側鏈含硫辛酰基的聚合物、其制備方法及由其制備的聚合物囊泡及其應用

側鏈含硫辛酰基的聚合物、其制備方法及由其制備的聚合物囊泡及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種側鏈含硫辛酰基的聚合物、其制備方法及由其制備的聚合物囊泡及其應用。側鏈含硫辛酰基的聚合物通過RAFT聚合和酯化反應得到，其分子量分布較窄、分子量和LA取代度可控具有優異的生物相容性，可用于控制藥物釋放體系，制備的肺癌靶向的還原敏感可逆交聯的聚合物囊泡納米藥物支持體內穩定長循環，但在肺癌組織高富集并高效進入細胞，在細胞內快速解交聯、釋放出藥物，高效特異性地殺死癌細胞，有效抑制了皮下和原位肺癌的生長而不造成毒副作用。
【專利說明】
側鏈含硫辛酰基的聚合物、其制備方法及由其制備的聚合物 囊泡及其應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種生物相容性聚合物材料及其應用，具體涉及一種側鏈含硫辛酰基 的生物相容性雙親聚合物、其制備方法及由其制備的聚合物囊泡以及應用。
【背景技術】
[0002] 由雙親性聚合物自組裝形成的聚合物囊泡具有非常獨特的膜結構，其性能可調度 大，能同時裝載親水性藥物和疏水性藥物，已被廣泛應用于生物醫學領域尤其是藥物控制 釋放領域。但由現有技術制備的聚合物囊泡納米載體存在體內循環不穩定、腫瘤細胞攝取 低、細胞內藥物濃度低的問題，導致納米藥物的藥效不高，還存在毒副作用。現有囊泡對穿 透能力強的親水性小分子抗癌藥物以及毒副作用小的親水性生物大分子藥物如蛋白藥物 和核酸類藥物的裝載效率低，極大地限制了其作為藥物載體的應用。
[0003] 癌癥是威脅人類健康的主要殺手，其發病率和死亡率呈逐年上升的趨勢。肺癌在 世界上尤其是在我國的發病率居高不下。手術只能對早期的肺癌患者有利，而對于中晚期 無效。肺癌的治療存在難以早期診斷、愈后差、易轉移、易耐藥的特點。納米藥物是治療肺癌 的一個關鍵點和希望所在。但是現有技術中，尚缺乏在體內循環穩定、特異性靶向肺癌、細 胞內快速釋放藥物、毒副作用小的高效納米藥物，尤其是缺少能夠運輸親水性小分子抗癌 藥物的生物相容性優異的納米載體。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種側鏈含硫辛酰基的生物相容性雙親聚合物、由其制備的 聚合物囊泡、及其作為抗肺癌藥物的載體在制備肺癌靶向治療藥物中的應用。
[0005] 為達到上述目的，本發明具體的技術方案為:一種側鏈含硫辛酰基的聚合物，結構 式如下：
R2、R3選自以下方案之一： ① R2、R3同為H; ② R2為CH3, R3為H或者以下基團中的一種：
P(HPMA-LA)鏈段的分子量是PEG鏈段分子量的3~10倍，PIon鏈段的分子量是PEG鏈段 分子量的30%~70%。
[0006] 本發明公開的側鏈含硫辛酰基的聚合物主體為PEG-P(HPMA-LA)-PIon,為三嵌段 聚合物，疏水嵌段為側鏈含硫辛酰基的P(HPMA-LA)鏈段，即嵌段B，其中xy重復單元無規共 聚;還包括PEG鏈段(嵌段A)和在生理條件下可電離的PIon鏈段(嵌段C);
B的分子量是A分子量的3~10倍，C的分子量是A分子量的30%~70%。
[0007] 優選的技術方案中，上述側鏈含硫辛酰基的聚合物化學結構式中，Rl選自以下基 團中的一種：
所述m為113~170，PIon鏈段的分子量是PEG鏈段分子量的35%~50%。
