一種溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠的制備方法及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠的制備方法及其應用。經過如下五個步驟制成：一是線性聚甲基丙烯酸羥乙酯(Hydroxyethyl methacrylate,PHEMA)的合成；二是半互穿網絡水凝膠HEMA?co?DEAAm的制備；三是丙烯基修飾水凝膠；四是固定木瓜蛋白酶。通過本方法制得的溫敏性水凝膠含有相互貫穿的多孔結構，具有大的比表面積，對溫度變化能快速響應，是一種比較理想的固定化酶的載體。利用載體上的甲基丙烯酸甲酯雙鍵結構與酶分子上巰基的點擊反應進行酶的固定化。所以，其反應選擇性高，只固定含巰基的酶；反應條件溫和，反應溫度在37℃左右；反應得到的固定化酶活性是傳統方法戊二醛固定化酶的5.5倍，且穩定性較好，可回收重復利用。
【專利說明】
一種溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠的制備方法及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種新型溫敏半互穿網絡水凝膠的制備方法，尤其是一種溫敏型多孔 半互穿網絡水凝膠的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 酶的固定化（Immobilization of enzymes)是運用化學(共價鍵結合法、交聯法） 或物理（吸附法、包埋法）等方法，使水溶性的酶與非水溶性的載體相結合，制備既保持酶 活，又可重復利用酶的新型功能材料。固定化酶在保持酶本身所具有的高選擇性、高效率及 條件溫和特點的同時，還呈現許多的優點，如貯存穩定性高、分離回收容易、可多次重復使 用等。近年來，固定化酶在化學、醫藥、食品、環境工程以及工業生產等領域具有廣泛的應 用，成為目前的研究熱點。然而，固載酶載體材料的結構及性能直接影響固定化酶的性能。 因此，制備結構優異的載體材料至關重要。
[0003] 目前從文獻看來，固載酶載體材料有無機材料、高分子材料、生物質材料等。近期， 材料學的新成果逐漸應用在酶固載材料領域。其中，智能材料是前沿和熱點。智能固載酶材 料從類型上分，有pH響應型、溫度響應型、磁性響應型等，從材料形態上分，有凝膠固體、載 體樹脂等。其中，溫敏性水凝膠在固定化酶方面具有比較好的優勢。溫敏水凝膠的特點是其 結構中含有一定比例的親水基團和疏水基團，當外界溫度發生變化時，這些基團的親疏水 性以及氫鍵作用就會相應的發生變化。大多數的溫敏水凝膠的親水性會隨著溫度的增加而 增加，但是具有最低臨界溶解溫度（Lower critical solution temperature,LCST)的水凝 膠的親水性卻隨著溫度升高而降低，這種水凝膠處于低于LCST的溫度時，親水基團與水分 子通過氫鍵結合，增強凝膠在水中的溶解度;溫度升高時，疏水基團間的相互作用加強，氧 鍵變弱，凝膠收縮。溫敏水凝膠的LCST可以通過調節親疏水基團的比例來改變，通常，親水 基團含量越高，水凝膠的LCST越高，例如聚N，N-二乙基-2-丙烯酰胺(PDEAAM)、由聚環氧乙 烷(PEO)和聚環氧丙烷(PPO)組成的嵌段共聚物均具有溫度敏感性，LCST接近于人體溫度。 所以，可以通過控制反應溫度來控制酶催化反應的進行與否。同時，LCST大都接近室溫，反 應條件簡單容易控制。所以，開展該項工作很有意義。
