一種利用黃綠木霉發酵制備煙用酸角香料的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用黃綠木霉發酵制備煙用酸角香料的方法。所述菌株為黃綠木霉(Trichoderma aureoviride)HLMM?04 CGMCC No.10839，具有產纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。將菌株通過活化、發酵、過濾、透析制得纖維素酶粗酶液，用于發酵酸角，再經提取、過濾、減壓濃縮制成煙用香料。HLMM?04菌株的最適產酶條件為培養基初始pH為6.5，培養溫度為28℃，培養時間為5d。加香結果表明，所制備的香料具有增加煙香豐富性，生津，舒適口腔，改善余味，使卷煙香氣醇和的作用。CGMCC No. 1083920150522
【專利說明】
一種利用黃綠木霉發酵制備煙用酸角香料的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于微生物發酵及其應用領域，具體涉及一株黃綠木霉新菌株。同時，本發 明還涉及利用該菌株制備煙用酸角香料的方法。
【背景技術】
[0002] 加香加料是卷煙工藝中的關鍵環節，是有效提升卷煙抽吸品質，形成卷煙特有風 格的有效手段之一。目前我國煙草中添加的煙用香料大多是采用傳統方法萃取再加以調配 所得，雖然生產操作簡單，但也存在香氣單調、改善卷煙抽吸效果不明顯等缺點。利用微生 物對香原料進行發酵可以增加傳統提取香料中多種香氣物質的含量，提升香氣豐富性，進 而生產出香氣豐富、高品質的卷煙，滿足消費者對卷煙品質的要求。
[0003] 酸角(Tamarindus indica)又稱酸豆、羅望子等。蘇木科酸角屬。根據《本草綱目》 記載，酸角具有止渴消熱、消食，養肝明目等功能。常用于治療中暑、消化不良、食積、腹痛、 慢性胃炎、便秘、高血壓及缺鐵性心臟病。生津止渴、消熱解暑，清涼爽口，回味無窮。
[0004] 木霉菌(Trichoderma spp.)廣泛分布于自然界，在腐木、種籽、植物殘體、有機肥、 土壤和空氣中尤多。木霉菌生長營養要求簡單，生長速度快，對于工業化生產十分有利。黃 綠木霉(Trichoderma aureoviride)為木霉屬的一種，作為一種重要的生防因子，對植物病 原的拮抗作用具有廣譜性、多制性，還能產生多種酶類分解土壤中的動植物殘體，增加土壤 肥力。已有對黃綠木霉的報道多集中在土壤改良、生物防治及生物肥料等方面。現有技術中 尚未見將黃綠木霉用于酸角發酵制備煙用香料的報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一株黃綠木霉新菌株，該菌株具有 產纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。
[0006] 本發明的目的還在于提供一種利用該菌株發酵酸角制備煙用香料的方法。
[0007] 本發明的目的通過以下技術方案予以實現。
[0008] 除非另有說明，本發明所采用的百分數均為質量百分數。
[0009] -種黃綠木霉（Trichoderma aureoviride)HLMM_04菌株，CGMCC No. 10839,其具 有產纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。
[0010] 利用所述菌株制備煙用香料的方法，包括以下步驟：
[0011] (1)將黃綠木霉!〇^-040610：如.10839菌株活化兩次后，接種于裝有20011^^^ 液體培養基的三角瓶中，在20~35 °C，180rpm下發酵培養1~7d;所述的PDA液體培養基：馬 鈴薯200g，葡萄糖20g，補蒸餾水至lL，pH5.5~8.5,115°C高壓滅菌15min;
[0012] (2)發酵液過濾去除菌體，取上清液緩慢加入硫酸氨至80%飽和度，4°C下靜置過 夜，離心收集沉淀物并溶于2mL緩沖液中，再用緩沖液進行透析，得到粗酶液;所述的緩沖液 為：0.02mol/L Na2HP〇4_NaH2P〇4，pH 7.3;