[0008] 上述側鏈含硫辛酰基的聚合物的制備包括以下步驟： (1) 在氮氣環境下，氮二羥丙基甲基丙烯酰胺、聚乙二醇化合物和有機引發劑溶在有機 溶劑中；然后于密封反應器里，60~70°C反應1~3天;然后將反應物在冰乙醚中沉淀，再經 抽濾并真空干燥濾餅得到PEG-PHPM; (2) 氮氣環境下，將PEG-PHPMA和有機引發劑溶在有機溶劑里，然后加入2-(二甲基氨 基）甲基丙烯酸乙酯；然后于密封反應器里，60~70°C反應1~3天;然后將反應物在冰乙醚 中沉淀，再經抽濾并真空干燥濾餅得到PEG-PHPMA-PDMA; (3) 在氮氣環境下，硫辛酸溶在有機溶劑中，配制硫辛酸溶液;將N，N-二環己基碳二亞 胺于有機溶劑中，配制N，N-二環己基碳二亞胺溶液;然后冰水浴下，將N，N-二環己基碳二亞 胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室溫反應10~15小時;反應結束后，過濾反 應液，得到硫辛酸酐溶液； (4) 氮氣環境下，將硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶的有機溶劑中，密封條 件下，于30°C反應1~3天;然后將反應物在冰乙醚中沉淀，再經抽濾并真空干燥濾餅得到側 鏈含硫辛酰基的聚合物。
[0009] 上述技術方案中，有機引發劑一般為偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈等;有機溶劑可 以為四氫呋喃，N，N_二甲基甲酰氨，甲酰氨，二氯甲烷，二甲亞砜等。
[0010] 本發明中，疏水嵌段為側鏈含硫辛酰基的PHPMA，即嵌段B，可表示為P(HPMA-LA)， 由PHPMA中N-2-羥丙基甲基丙烯酰胺單元的羥基酯化反應制備得到，取代度為50~100,為 無規共聚物鏈段。本發明的側鏈含硫辛酰基的聚合物的親水段PEG的末端可以化學偶聯肺 癌特異性靶向分子如六11^、(31^0、(^60、〇：-9或者0??33等多肽來制備得到肺癌特異靶向的 聚合物，具備雙親性、生物相容性。這樣的聚合物形成的納米囊泡具有很好的穩定性，較高 的裝載效率，同時可以特異性地靶向到肺癌細胞。
[0011] 本發明還公開了一種聚合物囊泡，可以由上述側鏈含硫辛酰基的聚合物制備得 到;或者由上述肺癌特異靶向的聚合物制備得到；或者由上述側鏈含硫辛酰基的聚合物與 肺癌特異靶向的聚合物制備得到，比如上述側鏈含硫辛酰基的聚合物和肺癌特異靶向的聚 合物按照不同比例混合，可制備具有不同靶向密度的聚合物囊泡，即得到肺癌靶向囊泡，可 以增加載藥囊泡在肺癌細胞中的攝取量;也可以由側鏈含硫辛酰基的聚合物制備的聚合物 囊泡外表面偶聯肺癌細胞特異性革G向分子來制備肺癌革El向聚合物囊泡，以增加肺癌細胞的 攝取量，比如在囊泡的PEG端通過酰胺化反應鍵合靶向多肽如Ani s、cRGD、cNGQ、CC-9或者 CPP33〇
[0012] 本發明公開的側鏈含硫辛酰基的聚合物具有優異的生物相容性，其疏水部分(P (HPMA-LA))的分子量是親水部分(PEG)分子量的3~10倍，可通過溶劑置換法來制備得到聚 合物囊泡，可在催化量的還原劑如二硫代蘇糖醇(DTT)或谷胱甘肽(GSH)存在的條件下，制 備得到交聯聚合物囊泡或者肺癌靶向交聯聚合物囊泡，粒徑70~180納米，可以作為治療肺 癌的藥物的載體;可以在囊泡的疏水膜中裝載疏水性小分子抗肺癌藥物紫杉醇(PTX)、多西 紫杉醇(DTX)等，也可以在囊泡的大的親水內腔中裝載親水性抗肺癌藥物，尤其是親水性小 分子抗癌藥物如甲氨喋呤鈉鹽(MTX · 2Na)、培美曲塞鈉鹽(PEM · Na)、鹽酸多柔比星(D0X · HC1)、鹽酸表阿霉素 (Epi · HC1)、鹽酸伊利替康(CPT · HC1)和鹽酸米托蒽醌(ΜΤ0 · HC1)，也 可以在囊泡的疏水膜中裝載生物藥物如蛋白質、多肽和核酸類藥物。這樣克服了現有的由 雙親性聚合物形成的膠束載體只能裝載疏水藥物和現有技術中沒有能高效裝載親水性小 分子抗癌藥物、并穩定體內循環的相容性載體的缺陷；尤其是本發明的側鏈含硫辛酰基的 聚合物用作藥物載體時，可以裝載現有雙親聚合物無法裝載的生物藥物，而且體內循環效 果良好、病灶部位藥用效果好。
[0013] 本發明公開的交聯聚合物囊泡在疏水膜內形成了穩定的化學交聯，從而可在體內 穩定長循環；但內吞進入癌細胞后可在細胞內還原性環境下，快速解交聯，快速釋放出藥 物，高效殺死肺癌細胞。所以本發明請求保護上述聚合物囊泡在制備治療肺癌的藥物中的 應用;進一步的，本發明還公開了上述側鏈含硫辛酰基的聚合物以及肺癌特異靶向的聚合 物在制備治療肺癌的藥物中的應用;基于本發明聚合物制備的抗肺癌藥物為囊泡抗肺癌納 米藥物。