[0004] 近年來，以當代高新技術為依據設計合成新型載體、開發新型固定化方法以及兩 者的有機結合是近年來許多學者所致力于的研究方向，開發的新型固定化方法必須遵循以 下原則:酶的固定化盡量較為溫和，以最大限度的降低或避免酶活性損失，而溫敏水凝膠作 為一種新的固定化酶的方式引起廣大研究者們的廣泛關注。Gotoh等分別以NIPAm和N，N-二 乙基丙稀酰胺(DEAAm)為單體，在溫度高于LCST的條件下利用自由基聚合法制備了溫敏性 的多孔PNIPAm和PDEAAm水凝膠。Zhang等以PEG為制孔劑制備了PNIPAm大孔溫敏型水凝膠， 通過改變PEG用量可以調節水凝膠的結構。Alves等以異丙基丙酰胺、海藻酸鈣制備了 pH/溫 度敏感的Semi-IPN水凝膠。Guo等以羧甲基殼聚糖和聚(N-異丙基丙烯酰胺）制備了Semi-IPN水凝膠聚合物，并研究了該聚合物的藥物釋放性能。Cheng等利用制孔劑制備了PNIPAm 大孔水凝膠，并進行牛血清蛋白控釋研究，藥物的控釋速率和控釋率更高。胡林等利用等離 子填孔接枝聚合技術將PNIPAm接枝到聚偏氟乙烯膜(PVDF)膜孔上，然后與交聯PNIPAm水凝 膠組合制成了一種溫度感應控制釋放膜系統，該系統具有良好的溫度響應性。Lee等利用 PNIPAm與幾種不同的離子單體聚合，以不同分子量的PEG為制孔劑制備了一系列水凝膠，研 究了咖啡因在水凝膠中的釋放機理。由給定的已知文獻可知，利用DEAAm與線性甲基丙烯酸 羥乙酯為原料制備多孔半互穿網絡水凝膠并用甲基丙烯酸甲酯雙鍵結構進行修飾的研究 尚無人完成，具有一定的創新性，研究工作具有重要意義。
[0005] 本發明基于DEAAm為原料與線性甲基丙烯酸羥乙酯制備多孔半互穿網絡水凝膠， 利用該新型基質材料和巰基反應固定巰基酶，具有極強的選擇性和極好的溫度響應性。從 固定木瓜蛋白酶所獲結果可知，固定化木瓜蛋白酶可重復利用，活性回收率6.5 %，溫度響 應范圍為35~39°C，熱穩定性85%，具有優異的性質。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠的制備方法， 以及用這種新型凝膠固定木瓜蛋白酶的應用。
[0007] 解決上述技術問題所采用的技術方案是:一種溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠的制 備方法，按如下步驟進行：
[0008] ( I )PHEMA的合成：將5mg的引發劑偶氮二異丁腈（2,2'-厶2〇1^8(2-methylpropionitrile)，AIBN)、2mL 的單體甲基丙稀酸輕乙酯（Hydroxyethyl methacrylate，HEMA)加到4mL的溶劑二甲基亞諷(Dimethyl sulfoxide ,DMS0)中，在氮氣環 境下60 °C水浴中回流8h，得到PHEMA淡黃色液體。用乙醚沉淀，過濾，烘干得到PHEMA粉末。
[0009] (2)網絡半互穿水凝膠的制備:將0.1 g的制孔劑聚乙二醇PEG20000、1.8mL的N，N-二乙基丙稀酰胺(N，N-diethyl-Acrylamide，DEAAm)、0.04g的交聯劑N，N-亞甲基雙丙稀酰 胺(Methylene-Bis-Acrylamide ,Bis)和0·075g的PHEMA粉末溶于6mL的DMSO中，在氣氣環境 下水浴回流6h，得到凝膠。
[0010] (3)丙烯酸酯修飾凝膠:將凝膠置于蒸餾水中浸泡14天，稱量Ig浸泡后的凝膠，溶 于IOmL的N,N-二甲基甲酰胺（N,N-Dimethylformamide，DMF)中，加入0 ·01~0 · 05g的甲醇 鈉，攪拌條件下滴加〇. I Ig的氨基乙醇，在150°C左右攪拌回流4h。反應結束后，冷卻至80°C， 加入0.005g的對苯二酚，滴加0.18g的甲基丙烯酸甲酯，水浴回流lh，得到透明凝膠狀固體。 反應結束后，用水洗滌固體數次，得到溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠。
[0011] 一種溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠的應用，所述應用為:將溫敏型多孔半互穿網 絡水凝膠用于固定含巰基的酶。
[0012] 本發明的有益效果是通過本方法制得的溫敏性水凝膠含有相互貫穿的多孔結構， 具有大的比表面積，對溫度變化能快速響應，是一種比較理想的固定化酶的載體。利用載體 上的甲基丙烯酸甲酯雙鍵結構與酶分子上巰基的點擊反應進行酶的固定化，具有反應選擇 性高，反應條件溫和，方法易于操作的優點，反應得到的固定化酶活性是傳統方法通過戊二 醛固定化酶的5.5倍，且其穩定性較好，可回收利用。