[0013] (3)將酸角去污洗凈，破碎后加入兩倍重量的水，混合均勻，調pH至6.0;加入黃綠 木霉HLMM-04粗酶液，發酵，粗酶液添加量為酸角質量的5%~20%，發酵溫度為30°C，發酵 時間2~5h;回流提取3h，過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得所需煙用香料。
[0014] 進一步的，為防止香料變質，按煙用香料重量的5%添加丙二醇。
[0015] 步驟(1)中最適宜的產香條件為初始pH 6.5,培養溫度28°C，培養時間5d。
[0016] 相對于現有技術，本發明具有以下優點：
[0017] (1)本發明首次將黃綠木霉應用于煙用香料制備領域。采用黃綠木霉HLMM-04菌株 發酵液處理酸角，與未處理對照相比，在原有酸角特征香氣保持的同時，具有增加煙香豐富 性，生津，舒適口腔，改善余味，使卷煙香氣醇和的作用。
[0018] (2)本發明成本低廉，操作簡單，便于實現大規模工業化生產，應用前景良好。
[0019] 保藏生物材料的說明
[0020] 本發明的菌株，已于2015年5月22日，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(CGMCG);該中心地址：中國北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生 物研究所。該菌株分類命名為黃綠木霉（Trichoderma aureoViride)HLMM_04，保藏號為 CGMCC No.10839。
【具體實施方式】
[0021] 下面通過實施例對本發明做進一步的詳細說明，但實施例并不是對本發明技術方 案的限定。
[0022] 實施例1
[0023] 1、黃綠木霉HLMM-04菌株的適宜產酶條件
[0024] 1.1培養基初始pH對HLMM-04菌株產酶的影響
[0025]將液體培養基的口!1分別調到5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，在28°(：、120印111下振 蕩培養3天后，測定纖維素酶活，表明最適宜的初始pH為6.5。
[0026] 1.2培養溫度對HLMM-04菌株產酶的影響
[0027] 將接種后的液體發酵培養基分別置于20°C、25°C、28°C、32°C、35°C下，120r/min振 蕩培養3d后，測定纖維素酶活，表明最適宜的培養溫度為28°C。
[0028] 1.3培養時間對HLMM-04菌株產酶的影響
[0029]將接種好的液體培養基(？!16.5)置于恒溫恒濕箱中，28°(：，12(^/1^11振蕩培養，每 24h測定一次纖維素酶活，培養到第5天時纖維素酶活達到最大值。
[0030] 2、黃綠木霉HLMM-04粗酶液制備方法
[0031] 根據以上優化結果，將黃綠木霉HLMM-04菌株活化兩次后，接種于裝有200mL PDA 液體培養基(pH 6.5)的三角瓶中，在28°C，180rpm下發酵培養5d。過濾去除菌體。取上清液 緩慢加入硫酸氨至80 %飽和度，4 °C下靜置過夜，離心收集沉淀物并溶于2mL緩沖液 (0.02111〇1/1似2冊〇4-他!^〇4的緩沖液4117.3)中，用同樣的緩沖液進行透析，得到粗酶 液。
[0032] 3、黃綠木霉HLMM-04菌株發酵制備煙用香料的方法
[0033]將酸角去污洗凈，破碎后加入兩倍重量的水，混合均勻，調pH至6.0。加入黃綠木霉 HLMM-04粗酶液，發酵。粗酶液添加量為酸角質量的15 %，發酵溫度為30°C，發酵時間3h。回 流提取3h，過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得酸角發酵煙用香料。
[0034]為防止變質，按發酵香料重量的5 %添加丙二醇。