[0014] 由于上述技術方案的運用，本發明與現有技術相比，具有以下優點： 1.本發明利用聚乙二醇為引發劑、通過活性RAFT聚合順序共聚氮二羥丙基甲基丙烯 酰胺及（甲基)丙烯酸酯類單體得到分子量可控、分子量分布較窄聚合物，再和硫辛酸酐發 生酯化反應得到取代度可控的側鏈含硫辛酰基的聚合物，豐富了雙親生物相容性聚合物的 種類。
[0015] 2.本發明公開的側鏈含硫辛酰基的聚合物具有優異的生物相容性可以制備聚合 物囊泡和肺癌靶向聚合物囊泡，裝載不同性質的藥物，尤其是生物藥物;并可以形成二硫鍵 交聯，得到穩定的交聯聚合物囊泡納米藥物，從而克服了現有技術中納米藥物體內循環不 穩定、藥物易早釋、造成毒副作用的缺陷。
[0016] 3.本發明公開的交聯聚合物囊泡納米藥物，其交聯可逆性，即支持體內長循環， 可在肺癌細胞高富集;但是進入肺癌細胞內后卻可以快速解交聯，釋放出藥物，實現高效特 異性地殺死肺癌細胞而不具有毒副作用；克服了現有技術中交聯的納米藥物過于穩定、而 在細胞內藥物釋放緩慢、造成耐藥性的缺陷；聚合物囊泡可在制備過程中形成還原敏感的 二硫鍵交聯，制備方法簡便，從而克服了現有技術中制備交聯納米藥物時需要復雜的操作 和提純過程等缺陷。
[0017] 4.本發明公開的側鏈含硫辛酰基的聚合物自組裝制備的交聯聚合物囊泡可用于 親水抗癌藥物包括親水小分子抗癌藥物和蛋白質、多肽和核酸等生物藥物的控制釋放體 系，從而克服了現有納米膠束載體僅適用裝載疏水藥物的缺陷和現有技術中沒有能高效裝 載、并穩定體內循環的親水性抗癌藥物的缺陷；進一步地，可鍵合革G向分子，在肺癌的高效 靶向治療方面具有更廣泛的應用價值。
【附圖說明】
[0018] 圖 1 為實施例一中PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k的氫核磁譜圖； 圖 2為實施例二中 An i S-PEG7.5k-P (HPMA12. Ok-LA) -PDMA2.3k的核磁譜圖； 圖3為實施例六中交聯囊泡PEG5k-P(HPMA11.9k-LA)-PDMA1.8k的粒徑分布(A)及透射 電子顯微鏡圖（B)，交聯囊泡穩定性(C、D、E)及還原響應性測試(Π 圖； 圖4為實施例十中載MTX · 2Na交聯囊泡Anis-PEG5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k和 PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k的體外釋放圖； 圖 5為實施例十四中靶向交聯囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k/PEG5k-P(HPMA11.9k-LA)-H)MAl. 8k對H460肺癌細胞的毒性結果圖； 圖6為實施例十五中載MTX · 2Na不同靶向交聯囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k/PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k對H460細胞的毒性結果圖； 圖7為實施例十五中載MTX · 2Na 50%靶向交聯囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k/PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k對H460細胞的毒性結果圖； 圖8為實施例十六中載MTX · 2Na靶向交聯囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k/PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k在小鼠體內的血液循環研究結果圖； 圖 9 