一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器及制備、檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，該生物傳感器基于氧化石墨烯(GO)的非共價偶聯核酸分子和強大的熒光猝滅的特性，通過在氧化石墨烯的表面上非共價鍵偶聯羧基熒光素(FAM)標記的核酸探針(FAM?P)而構建，簡稱為FAM?P/GO生物傳感器。本發明提供的FAM?P/GO生物傳感器在加入靶標后，靶標序列通過競爭與探針序列通過互補配對形成雙鏈，使得探針從氧化石墨烯表面解離下來，體系熒光恢復；靶標序列濃度越大，熒光值越強。本發明還提供FAM?P/GO生物傳感器的制備及使用方法，FAM?P/GO生物傳感器操作簡單、檢測精確、靈敏度高、特異性好，且能夠定量檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的濃度。
【專利說明】
一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器及制備、檢測方法
技術領域
[0001]本發明涉及生物傳感器技術領域，更為具體地說，涉及一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器及制備、檢測方法。
【背景技術】
[0002]鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)是一種常見的人畜共患病原菌，其致病機制與菌體的毒力島基因表達分泌的毒素和毒力蛋白有關。鼠傷寒沙門氏菌的毒力島基因為SSeC基因，SSeC基因位于毒力島-2(SP1-2)上，且序列十分保守，SSeC基因編碼表達的毒素蛋白能夠引起機體發生器官功能障礙等癥狀，因此SSeC基因可以作為檢測鼠傷寒沙門氏菌的一個重要標記物。
[0003]目前，鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法有傳統的微生物培養檢測法、生化鑒定法，以分子生物學為基礎的快速檢測方法以及以免疫學為基礎的檢測技術，其中，以分子生物學為基礎的快速檢測方法包括聚合酶鏈式反應(PCR)、基因芯片技術等，以免疫學為基礎的檢測技術包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、同位素標記抗體、免疫熒光法、免疫磁性分離技術、自動酶標免疫檢測儀等，上述檢測方法包含了微生物培養、核酸分析、抗原-抗體反應等技術。但是，微生物培養檢測法、生化鑒定法等傳統檢測方法存在耗時長、靈敏度低、檢測準確度低等的缺點;ELISA和PCR等方法雖然檢測速度快，但存在操作繁瑣、易被污染、對設備要求高等的缺點，而且檢測的特異性也不是很理想，無法滿足現代臨床和食品的快速檢測的要求。
[0004]為應對上述缺點，近年來，檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法出現了生物傳感器檢測法。納米生物傳感器由具有生物活性的識別原件和信號轉換器組成，生物活性物質通常包括酶、抗原-抗體、適配體等。由于納米生物傳感器具有高度自動化、微型化、能在復雜的體系中進行實時監測等的功能，因而在制藥、食品、化工、生物醫學、臨床檢驗等方面帶來了巨大的經濟效益和廣泛的應用前景。然而大多數的納米生物傳感器由于存在靈敏度低、特異性差、檢測范圍窄的缺點，限制了納米生物傳感器的大范圍使用。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器及制備、檢測方法，利用納米氧化石墨烯對單鏈DNA的吸附及熒光猝滅性構建熒光探針，進而實現對含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測，且靈敏度高、特異性好、檢測范圍寬。
[0006]為了解決上述技術問題，本發明提供如下技術方案:
[0007]—種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，所述生物傳感器包括氧化石墨烯和熒光標記的核酸探針，其中，所述氧化石墨烯為載體，所述氧化石墨烯和所述熒光標記的核酸探針通過非共價鍵偶聯，所述熒光標記的核酸探針的基因序列為所述SSeC基因序列的互補鏈序列。
[0008]優選地，所述熒光標記的核酸探針的基因序列為6-FAM-GCCTCCTCTGCCATCTCATTCG。
[0009]優選地，所述熒光標記的核酸探針的濃度為50nM，所述氧化石墨烯的濃度為0.02-0.09mg/mLo
[00?0]優選地，所述氧化石墨稀的濃度為0.05mg/mL。
[0011]優選地，所述非共價鍵為JT-JT共價鍵。
[0012]—種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的制備方法，所述制備方法包括:
[0013]配制濃度為lmg/ml的氧化石墨烯溶液；
[0014]將熒光標記的核酸探針在溫度為95°C的條件下變性處理5min;
[0015]將所述氧化石墨烯溶液加入到變性處理后的所述熒光標記的核酸探針中，攪拌均勻，靜置15min，形成檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器。
