基的配置:取經過稀釋、調酸、煮沸、加堿中和和過濾處理的糖蜜與淀粉酶解產生的葡萄糖液混合，使糖蜜中的還原糖占總還原糖的50 %，加水或濃縮控制總還原糖的濃度為600g/L，121°C滅菌15min，冷卻32°C備用。
[0087]補鉻培養基的配置:將納米鉻配成15g//L的水溶液，121°C滅菌15min，冷卻32°C備用。
[0088]在100L發酵罐上發酵:葡萄糖6000g，糖蜜40g，玉米漿80g，85%H3P0440g,MgSO4.7H2044g置于10L全自動發酵罐中，調節pH5.0-6.0，定容35L，實罐滅菌，121°C滅菌20min，冷卻32°C時接入6個一級搖瓶種子開始發酵，發酵初始體積約為40L。發酵開始后，當有乙醇生成，溶解氧上升的時候開始補加總還原糖濃度為600g/L的混合糖液，并以維持乙醇的量不上升、溶解氧不上升來控制流加的營養物質，當溶解氧低至25%時，控制營養物質流加量，維持溶氧不上升。整個鉻液在發酵開始以后以對數關系遞增的速度流加，流加速度與酵母的生長速度一致，在對數生長期結束時完成流加，發酵液最終納米鉻濃度為400mg/L。采用流加氨水的方式補充氮源并控制發酵pH為5.0-6.0，控制攪拌轉速為300r/min，根據泡沫情況添加消泡劑控制泡沫。發酵38h時停止補料、補鉻，發酵40h時結束，此時酵母產量為240g/Lo
[0089]發酵結束后，將含有酵母的發酵液8000r/min離心20min收集菌體，洗滌菌體，先用質量比為2:1的由溶菌酶和木瓜蛋白酶組成的復合酶在現在25°C酶解2小時，然后升溫至40°C酶解I小時。然后再用高壓均質機在55Mpa壓力下勻漿兩次對酵母進行破壁，將破壁后的酵母經冷凍干燥(真空度為10Pa，溫度為O至-50°C)2小時即獲得酵母鉻。該酵母鉻產品中有機鉻的含量達6700mg/Kg。
[0090]實施例2、在1m3發酵罐上發酵(方法一)
[0091 ]斜面菌種培養:同實施例1
[0092]—級搖瓶種子的培養:將大麥芽粉與水混合、保溫糖化、過濾澄清后加水將濃度調節至10° Bx，納米鉻120mg，將此培養基定容到2400ml，調節pH5.0-6.0，用12個100ml的三角瓶各裝培養基2001111，115°(:滅菌301^11。冷卻32°(:時接入新鮮斜面菌種，于32°(:、20(^/1^11下振蕩培養20h。
[0093]二級種子培養:在Im3種子罐上培養，葡萄糖12kg，糖蜜3kg，玉米漿10kg，尿素2kg，kH2P040.6kg,MgSO4.7H200.3kg，納米鉻20g，調節pH5.0-6.0，定容400L，實罐滅菌，121°C滅菌20min，冷卻32°C時接入2400ml—級搖瓶種子，轉速控制為200r/min，溫度控制為32°C，培養 15h0
[0094]補料培養基的配置:取經過稀釋、調酸、煮沸、加堿中和和過濾處理的糖蜜與淀粉酶解產生的葡萄糖液混合，使糖蜜中的還原糖占總還原糖的40 %，加水或濃縮控制總還原糖的濃度為700g/L，121°C滅菌15min，冷卻32°C備用。
[0095]補鉻培養基的配置:將納米鉻配成200g/L的水溶液，121°C滅菌15min，冷卻32°C備用。
[0096]在1m3發酵罐上發酵:葡萄糖600kg，糖蜜4kg，玉米漿1kg，kH2P047kg，MgSO4.7H207kg，納米絡300g，消泡劑0.3kg，調節pH5.0-6.0，定容6m3，實罐滅菌，121°C滅菌30min，冷卻32°C時接入二級種子液開始發酵。發酵開始后，當有乙醇生成，溶解氧上升的時候開始補加總還原糖濃度為700g/L的混合糖液，并以維持乙醇的量不上升、溶解氧不上升來控制流加的營養物質，當溶解氧低至30 %時，控制營養物質流加量，維持溶氧不上升。在發酵8h時補加鉻液，整個補鉻在6h內完成，發酵液最終納米鉻濃度為450mg/L。采用流加氨水的方式補充氮源并控制發酵pH為5.0-6.0，控制攪拌轉速為300r/min，根據泡沫情況再添加消泡劑控制泡沫。發酵36h時停止補料、補鉻，發酵40h時結束，此時酵母產量為280g/L。
[0097]發酵結束后，將含有酵母的發酵液8000r/min離心力7000g離心20min收集菌體，洗滌菌體，先用質量比為1:4:4的由葡聚糖酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶組成的復合酶先在40°C酶解2小時，然后升溫至50 °C酶解I小時，然后再用高壓均質機在50Mpa壓力下勻漿兩次對酵母進行破壁，將破壁后的酵母經冷凍干燥(真空度為10Pa，溫度為O至-50°C)4小時即獲得酵母鉻。該酵母鉻產品中有機鉻的含量達7000mg/kg。