為實施例十七中靶向交聯囊泡PEG5k-P(HPMA9k-LA)-PAA2.4k-Cy5/Anis-PEG7.5k-P(HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k在小鼠體內血液循環研究結果圖； 圖10為實施例十八中載MTX*2Na靶向交聯囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2 · 3k/PEG5k-P(HPMAl 1 · 9k-LA)-PDMAl · 8k在荷肺癌皮下瘤裸鼠體內的生物分布圖； 圖11為實施例十九中載Cy5-CC靶向交聯囊泡PEG5k-P(HPMA9k-LA)-PAA2.4k-Cy5/ An i S-PEG7.5k-P (HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k在荷肺癌皮下瘤裸鼠體內的生物分布圖； 圖12為實施例二十中載MTX*2Na靶向交聯囊泡Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k/PEG5k-P(HPMAl 1.9k-LA)-PDMAl. 8k在荷肺癌皮下瘤裸鼠體內的抑瘤情況圖，其 中A為腫瘤生長曲線，B為小鼠治療后腫瘤圖片，C為體重變化，D為生存曲線； 圖 13 為實施例二^-一中載GrB靶向交聯囊泡PEG5k-P(HPMA9k-LA)-PAA2.4k/Anis-PEG7.5k-P(HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k在荷肺癌皮下瘤裸鼠體內的腫瘤抑制情況圖，其中A為 腫瘤生長曲線，B為小鼠治療后腫瘤圖片，C為體重變化，D為生存曲線。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例和附圖對本發明作進一步描述： 實施例一合成三嵌段聚合物PEG5k-P(HPMAl1.9k-LA)-PDMAl. 8k 首先合成三嵌段聚合物PEG5k-PHPMAl 1.9k-roMAl. 8k:在氮氣環境下，0.28 g( 1.96 mmol)氮二羥丙基甲基丙烯酰胺(HPMA)單體和0.1 g(20 μπιο?)的PEG-CPADN，0.49 mg AIBN (3 μπιο?)溶在4.5 mL四氫呋喃中，加入密封反應器里，繼續通氮氣30分鐘后，接著把反應器 密封好，70 °C油浴中反應2天。而后將產物PEG-PHPMA在冰乙醚中沉淀，抽濾并真空干燥得 至丨JPEG5k-PHPMAll·9k，產率為83%。 1H匪R(400 MHz，DMS0-d6):PEG:δ3·23,3·51; PHPMA: δ 0.8-1.02，2.89，3.68,4.71。核磁計算出下式中??=114，η=83<^Ρ(：測分子量： 15·2kDa，分子量分布：l·09。氮氣環境下，將0·lg(5·95μmol)PEG5k-PHPMAll·9k聚合 物和0.15 mg AIBN (0.89 μπιο?)溶在0.33 mL DMF里，加入到密閉反應中，再向其中加入 25.5yL 2-(二甲基氨基）甲基丙烯酸乙酯(DMA，0.15 mmol)，攪拌至溶解，繼續通氮氣30分 鐘，把反應器密封好，70 °C油浴中反應2天。而后將產物在冰乙醚中沉淀，抽濾并真空干燥 得到PEG5k-PHPMAll.9k-PDMAl.8k，產率為71%</Η NMR (400 MHz, DMS〇-d6):PEG:S 3.23， 3.51; PDMA: δ 0.8-1.02，2.27,4.25。核磁計算出下式中 111=114，11=83，口=12。6?(：測分子 量：16.0 kDa，分子量分布：1.15。