【附圖說明】
[0013] 附圖1為本發明的新型溫敏半互穿網絡水凝膠制備技術路線圖，圖中，①引發劑 AIBN②溶劑DMSO③交聯劑Bis④制孔劑PEG20000⑤DEAAm單體⑥CH3ONa⑦NH2C2H4OH⑧對苯 二酚⑨甲基丙烯酸甲酯
[0014]附圖2為本發明的新型溫敏半互穿網絡水凝膠紅外光譜圖。
[0015]附圖3為本發明的新型溫敏半互穿網絡水凝膠的13C核磁譜圖。
[0016]附圖4為本發明的新型溫敏半互穿網絡水凝膠的1H核磁譜圖。
[0017]附圖5為本發明的新型溫敏半互穿網絡水凝膠的電鏡掃描圖。
【具體實施方式】
[0018] 本發明下面結合實施例并參照附圖作進一步闡述：
[0019] 先購得如下原料：甲基丙烯酸羥乙酯（HEMA)、偶氮二異丁腈(AIBN)、二甲基亞砜 (DMSO)、聚乙二醇（roG20000)、N，N-二乙基丙烯酰胺（DEAAm)、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺 (Bis)、甲基丙烯酸甲酯、氨基乙醇、二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇鈉、對苯二酚。本實施例用g作 重量單位，mL為體積單位。
[0020] 實施例1
[0021 ] 1.多孔半互穿溫敏水凝膠的制備方法，其特征是按如下步驟進行：
[0022] (I)PHEMA的合成：將5mg的引發劑AIBN、2mL的單體HEMA加到4mL的溶劑DMSO中，通 氮氣，在60 °C中水浴回流8h。反應結束后，用乙醚沉淀，過濾，烘干的PHEMA粉末。合成反應原 理如下：
[0024] (2):多孔網絡半互穿水凝膠的制備：將O.lg的制孔劑PEG20000、1.8mL的DEAAm、 〇. 〇4g的交聯劑Bis和0.075g的PHEMA溶于6mL的DMSO中，通氮氣，水浴回流6h。反應結束后， 得到凝膠。合成反應原理如下：
[0026] (3)丙烯酸酯修飾凝膠:將凝膠置于蒸餾水中浸泡14天，稱取Ig浸泡后的凝膠，溶 于IOmL的DMF中，加入0.01~0.05g甲醇鈉，攪拌并滴加0.1 lg的氨基乙醇，在150°C左右攪拌 回流4h。反應結束后，冷卻至80 °C，加入0.005g對苯二酚，緩慢滴加 O . 18g的甲基丙烯酸甲 酯，水浴回流lh。反應結束后，用水洗滌數次，得到溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠。
[0028] 將溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠進行紅外、13C核磁共振、1H核磁共振、掃描電鏡掃 描。結果如下:紅外圖譜如圖2所示，其中，3080-2870(^ 1為凝膠碳碳雙鍵處甲基亞甲基C-H 的伸縮振動吸收峰，1469-1380011+1為甲基C-H彎曲振動吸收峰，895cm-1為亞甲基C-H彎曲振 動吸收峰，ΙδδΟαιΓ 1為C = O的伸縮振動吸收峰。凝膠中，360001^1處無特征峰，表明甲基丙稀 酸甲酯修飾水凝膠成功，即新型溫敏型多孔半互穿水凝膠合成成功。 13C核磁圖譜(NMR)如圖 3/H核磁圖譜(匪R)如圖4,由其可知溫敏型多孔半互穿水凝膠合成成功。掃描電鏡圖如圖 5,可知水凝膠內為相互貫穿的多孔結構，孔洞大小和分布比較均勻。
[0029] 實施例2
[0030] 將實施例1制備的溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠用于固定含巰基的酶，按如下步 驟進行：
[0031] 巰基點擊反應固定木瓜蛋白酶:稱取0.1 g制得的溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠， 將其加入到酶溶液中，加熱至30°C，凝膠開始吸收酶溶液發生溶脹，酶分子在凝膠內部與凝 膠發生交聯反應，制得固定化酶。將制得的固定化木瓜蛋白酶保存在O.lmol/L磷酸鹽緩沖 液的(pH=7)4°C保存。