[0016]優選地，所述配制濃度為lmg/ml的氧化石墨烯溶液包括:
[0017]稱取0.1g氧化石墨烯放置于10ml超純水中，并置于冰浴中超聲分散120min得到所述氧化石墨烯溶液。
[0018]優選地，所述攪拌均勻，靜置包括:所述氧化石墨烯溶液加入所述變性處理后的熒光標記的核酸探針后，使用磷酸鹽緩沖液稀釋，并使兩者充分混合，在溫度為37°C條件下靜置15min。
[0019]—種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的使用方法，所述使用方法包括:
[0020]構建熒光值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的標準曲線；
[0021]將待檢測樣品的DNA加入到生物傳感器中形成混合液，將所述混合液在37°C的溫度下孵育30min;
[0022]孵育結束后檢測所述混合液的熒光值，并根據所述標準曲線得到所述檢測樣品中鼠傷寒沙門氏菌的濃度。
[0023]優選地，所述構建熒光值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的標準曲線包括:
[0024]選取氧化石墨烯和核酸探針相匹配最優的濃度，制備生物傳感器；
[0025]制備不同濃度梯度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌溶液；
[0026]將所述不同濃度梯度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌溶液分別加入到所述生物傳感器中，并形成檢測體系；
[0027]將所述檢測體系在37°C的溫度下孵育30min，并分別檢測所述生物傳感器和所述檢測體系的熒光值；
[0028]根據所檢測到的熒光值以及所述不同濃度梯度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌溶液的濃度繪制曲線，得到熒光值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的標準曲線。
[0029]本發明提供了一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，所述生物傳感器包括氧化石墨烯和熒光標記的核酸探針，其中，氧化石墨烯為載體，所述氧化石墨烯和所述核酸探針通過非共價鍵偶聯，所述核酸探針的基因序列為所述SSeC基因序列的互補鏈序列。本發明提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器通過以氧化石墨烯為載體，基于氧化石墨烯的非共價偶聯核酸分子和猝滅熒光的特性，在氧化石墨烯的表面上非共價鍵偶聯已熒光標記的核酸探針，制備檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器。本發明提供的生物傳感器處于非檢測狀態時，由于氧化石墨烯和熒光標記的核酸探針之間的距離很小，因此，生物傳感器中發生能量共振轉移，進而熒光猝滅；當生物傳感器處于檢測狀態時，即生物傳感器中加入待檢測樣品的單鏈DNA時，單鏈DNA會與熒光標記的核酸探針互補形成雙鏈DNA，由于形成雙鏈DNA時的結合力大于氧化石墨烯和熒光標記的核酸探針之間的非共價鍵力，因此，雙鏈DNA從氧化石墨烯的表面游離下來，進而恢復熒光，通過檢測熒光值就能夠得知待檢測樣品中含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的濃度。本發明提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器具有操作簡單、檢測精確、檢測下限低、靈敏度高、特異性好的特點，且能夠定量檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的濃度。
【附圖說明】
[0030]為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，對于本領域普通技術人員而言，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。
[0031]圖1是本發明實施例提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的制備流程圖；
[0032]圖2是本發明實施例提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的氧化石墨烯與熒光標記的核酸探針的濃度優化圖；
[0033]圖3是本發明實施例提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的使用方法流程圖；
[0034]圖4是本發明實施例提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器中靶標DNA與熒光值的標準曲線圖；
[0035]圖5是本發明實施例提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器特異性檢測圖；