[0020] 然后通過酯化反應制備最終三嵌段側鏈含硫辛酰基聚合物。在氮氣環境下，0.18 g (0.87 mmol)硫辛酸(LA)溶在2 mL二氯甲烷中，加入兩頸瓶內攪拌至溶解，0.11 g(0.52 mmol)N，N-二環己基碳二亞胺(DCC)于I mL二氯甲烷中，冰水浴下，將其逐滴加入LA溶液中。 繼續通5分鐘氮氣，將兩頸密封好，室溫下，反應12小時。反應結束后，過濾掉反應產生的沉 淀。將硫辛酸酐（LAA)溶液濃縮至0.5 ml，氮氣環境下，加入到100 mg(5.4 ymol)PEG5k-PHPMAll.9k-PDMAl.8k及53.7 mg(0.44 mmol)DMAP的3.35 mL二甲亞砜溶液中，繼續通5分 鐘氮氣，密封燒瓶，置于30°C油浴中反應48 h。而后將產物在冰乙醚中沉淀，抽濾并真空干 燥得到PEG5k-P (HPMA11.9k-LA) -PDMA1.8k，產率為74.7%。附圖 1 為其核磁圖譜，1H (400 MHz, DMS〇-d6):PEG: δ 3.23 和3·51;ΡΗΡΜΑ:δ 〇·8-1·13,3·14,3·67,4·71 and 4.83; PDMA (δ 1·3-1·8,2·27,2·64,4·18); LA:S 1·40，1·58-1·69,2·29，1·89/2·43， 3.02，和3.74。核磁計算出，χ=79，y=4。取代度(DS，指PHPMA中每100個羥基被取代的LA的個 數)是96。
[0021]實施例二合成靶向聚合物 Anis-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k 用合成的大分子RAFT試劑Anis-PEG-CPADN作為鏈轉移劑，然后同實施例一方法制備聚 合物。分三步制備An i s-PEG-CPADN。首先NHS活化的對茴香酸(An i s-NHS )的制備:室溫下，將 4.96 g(24.0 mmol)N，N-二環己基碳二亞胺(DCC)的30 mL四氫呋喃溶液逐滴加入到3.04 g(20.0 mmol)茴香酸和2.76 g(24.0 mmol)N-羥基琥珀酰亞胺的70 mL四氫呋喃溶液中，滴 加結束后，密閉兩頸瓶，繼續反應12小時。反應結束后，過濾除去白色沉淀，將濾液旋轉蒸 發，得到白色粗產品。向粗產品中加入250 mL異丙醇重結晶，得到白色針狀晶體，產率為 94%。咕 NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08 (d， 2H), 6.96 (d， 2H), 3.69 (s， 3H), 2.89 (s, 2H)。經核磁分析，對茴香酸全部被活化成Anis-NHS。接著，通過酰胺化反應制備Anis-NHS功能化的PEG(Ansi-PEG-OH)。氮氣保護下，將α-氨基-ω-羥基聚乙二醇鹽酸鹽(!10^^6-NH2'HCl，M n=7500 g/mol，300 mg，0.04 mmol)溶解在干燥的DCM(3 mL)中，隨后在0°C下加入 三乙胺（4.45 mg，0.044 mmol)，攬摔30min后將Anis_NHS(10.97 mg，0.044 mmol)的DCM溶 液緩慢滴加到混合反應溶液中，滴加完畢后，轉移至室溫繼續攪拌反應20小時。反應結束 后，混合物用冷無水乙醚/乙醇(體積比99/1)沉淀，真空干燥一天得到白色固體，產率:94% !1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.77 (ArH-CO-), 6.90 (ArH-OCH3), 3.84 (ArH-OCH3), 3.63 (PEG) Jnis-NHS的取代度通過氫核磁譜圖計算，接近100%。第三步制備Anis-PEG-CPADN:氮氣環境下，將29 · 6mg 4-氰基戊酸二硫代萘甲酸酯（CPADN，0 · 09 mmol)和37 · 2mg (0.18 mmo I)DCC溶解在DCM中，預先攪拌12小時后，向溶液中加入5.5mg的DMAP(0.045 mmol)和2ml的Anis-PEG-〇H( 10 · 97mg，0 · 044mmol)的DCM溶液，繼續反應20小時。反應結束 后，混合物用冷無水乙醚/乙醇（體積比99/1)沉淀，真空干燥一天得到白色固體。產率： 80.5%;咕匪1?(400 1抱，〇)(：13):6 8.20，7.90 311(17.50(仙口吐1^16116)，7.78(八也-C0-)， 6.90 (ArH-OCH3), 4.27 (-0CH2CH20C0-), 3.84 (ArH-OCH3), 3.63 (PEG) and 1.99 (-C(CN) (CH3)-S-) XPADN的取代度通過比較核磁積分計算出為98%。