[0098]實施例3、在25m3發酵罐上發酵(方法一)
[0099]斜面菌種培養:同實施例1
[0?00] —級搖瓶種子的培養:方法同實施例2，制備2400ml—級搖瓶種子備用。
[0101 ] 二級種子培養:在2m3種子罐上培養，葡萄糖37kg，糖蜜1kg，玉米漿20kg，尿素4kg，kH2P0U.2kg, MgSO4.7H200.6kg，消泡劑 0.lkg,納米鉻 50g，調節 pH5.0-6.0，定容 800L，實罐滅菌，121°C滅菌20min，冷卻32 V時接入2400ml—級搖瓶種子，轉速控制為250r/min，溫度控制為32°C，培養15h。
[0102]補料培養基的配置:取經過稀釋、調酸、煮沸、加堿中和和過濾處理的糖蜜與淀粉酶解產生的葡萄糖液混合，使糖蜜中的還原糖占總還原糖的30 %，加水或濃縮控制總還原糖的濃度為800g/L，121°C滅菌15min，冷卻32°C備用。
[0103]補鉻培養基的配置:將納米鉻配成250g/L的水溶液，121°C滅菌15min，冷卻32°C備用。
[0104]在25m3發酵罐上發酵:葡萄糖22200kg，糖蜜14kg，玉米漿28kg，kH2P04l5kg，MgSO4.7H2015kg，納米鉻500g，消泡劑0.6kg，調節pH5.0-6.0，定容 12m3，實罐滅菌，121°C滅菌30min，冷卻32°C時接入二級種子液開始發酵。發酵開始后，當有乙醇生成，溶解氧上升的時候開始補加總還原糖濃度為800g/L的混合糖液，并以維持乙醇的量不上升、溶解氧不上升來控制流加的營養物質，當溶解氧低至20%時，控制營養物質流加量，維持溶氧不上升。在發酵1h時補加鉻液，整個補鉻在7h內完成，發酵液最終納米鉻濃度為500mg/L。采用流加氨水的方式補充氮源并控制發酵pH為5.0-6.0，控制攪拌轉速為350r/min，根據泡沫情況再添加消泡劑控制泡沫。發酵35h時停止補料、補鉻，發酵38h時結束，此時酵母產量為320g/L。
[0105]發酵結束后，將含有酵母的發酵液8000r/min離心20min收集菌體，洗滌菌體，先用質量比為1:8:4:4的由葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶組成的復合酶先在25°C酶解I小時，然后在40°C酶解2.5小時，然后升溫至50°C酶解0.5小時，然后再用高壓均質機在60Mpa壓力下勻漿兩次對酵母進行破壁，將破壁后的酵母經冷凍干燥(真空度為1Paj^度為O至-50 0C) 2小時即獲得酵母鉻。該酵母鉻產品中有機鉻的含量達7400mg/kg。
【主權項】
1.一種酵母菌菌株(Saccharomycesboulardii)GB15，其保藏編號為CGMCC N0.11453。2.由權利要求1所述酵母菌菌株GB15發酵培養而得的酵母鉻產品。3.根據權利要求2所述的酵母鉻產品，其特征在于:所述酵母鉻產品中，每kg酵母鉻產品中含酵母鉻5000-8000mg。4.一種制備權利要求2或3所述酵母鉻產品的方法，包括如下步驟: 1)將權利要求1所述酵母菌菌株GB15活化后于一級種子培養基中進行發酵培養，發酵完畢得到一級種子液； 所述一級種子培養基由絡液a和下述兩種培養基中的任意一種組成:麥芽汁培養基或Yro培養基； 其中，所述鉻液a為濃度為50-80mg/L的納米鉻的水溶液； 2)將步驟I)所得一級種子液加入到二級種子培養基中進行發酵培養，得到二級種子液； 所述二級種子培養基由鉻液b、碳源、氮源和無機鹽組成； 其中，所述鉻液b為濃度為50-80mg/L的納米鉻的水溶液； 3)將步驟2)所得二級種子液加入到由鉻液C、碳源、氮源和無機鹽組成三級培養基中進行發酵培養，發酵開始后，當有乙醇生成，溶解氧上升的時候開始補加補料培養基，并以維持乙醇的量不上升、溶解氧不上升控制流加的營養物質，當溶解氧低至15%_35%時，控制營養物質流加量，維持溶氧不上升，在發酵8_12h時補加所述鉻液C，發酵完畢后，將所得發酵液離心，收集酵母菌體，破壁，干燥得到所述酵母鉻產品； 所述鉻液c為濃度為50-250g/L的納米鉻的水溶液； 所述補料培養基由糖蜜和淀粉酶解產生的葡萄糖液組成，且所述糖蜜中的還原糖含量占總還原糖含量的20-60%，總還原糖的濃度為500-800g/L; 所述鉻液c的補加量為使發酵體系中納米鉻的終濃度為100-500mg/L。