[0036]圖6是本發明實施例提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器檢測待測樣品靈敏度的線性曲線圖；
[0037]圖7是本發明實施例提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器檢測待測樣品時特異性的圖譜。
【具體實施方式】
[0038]本發明實施例提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器及制備、檢測方法，利用納米氧化石墨烯對單鏈DNA的吸附及熒光猝滅性構建熒光探針，進而實現對含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的快速檢測。
[0039]為了使本技術領域的人員更好地理解本發明實施例中的技術方案，并使本發明實施例的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖對本發明實施例中的技術方案作進一步詳細的說明。
[0040]本發明提供了一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，所述生物傳感器包括氧化石墨稀(graphene oxide，G0)和焚光標記的核酸探針(FAM-P)，其中，氧化石墨稀為載體，氧化石墨烯和熒光標記的核酸探針通過非共價鍵偶聯，熒光標記的核酸探針的基因序列為所述SSeC基因序列的互補鏈序列。
[0041 ]具體的，本發明提供的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器簡稱為FAM-P/G0生物傳感器。GO為納米材料，FAM-P為羧基焚光素(carboxy-f luorescein，FAM)標記的核酸，FAM-P的基因序列為SSeC基因序列的互補鏈序列，其中，SSeC基因序列為5’-CGAATGAGATGGCAGAGGAGGC-3’，則其互補鏈序列即FAM-P的基因序列為6-FAM-GCCTCCTCTGCCATCTCATTCG;GO和FAM-P之間的非共價鍵結合為JT-JT共價鍵結合，FAM-P的濃度為50nM，G0的濃度為0.02-0.09mg/L。
[0042]本發明提供的FAM-P/G0生物傳感器的檢測原理為:基于GO的非共價偶聯核酸分子和猝滅熒光的特性，在GO的表面引入FAM-P。具體為:當FAM-P/G0生物傳感器處于非檢測狀態時，即沒有加入靶標DNA時，FAM-P呈自由卷曲狀態，由于GO和FAM-P之間的距離很小，因此，FAM-P/G0生物傳感器中發生能量共振轉移，進而熒光猝滅，檢測不到熒光值；當FAM-P/GO生物傳感器處于檢測狀態時，S卩FAM-P/G0生物傳感器中加入待檢測樣品的單鏈DNA(single —stranded DNA, ssDNA)時，即加入革El標DNA時，革El標DNA的ssDNA會與FAM-P互補形成雙鏈DNA(double_stranded DNA,dsDNA)，由于形成dsDNA時的結合力大于GO和FAM-P之間的非共價鍵力，因此，dsDNA能夠從GO的表面游離下來，進而恢復熒光，最后通過檢測熒光值就能夠得知待檢測樣品中含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的濃度，檢測精確，操作簡單。
[0043]基于上述原理，加入的靶標DNA越多，形成的雙鏈也就越多，熒光回復也就越強，進而能夠定量檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的濃度，同時，本發明提供的FAM-P/G0生物傳感器還具有檢測下限低、靈敏度高的特點。
[0044]本發明實施例還提供了FAM-P/G0生物傳感器的制備方法，具體請參考附圖1TAM-P/G0生物傳感器的制備方法包括:
[0045]SlOl:配制濃度為lmg/ml的GO溶液；
[0046]S102:將FAM-P在溫度為95 °C的條件下變性處理5min ；
[0047]S103:將GO溶液加入到FAM-P中，攪拌均勻，靜置15min，形成FAM-P生物傳感器。
[0048]其中，配制濃度為lmg/ml的GO溶液具體操作為:稱取0.1g GO放置于10ml超純水中，并置于冰浴中超聲分散120min，進而能夠得到GO溶液;攪拌均勻，靜置包括:所述GO溶液加入所述變性處理后的FAM-P后，使用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)稀釋，并使兩者充分混合，在溫度為37 °C條件下靜置15min。
[0049]本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器的制備方法簡單、易于操作、不會被污染，對設備的要求也不高，適用于大范圍的實驗室、單位或工廠的制備。在制備本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器時，鼠傷寒沙門氏菌的SSeC基因序列以及FAM-P基因序列均是外購的，且下述內容中所用的各種核酸序列及各種菌體均為外購的，本發明不對此進行限制。