[0022] 而后，以Anis-PEG-CPADN來作為鏈轉移劑、HPMA和DMA為單體、同實施例一制備得 到三嵌段側鏈含硫辛酰基的肺癌特異靶向的聚合物Anis-PEGT.SkKHPMAU.Ok-UO-pDMASJk。附圖 2 為其核磁圖譜，1H NMR (600 MHz, CDCl3): δ 7.78， 6.90 (茴香酰胺 ）， 6.03 (芳酸質子），5.83 (Ar-CH-), 4.17 (-COOOfeC-), 3.89 (-OCH2CCH-2O-)，3.75 (Ar-OCH3), 3.65 (PEG), PHPMA: δ 0.8-1.13, 3.14, 3.67, 4.71, and 4.83; PDMA: δ 1.3-1.8, 2.27，2.64，4.18;硫辛酸：δ 1.40，1.58-1.69，2.29，1.89/2.43, 3.02， and 3· 74。核磁計算出下式中 111=170，1=84,7=0，口=15，1+7為11，取代度03=100。
[0023] 實施例三合成靶向聚合物 Anis-PEG7.5k-P(HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k 按照實施例二的方法、以HPMA和丙烯酸(AA)為單體，可以合成三嵌段側鏈含硫辛酰基 肺癌特異靶向的聚合物Anis-PEG7·5k-P(HPMA9·2k-LA)-PAA2·4k。1H匪R(600 MHz， CDCl3): δ 7.78，6.90 (茴香酰胺），6.03 (芳酸質子），5.83(厶廣01-)，4.17(-COOCH2C-), 3.89 (-OCH2CCH-2O-), 3.75 (Ar-OCH3), 3.65 (PEG), PHPMA: δ 0.8-1.13, 3.14，3.67，4.71，and 4.83; PAA (δ 1.53-1.74, 2.20);硫辛酸：5 1.40，1.58_ 1.69，2.29，1.89/2.43，3.02，and 3.74。核磁計算出下式中m=170，x=4，y=21，p=33。?^ 代度DS=67。
[0024] 實施例四合成三嵌段聚合物 N3-PEG10k-P(HPMA21.0k-LA)-PDPA6.2k 如實施例二合成分三步。第一步，以N3-PEG10k-OH為原料制備大分子RAFT試劑N3-PEGlOk-CPADN，第二步以HPMA和2-(二異丙基氨基）甲基丙烯酸乙酯(DPA)為單體、RAFT聚合 制備NS-PEGlOk-I3HPMASl . 0k-PDPA6.2k;第三步，酯化反應接枝LA得到N3-PEG10k-P (HPMA21 · 0k-LA)-PDPA6 · 2k。核磁計算出 x=75，y=72，p=29，DS=51，m=227。
[0025]
采用上述類似的制備方法，可以制備多種側鏈含不同接枝量硫辛酰基、第三嵌段(C嵌 段)為PDMA(2-(二甲基氨基）甲基丙烯酸乙酯）、PDEA(2-(二乙基氨基）甲基丙烯酸乙酯）、 Η)ΡΑ(2-(二異丙基氨基）甲基丙烯酸乙酯）、PAA(聚丙烯酸)和PMA(聚甲基丙烯酸）的生物相 容性雙親聚合物，具體原料比例以及表征見表1。
[0026] 表1各個聚合物制備條件、產物的核磁結果
實施例五合成靶向聚合物cRGD-PEG4k-P(HPMA6. lk-LA)-PMA2.0k 如實施例四合成分三步制備N3-PEG4k-P(HPMA6.1k-LA)-PMA2.0k。第一步如實施例二， 以N3-PEG4k-OH為原料制備大分子RAFT試劑N3-PEG4k-CPADN，第二步以HPMA和甲基丙烯酸 (MA)為單體、RAFT聚合制備N3-PEG4k-PHPMA6. lk-PMA2. Ok;第三步如實施例二、酯化反應接 枝LA得到N3-PEG4k-P(HPMA6.1k-LA)-PMA2.0k，LA的DS為55。然后，和炔基修飾的環狀多肽 cRGD(cRGDfK)發生銅催化的疊氮-炔基Husigen環加成反應（即點擊反應）。先將一定量 CuS〇4'5H20(0.12 mmol)、抗壞血酸鈉(0.24 mmol)及炔基修飾的環狀多肽cRGD (1.2 mmol) 溶在DMF中，加入N3-PEG4k-P(HPMA6.1k-LA)-PMA2.0k (I mmol)的DMF(5 mL)溶液，室溫下 反應24小時，得到最終的靶向聚合物。