[0033]經實驗對比，得出所制得的固定化酶的酶活性是使用戊二醛交聯所得的固定化酶 的5.5倍左右。
[0034] 實施例3
[0035] 一種溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠的制備方法，按如下步驟進行：
[0036] (I)PHEMA的合成:將5mg引發劑AIBN、2mL單體HEMA加到4mL溶劑DMSO中，通氮氣，在 60 °C中水浴回流8h。反應結束后，用乙醚沉淀，過濾，烘干得到PHEMA粉末。
[0037] (2)多孔網絡半互穿水凝膠的制備：將0.1 g的制孔劑PEG20000、1.8mL的DEAAm、 〇. 〇4g的交聯劑Bis和0.075g的PHEMA溶于6mL的DMSO中，通氮氣，水浴回流6h。反應結束后， 得到凝膠。
[0038] (3)丙烯酸酯修飾凝膠:將凝膠置于蒸餾水中浸泡14天，稱取Ig浸泡后的凝膠，溶 于IOmL的DMF中，加入0.01~0.05g的甲醇鈉，攪拌并滴加0.1Ig的氨基乙醇，在溫度1下攪拌 回流4h。反應結束后，冷卻至溫度2，加入0.005g的對苯二酚，滴加0.18g的甲基丙烯酸甲酯， 水浴回流lh。反應結束后，用水洗滌數次，得到溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠a~f。
[0039] 表1溫度對凝膠特性的影響
[0041 ]由表1可知，溫度1為150 °C、溫度2為80 °C時，所得水凝膠最優。溫度過高時，會產生 大量副產物使產率較低，而溫度較低時，會有大量反應物剩余。所以，溫度過高還是過低都 會使水凝膠雜質過多而降低水凝膠的效用。
【主權項】
1. 一種溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠的制備方法，其特征是，按如下步驟進行： (1 )PHEMA的合成：將5mg的引發劑偶氮二異丁腈（2,2'-厶2〇1^8(2-methylpropionitrile)，AIBN)、2mL 的單體甲基丙稀酸輕乙酯（Hydroxyethyl methacrylate，HEMA)加到4mL的溶劑二甲基亞諷(Dimethyl sulfoxide，DMS0)中，在氮氣環 境下60 °C水浴中回流8h，得到PHEMA淡黃色液體。用乙醚沉淀，過濾，烘干得到PHEMA粉末。 ⑵網絡半互穿水凝膠的制備：將〇. lg的制孔劑聚乙二醇PEG20000、1.8mL的N，N-二乙 基丙稀酰胺(N，N-diethyl-Acrylamide，DEAAm)、0.04g的交聯劑N，N-亞甲基雙丙稀酰胺 (Methylene-Bis-Acrylamide，Bis)和0 · 075g的PHEMA 粉末溶于 6mL的DMS0 中，在氣氣環境下 水浴回流6h，得到凝膠。 (3)丙烯酸酯修飾凝膠：將凝膠置于蒸餾水中浸泡14天，稱量lg浸泡后的凝膠，溶于 101111^的1^，1^-二甲基甲酰胺（1^，1^-0;[11161:1171;1^〇1'1]1&1111(16,0]\〇 7)中，加入0.01~0.058的甲醇鈉， 攪拌條件下滴加〇. 11 g的氨基乙醇，在150°C左右攪拌回流4h。反應結束后，冷卻至80 °C，加 入0.005g的對苯二酚，滴加0.18g的甲基丙烯酸甲酯，水浴回流lh，得到透明凝膠狀固體。反 應結束后，用水洗滌固體數次，得到溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠。2. 如權利1所述方法制備的溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠的應用，其特征在于，所述應 用為:將溫敏型多孔半互穿網絡水凝膠用于固定含巰基的酶。
【文檔編號】C08F8/00GK105860098SQ201610248637
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】郭明, 黃婧欣
【申請人】浙江農林大學