[0050]由于熒光共振能量轉移受納米材料GO和FAM-P比例的影響很大，同時，為使本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器具有靈敏的檢測性能及檢測極低濃度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的性能，本發明實施例提供了FAM-P/G0生物傳感器供受比例優化的研究，具體研究內容為:
[0051 ] 設定FAM-P/G0生物傳感器體系中FAM-P溶液的濃度恒定為50nM，考察GO溶液濃度分別為0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL 時的熒光值。具體實施過程為:在一定體積的FAM-P溶液中分別加入超聲處理后的不同濃度的GO溶液形成混合液，上述混合液在溫度為95 °C的條件下變性處理5min，并用PBS稀釋至10ul形成復合溶液，該復合溶液充分混合并在37°C下靜置15min，檢測各熒光值。在進行熒光值檢測時，設置激發波長為480nm，發射波長517nm，測定復合溶液熒光值F和原始熒光值Fo，通過GO溶液濃度與熒光相對值F/Fo-l之間的關系得知FAM-P溶液的濃度為50nM時，與FAM-P相配合的GO溶液的最佳濃度，具體請參考附圖2。
[0052]附圖2示出了本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器體系中FAM-P與GO的濃度優化圖。從附圖2中能夠看出，隨著GO濃度的不斷增大，FAM-P/G0生物傳感器體系的熒光相對值F/Fo-l不斷升高，這表明隨著GO濃度的增大熒光值呈顯著下降的趨勢，當GO濃度達到0.05mg/mL及以上時，熒光相對值F/FQ-1幾乎不變且接近于1.0，而且超過95 %的FAM-P的熒光被GO猝滅，由此能夠表明FAM-P/G0生物傳感器體系中FAM-P已經完全結合到GO表面，溶液中不存在游離的FAM-P，背景值低，此時，FAM-P溶液的濃度為50nM，與FAM-P相配合的GO溶液的最佳濃度為0.05mg/mLo
[0053]本發明實施例還提供了FAM-P/G0生物傳感器的使用方法，具體請參考附圖3TAM-P/G0生物傳感器的使用方法包括:
[0054]S201:構建熒光值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的標準曲線；
[0055]S202:將待檢測樣品的ssDNA加入到FAM-P/G0生物傳感器中形成混合液，將所述混合液在37°C的溫度下孵育30min;
[0056]S203:孵育結束后檢測所述混合液的熒光值，并根據所述標準曲線得到所述檢測樣品中鼠傷寒沙門氏菌的濃度。
[0057]其中，步驟S201中構建熒光值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的標準曲線又包括:
[0058]S2011:選取GO和FAM-P相匹配最優的濃度，制備FAM-P/G0生物傳感器；
[0059]S2012:制備不同濃度梯度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌溶液；
[0060]S2013:將所述不同濃度梯度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌溶液分別加入到FAM-P/G0生物傳感器中，并形成檢測體系；
[0061]S2014:將所述檢測體系在37°C的溫度下孵育30min，并分別檢測所述生物傳感器和所述檢測體系的熒光值；
[0062]S2015:根據所檢測到的熒光值以及所述不同濃度梯度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌溶液的濃度繪制曲線，得到熒光值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的標準曲線。
[0063]構建熒光值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的標準曲線具體為:根據已經設定好的濃度為50nM的FAM-P溶液，以及與FAM-P相配合的最佳濃度為0.05mg/L的GO溶液配置效能優良的FAM-P/G0生物傳感器復合液體系，設置不同濃度梯度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌溶液，該SSeC基因為靶標DNA，且鼠傷寒沙門氏菌溶液的濃度設置為0.05ym/L、0.lym/L、0.2ym/L、
0.3ym/L、0.4ym/L、0.5ym/L、0.6ym/L、0.7ym/L、0.8ym/L、0.9ym/L、和1.0ym/L。將上述11個不同濃度的靶標DNA分別加入到FAM-P/GO生物傳感器復合液體系中，在溫度為37°C的條件下孵育30min，然后分別測量熒光值。在進行熒光值檢測時，設置激發波長為480nm，發射波長517nm，測定復合溶液熒光值F，以靶標DNA的濃度為橫坐標，熒光值為縱坐標利用軟件Origins.0繪制標準曲線，得到標準曲線的線性回歸方程，具體請參考附圖4。