[0027] 按照上述類似的方法，使用炔基修飾的cNGQ (cNGQGEQc，cyclic)、CC_9 (CSNIDARAC,cyclic)或CPP33 (RLffMRWYSPRTRAYG)等多肽分子替換炔基修飾的環狀多肽 cRGD，發生點擊化學反應可以制備不同靶向分子的共聚物，（cNGQ-PEG-P(HPMA-LA)-PMA、 CC-PEG-P (HPMA-LA) -PMA 和 CPP-PEG-P (HPMA-LA) -PMA )。更換不同的第三嵌段(C嵌段），可以 得到多種三嵌段側鏈含硫辛酰基肺癌特異靶向的聚合物，（cNGQ-PEG-P(HPMA-LA)-PDEA、 CC-PEG-P(HPMA-LA)-PDPA和CPP-PEG-P(HPMA-LA)-PDMA) 實施例六制備聚合物交聯囊泡 將I mg PEG5k-P(HPMA11.9k-LA)-PDMA1.8k溶在ImL DMF中，配成I mg/mL的溶液，氮氣 條件下，加入10 mM的DTT溶液，密封小瓶子，室溫下攪拌10小時使之溶解。然后將該溶液置 于透析袋(麗〇)3500)內，在2〇1^磷酸鹽緩沖溶液(？8,5 11^，？!17.4)中靜置透析2小時(最 終DTT濃度為0.5 mM);而后將其在大量透析介質(PB，5 mM，pH 7.4)中透析24小時，換五次 水。得到的交聯聚合物囊泡的尺寸由動態光散射粒度分析儀(DLS)測的形成的納米囊泡為 170 nm，粒徑分布很窄，見圖3A，由圖3B可知，TEM測得納米粒子為中空的囊泡結構，交聯聚 合物囊泡在高濃度鹽、高倍稀釋和胎牛血清存在下仍然保持不變的粒徑和粒徑分布（圖3C、 圖3D、圖3E)，但在模擬腫瘤細胞還原環境下快速釋放，解交聯（圖3F)。由此可知，得到的交 聯囊泡具有還原敏感的解交聯的性質，適用于藥物載體。
[0028]實施例七制備Anis為靶向分子的靶向交聯囊泡 在 I mL DMF 中按一定質量比將PEG5k-P (HPMA11 · 9k-LA) -PDMA1 · 8k和An i s-PEG7 · 5k-P (HPMA12.0k-LA)-roMA2.3k溶解，如實施例六制備交聯囊泡。靶向聚合物的PEG分子量比非 靶向的PEG要長，保證靶向分子更好的支出表面。兩者按不同比例混合可制備表面具有不同 靶向分子的交聯囊泡，PEG5k-P(HPMA11.9k-LA)-PDMA1.8k含量為50 wt.%，DLS測定靶向交 聯囊泡尺寸為174 nm左右，粒徑分布較窄。
[0029] 實施例八制備cNGQ多肽為靶向分子的的靶向交聯囊泡 室溫下向950 yL的I3B (5 mg/mL)緩沖溶液中加入50 yL濃度為5mg/mL的PEG5k-P (HPMA9·0k-LA)-PMA2·Ok和CNGQ-PEG6·0k-P(HPMA9·0k-LA)-PMA2·Ok 的DMSO溶液，緩慢轉 動混合液，使之逐漸形成一相。2小時分散均勻后，將納米粒通氮氣30min，加入10%的DTT溶 液，37°C恒溫搖床中震蕩（200 rpm)24 h，使之充分交聯。然后轉入透析袋(MWC0: 3500 Da)，室溫下透析24 h除去有機溶劑，透析介質為磷酸鹽緩沖溶液(5 mM，pH 7.4)，期間至少 換5次介質。PEG5k-P(HPMA9.0k-LA)-PMA2.0k含量為5-30wt.%。DLS測定靶向交聯囊泡尺寸 為80 nm左右，粒徑分布較窄。