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述步驟I)-步驟3)所述鉻液a至鉻液c中，納米絡的粒徑均為40-7 Onm ； 所述步驟I)發酵培養步驟中，培養溫度為32-36°C ;培養方式為振蕩培養;培養時間為16-20h;pH{tS5.0-6.0; 所述步驟2)發酵培養步驟中，培養溫度為32-36°C;培養時間為10-15h;pH值為5.0-6.0；轉速為 200-350r/min ； 所述步驟3)發酵培養步驟中，培養溫度為32-36 °C，pH值為5.0-6.0; 所述補加鉻液步驟中，補加時間在5_7h內完成； 所述離心步驟中，轉速為8000-8500r/min，離心力為7000_8000g； 所述破壁的方法包括如下步驟: 先用復合酶解所述酵母菌體的細胞壁，再進行高壓勻漿； 所述復合酶具體為由葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶中的至少兩種組成； 所述復合酶的用量為每kg酵母菌體用0.1-0.5g所述復合酶； 所述復合酶具體為由質量比為1:4:4的葡聚糖酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶組成的復合酶或由質量比為1:8:4:4的葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶組成的復合酶；所述葡聚糖酶的酶活為30000u/g; 所述溶菌酶的酶活為500000u/g; 所述木瓜蛋白酶的酶活為100000u/g; 所述堿性蛋白酶的酶活為200000u/g; 所述高壓勻漿步驟中，壓力為40-80Mpa; 所述干燥步驟中，干燥的方法為冷凍干燥，溫度具體為O—-50°C，真空度為lOPa，時間為2-4小時。6.—種制備權利要求2或3所述酵母鉻產品的方法，包括如下步驟: 1)將權利要求1所述酵母菌菌株GB15活化后于一級種子培養基中進行發酵培養，發酵完畢得到一級種子液； 所述一級種子培養基由絡液a和下述兩種培養基中的任意一種組成:麥芽汁培養基或Yro培養基； 其中，所述鉻液a為濃度為50-80mg/L的納米鉻的水溶液； 2)將步驟I)所得一級種子液加入到由碳源、氮源和無機鹽組成的三級培養基中進行發酵培養，發酵開始后，當有乙醇生成，溶解氧上升的時候開始補加補料培養基，并以維持乙醇的量不上升、溶解氧不上升來控制流加的營養物質，當溶解氧低至15%-35 %時，控制營養物質流加量，維持溶氧不上升;在所述發酵培養的同時將鉻液d以對數關系遞增的速度流加，流加的速度與酵母的生長速度相同，在對數生長期結束時停止流加，將所得發酵液離心，收集酵母菌體，破壁，干燥得到所述酵母鉻產品； 所述鉻液d為濃度為10-20g/L的納米鉻的水溶液； 所述補料培養基由糖蜜和淀粉酶解產生的葡萄糖液組成，且所述糖蜜中的還原糖含量占總還原糖含量的20-60%，總還原糖的濃度為500-800g/L; 所述鉻液d的補加量為使發酵體系中納米鉻的終濃度為100-500mg/L。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述步驟I)-步驟2)所述鉻液a和鉻液d中，納米絡的粒徑均為40-7 Onm ； 所述步驟I)發酵培養步驟中，培養溫度為32-36°C ;培養方式為振蕩培養;培養時間為16-20h;pH{tS5.0-6.0; 所述步驟2)發酵培養步驟中，培養溫度為32-36°C，pH值為5.0-6.0；轉速為200_350r/min； 所述離心步驟中，轉速為8000-8500r/min，離心力為7000_8000g； 所述破壁的方法包括如下步驟: 先用復合酶解所述酵母菌體的細胞壁，再進行高壓勻漿； 所述復合酶具體為由葡聚糖酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶中的至少兩種組成； 所述復合酶的用量為每kg酵母菌體用0.1-0.5g所述復合酶； 所述復合酶具體為由質量比為2:1的溶菌酶和木瓜蛋白酶組成的復合酶； 所述葡聚糖酶的酶活為30000u/g; 所述溶菌酶的酶活為500000u/g; 所述木瓜蛋白酶的酶活為100000u/g; 所述堿性蛋白酶的酶活為200000u/g; 所述酶解步驟中，酶解的溫度為20-500C，時間為1-4小時； 所述高壓勻漿步驟中，壓力為40-80Mpa;勻漿的次數為1-5次； 所述干燥步驟中，干燥的方法為冷凍干燥，溫度具體為O至-50°C，真空度為lOPa，時間為2-4小時。
【文檔編號】C12N1/18GK105861347SQ201610349440
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】薛新升, 余奎, 譙仕彥, 張海燕
【申請人】北京龍科方舟生物工程技術有限公司