[0064]附圖4示出了本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器中靶標DNA與熒光值的標準曲線圖。由附圖4中的曲線能夠得知，靶標DNA的濃度在0.05-1.Ομπι/L范圍內時，靶標DNA與熒光值呈現良好的線性關系，靶標DNA與熒光值的線性回歸方程為Y = 23.37X-174.915，線性相關系數為0.9921，由此能夠說明，在靶標DNA的濃度較低時，本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器仍然能夠檢測到靶標DNA，進而說明本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器具有較低的檢測下限。
[0065]本發明實施例還提供了檢測FAM-P/G0生物傳感器體系特異性的實驗研究，具體實驗內容為:配置三種濃度均為Ι.Ομπι/L的堿基錯配DNA，其中，誤配堿基數分別為1、4和5，其對應的誤配堿基序列為:CGAATGAGATGGCAGAGGAGIC、CGgAgGAGATGGgGAGGAGIC和CGGGCGAGATGGAAGAGGAGTC，帶有下劃線的堿基為誤配堿基;未加靶標DNA及完全互補的靶標序列DNA作為對照組，且對照組的濃度也為Ι.Ομπι/L，將上述三種堿基錯配的DNA及對照組DNA分別加入到相同體積的制備好的FAM-P/G0生物傳感器檢測體系中，并均在溫度為37°C下孵育30min，測量FAM-P/G0生物傳感器體系的熒光值，具體結果請參考附圖5。
[0066]附圖5示出了本發明實施例提供的檢測FAM-P/G0生物傳感器體系特異性的檢測圖，其中a為未加靶標DNA的檢測熒光值，b為5個誤配堿基數的錯配DNA的檢測熒光值，c為4個誤配堿基數的錯配DNA的檢測熒光值，d為I個誤配堿基數的錯配DNA的檢測熒光值，e為完全互補的靶標序列DNA的檢測熒光值。從附圖5中能夠看出，e的熒光值最高，這說明完全互補的靶標序列DNA能夠使FAM-P/G0生物傳感器體系的檢測熒光值顯著復原，由此說明，完全互補的靶標序列DNA與FAM-P互補配對結合后從GO的表面解離下來。而加入未加靶標DNA、誤配堿基數的錯配DNA后，FAM-P/G0生物傳感器體系的檢測熒光值極低，即使只有I個堿基存在差異，完全互補的靶標序列DNA的檢測熒光值為I個誤配堿基數的錯配DNA的檢測熒光值的4倍以上，這說明錯配堿基序列不能使FAM-P從GO脫落下來，由此說明，本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器具有很高的特異性和選擇性，能夠很好的區分靶標序列和誤配序列，進而能夠分辨同菌屬不同血清型的沙門氏菌，且在分別的過程中反應干擾少、速度快。
[0067]本發明實施例還提供了FAM-P/G0生物傳感器檢測待測樣品靈敏度的實驗研究，具體內容為:將鼠傷寒沙門氏菌在溫度為37°C的條件下培養24h，經平板計數后，制備濃度分別為 I O3CFlVmL、I O4CFlVmL、105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL 和 108CFU/mL 的菌體，將上述不同濃度的菌體放置于95 0C的水浴中15min，然后放置冰上1min以獲取相應的ssDNA，將所獲得的ssDNA分別加入配置好的FAM-P/G0生物傳感器體系中，在溫度為37°C的條件下孵育30min，最后分別檢測各體系的熒光值，并根據所測得的各體系的熒光值與菌體濃度的對數繪制線性曲線，線性曲線結果具體請參考附圖6。
[0068]附圖6示出了本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器檢測待測樣品靈敏度的線性曲線圖。從附圖6中能夠得知，隨著菌體濃度的不斷增大，熒光值顯著增大，且在上述濃度范圍內熒光值與菌體濃度的對數呈良好的線性關系，熒光值與菌體濃度的對數的線性方程為Y = 29.192X-45.239，線性相關系數為0.9987，由此能夠說明，FAM_P/G0生物傳感器體系能夠檢測到菌體的下限為I O3CFUAiL，進而說明本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器在檢測待檢樣品時具有很高的靈敏度，且能夠檢測到較低濃度的菌體。
[0069]進一步，本發明實施例還提供了FAM-P/G0生物傳感器檢測待測樣品特異性的實驗研究，具體研究內容為:將20種不同菌體的ssDNA，均配置成濃度為5 X 107CFU/ml的溶液，其中，20種不同菌體為1-鼠傷寒沙門氏菌;2-甲型副傷寒沙門氏菌;3-腸炎沙門菌;4-豬霍亂沙門氏菌;5-志賀氏菌;6-金黃色葡萄球菌;7-大腸桿菌K88; 8-變形桿菌;9-副溶血性弧菌；10-溶血性弧菌；11-李斯特菌；12-空腸彎曲菌；13-嗜熱鏈球菌；14-枯草桿菌；15-地衣芽孢桿菌；16-嗜熱雙歧桿菌；17-長雙歧桿菌；18-短雙歧桿菌19-嗜酸乳桿菌、20-干酪乳桿菌，上述菌體均可以采用外購菌體。設置不加菌體的ssDNA為空白組，即為21，將空白組與上述20種不同菌體的ssDNA分別加入配置好的FAM-P/G0生物傳感器體系中，在溫度為37°C的條件下孵育30min，然后分別測量熒光值，并以各菌體的排列為橫坐標、熒光值為縱坐標繪制特異性圖譜，具體結果請參考附圖7。