[0035] 4、產品特征及理化性質
[0036]所得發酵煙用香料為紅棕色流狀膏體，不澄清。產品理化性質見表1。
[0037] 表1黃綠木霉HLMM-04發酵酸角香料的理化指標
[0039] 5、卷煙加香實驗
[0040]取酸角發酵煙用香料0.1 g，取無菌水稀釋50倍后，均勻噴灑在50g未加香葉組中， 裝入干凈的密封袋內，于室溫下放置2h后，將煙絲于120°C烘箱中烘干，使水分含量達到 11 %-13%。將處理后的煙絲及對照放入恒溫恒濕箱中，在溫度22°C、濕度60%條件下平衡 24h，手工卷制成卷煙，由評吸專家組成的評吸小組進行感官評吸。以未發酵酸角提取香料 及枯草芽孢桿菌發酵酸角香料為對照。加香結果表明，酸角黃綠木霉HLMM-04發酵香料與對 照區別明顯，具有增加煙香豐富性，生津，舒適口腔，改善余味，使卷煙香氣醇和的作用。評 價結果見表2。
[0041 ]表2酸角發酵香料評吸結果
[0043] 實施例2
[0044] 重復實施例1，有以下不同點:粗酶液添加量為酸角質量的5%，發酵時間2h。
[0045] 1、產品特征及理化性質
[0046] 所得發酵煙用香料為紅棕色流狀膏體，不澄清。產品理化性質見表3。
[0047] 表3黃綠木霉HLMM-04發酵酸角香料的理化指標
[0049] 2、卷煙加香實驗
[0050] 加香結果表明，酸角黃綠木霉HLMM-04發酵香料與對照區別明顯，具有增加煙香豐 富性，生津，減少刺激的作用。評價結果見表4。
[0051] 表4酸角發酵香料評吸結果
[0053] 實施例3
[0054]重復實施例1，有以下不同點:粗酶液添加量為酸角質量的20%，發酵時間5h。 [0055] 1、產品特征及理化性質
[0056]所得發酵煙用香料為紅棕色流狀膏體，不澄清。產品理化性質見表5。
[0057] 表5黃綠木霉HLMM-04發酵酸角香料的理化指標
[0059] 2、卷煙加香實驗
[0060] 加香結果表明，酸角黃綠木霉HLMM-04發酵香料與對照區別明顯，具有增加酸香、 生津、改善口腔舒適性的作用。評價結果見表6。
[0061 ]表6酸角發酵香料評吸結果
【主權項】
1. 一種黃綠木霉（Trichoderma aureoviride)HLMM_04菌株，CGMCC No. 10839,其具有 產纖維素酶，進而促進纖維素分解成寡糖或單糖的能力。2. 利用權利要求1所述菌株制備煙用香料的方法，包括以下步驟： (1) 將黃綠木霉見]\^-04061〇：如.10839菌株活化兩次后，接種于裝有2001^?0纟液體 培養基的三角瓶中，在20~35°C，180rpm下發酵培養1~7d;所述的PDA液體培養基：馬鈴薯 200g，葡萄糖20g，補蒸餾水至lL，pH5.5~8.5,115°C高壓滅菌15min; (2) 發酵液過濾去除菌體，取上清液緩慢加入硫酸氨至80%飽和度，4°C下靜置過夜，離 心收集沉淀物并溶于2mL緩沖液中，再用緩沖液進行透析，得到粗酶液;所述的緩沖液為： 0.02mol/L Na2HP〇4-NaH2P〇4,pH 7.3； (3) 將酸角去污洗凈，破碎后加入兩倍重量的水，混合均勻，調pH至6.0 ;加入黃綠木霉 HLMM-04粗酶液，發酵，粗酶液添加量為酸角質量的5%~20%，發酵溫度為30°C，發酵時間2 ~5h;回流提取3h，過濾除渣，將上清液減壓濃縮，即得所需煙用香料。3. 根據權利要求2所述的制備煙用香料的方法，其特征在于：為防止香料變質，按煙用 香料重量的5 %添加丙二醇。4. 根據權利要求2所述的制備煙用香料的方法，其特征在于：步驟（1)中最適宜的發酵 培養條件為初始pH 6.5，培養溫度28 °C，培養時間5d。
【文檔編號】C12P1/02GK105861319SQ201610240447
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月18日
【發明人】者為, 段焰青, 焦俊, 夏建軍, 陳興, 王文元, 汪顯國
【申請人】云南中煙工業有限責任公司