[0070]附圖7示出了本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器檢測待測樣品時特異性的圖譜。從附圖7中能夠得知，I號菌體的熒光值顯著增加且明顯高于其余20組菌體的熒光值，2-4號的其余種類的沙門氏菌由于其序列存在一定的同源性而產生部分熒光，但其熒光值遠遠低于I號菌體的熒光值，其他種類的菌體及空白組的熒光值更低，由此能夠說明，本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器在檢測待檢樣品時具有很好的特異性。
[0071 ]由上述檢測內容及描述能夠得知，本發明實施例提供的FAM-P/G0生物傳感器具有檢測下限低、靈敏度高、特異性好的特點，且能夠定量檢測含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌的濃度。
[0072]以上所述的本發明實施方式，并不構成對本發明保護范圍的限定。任何在本發明的精神和原則之內所作的修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器包括氧化石墨烯和熒光標記的核酸探針，其中，所述氧化石墨烯為載體，所述氧化石墨烯和所述熒光標記的核酸探針通過非共價鍵偶聯，所述熒光標記的核酸探針的基因序列為所述SSeC基因序列的互補鏈序列。2.根據權利要求1所述的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，其特征在于，所述熒光標記的核酸探針的基因序列為6-FAM-GCCTCCTCTG CCATCTCATTCG。3.根據權利要求1所述的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，其特征在于，所述熒光標記的核酸探針的濃度為50nM，所述氧化石墨烯的濃度為0.02-0.09mg/mL。4.根據權利要求3所述的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，其特征在于，所述氧化石墨稀的濃度為0.05mg/mLo5.根據權利要求1所述的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，其特征在于，所述非共價鍵為JT-Ji共價鍵。6.—種如權利要求1所述的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括: 配制濃度為lmg/ml的氧化石墨稀溶液； 將熒光標記的核酸探針在溫度為95°C的條件下變性處理5min; 將所述氧化石墨烯溶液加入到變性處理后的所述熒光標記的核酸探針加入到所述氧化石墨烯溶液中，攪拌均勻，靜置15min，形成檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器。7.根據權利要求6所述的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述配制濃度為lmg/ml的氧化石墨烯溶液包括: 稱取0.1g氧化石墨烯放置于10ml超純水中，并置于冰浴中超聲分散120min得到所述氧化石墨烯溶液。8.根據權利要求6所述的基于氧化石墨烯檢測含SSeC基因鼠傷寒氏菌鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述攪拌均勻，靜置包括: 所述氧化石墨烯溶液加入所述變性處理后的熒光標記的核酸探針后，使用磷酸鹽緩沖液稀釋，并使兩者充分混合，在溫度為37°C條件下靜置15min。9.一種如權利要求1或6所述的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括: 構建熒光值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的標準曲線； 將待檢測樣品的DNA加入到生物傳感器中形成混合液，將所述混合液在37°C的溫度下孵育30min; 孵育結束后檢測所述混合液的熒光值，并根據所述標準曲線得到所述檢測樣品中鼠傷寒沙門氏菌的濃度。10.根據權利要求9所述的檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的使用方法，其特征在于，所述構建熒光值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的標準曲線包括: 選取氧化石墨烯和熒光標記的核酸探針相匹配最優的濃度，制備生物傳感器； 制備不同濃度梯度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌溶液； 將所述不同濃度梯度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌溶液分別加入到所述生物傳感器中，并形成檢測體系； 將所述檢測體系在37°C的溫度下孵育30min，并分別檢測所述生物傳感器和所述檢測體系的熒光值； 根據所檢測到的熒光值以及所述不同濃度梯度的含SSeC基因鼠傷寒沙門氏菌溶液的濃度繪制曲線，得到熒光值與鼠傷寒沙門氏菌濃度的標準曲線。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861295SQ201610350181
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】賀氣志
【申請人】長沙醫學院