[0030] 實施例九制備cRGD多肽為靶向分子的的靶向交聯囊泡 將 PEG5k-P( HPMAl 0 · Ok-LA)-PDEA2 · 5k 和 N3-PEG1 Ok-P(HPMAK) · Ok-LA )-PDEA2 · 6k 按一 定質量比溶在I mL DMF中，如實施例六制備交聯聚合物囊泡。兩者按不同比例混合可制備 表面具有不同N3基團密度的交聯聚合物囊泡。然后，通過和大環炔基官能化的多肽如cRGD、 cNGQ、CPP33等發生點擊化學反應，制備具有不同靶向分子密度的交聯囊泡。DLS測定靶向交 聯囊泡尺寸為130-174 nm左右，粒徑分布較窄。
[0031 ]實施例十交聯囊泡裝載甲氨蝶呤鈉鹽及體外釋放 用溶劑置換法制備聚合物囊泡、載藥交聯囊泡制備、空囊泡的制備方法類似。具體為， 將I mg 的PEG5k-P(HPMAl1·9k-LA)-PDMAl·8k和Anis-PEG7·5k-P(HPMA12·Ok-IJO-pDMAS.Sk 溶在 ImL DMF 中 ，配成 I mg/mL 的溶液，氮氣條件下，加入 10 mM 的 DTT 溶液，密封小 瓶子，室溫下攪拌10小時。向聚合物溶液中加入甲氨蝶呤鈉鹽(MTX· 2Na)的I3B (5 mg/mL)溶 液，然后將該溶液于透析袋(11〇)3500)內，于20 1^磷酸鹽緩沖溶液(？8,5 1111，？!17.4)中 靜置透析2小時；而后將其在大量透析介質(PB，5 mM，pH 7.4)中透析24小時，換五次水。載 不同比例的藥（10%_30wt%)的交聯聚合物囊泡的粒徑在130-150 nm，粒徑分布在0.15- 0.19。紫外光光譜儀測定MTX· 2Na的包裹效率為62%-86%。得到的載藥囊泡命名為MTX-AniS-RCCPs，表示載的藥物為MTX· 2Na，靶向分子為Ani s，其他命名以此類推。
[0032] MTX'2Na的體外釋放實驗在37 °C恒溫搖床中震蕩（200 rpm)進行，每組各有三個 平行樣。第一組，載MTX'2Na的交聯囊泡在加入10 mM GSH模擬細胞內還原環境I3B (10 mM， pH 7.4)中；第二組，載MTX'2Na的交聯囊泡在I3B (10 mM，pH 7.4)中；載藥交聯囊泡的濃 度為100 mg/L，取0.5 mL放入透析袋(MWC0: 12,000)中，每個試管中加入相應的透析溶劑 25 mL，在預定的時間間隔，取出5.0 mL透析袋外部介質用作測試，同時向試管中補加5.0 mL相應介質。使用熒光儀測定溶液中藥物濃度。附圖4為MTX· 2Na累積釋放量與時間的關 系，從圖中可以看出，加入模擬腫瘤細胞內GSH后，其釋放明顯要快于沒加 GSH的樣本，說明 載藥交聯囊泡在10 mM的GSH的存在下，能有效釋放藥物。
[0033]實施例^^一靶向交聯囊泡載親水藥物PEM'Na及體外釋放 將PEG5k-P(HPMAl1·9k-LA)-PDMAl·8k和Anis-PEG7·5k-P(HPMA12·0k-LA)-PDMA2·3k按 質量比1:1溶在ImL DMF中，配成I mg/mL的溶液，氮氣條件下，加入10 mM的DTT溶液，密封小 瓶子，室溫下攪拌10小時。向聚合物溶液中加入培美曲塞鈉鹽(PEM·Na)的I3B (5 mg/mL)溶 液，然后將該溶液于透析袋(11〇)3500)內，于20 1^磷酸鹽緩沖溶液(？8,5 1111，？!17.4)中 靜置透析2小時；而后將其在大量透析介質(PB，5 mM，pH 7.4)中透析24小時，換五次水。載 不同比例的藥（10%_30wt%)的交聯聚合物囊泡的粒徑在120-150 nm，粒徑分布在0.15-0.19。紫外光光譜儀測定PEM'Na的包裹效率為70%-88%，得至IjPEM-Anis-RCCPs JEM'Na的體外 釋放實驗同實施例十。PEMWa累積釋放量與時間的關系可以看出，加入模擬腫瘤細胞內GSH 后，其釋放明顯要快于沒加 GSH的樣本，說明載藥交聯聚合物囊泡在10 mM的GSH的存在下， 能有效釋放藥物。靶向聚合物的PEG分子量比非靶向的PEG要長，保證靶向分子更好的支出 表面。兩者按不同比例混合可制備表面具有不同靶向分子密度的交聯聚合物囊泡。優選方 案為前者含量為50 wt.9LDLS測定尺寸為124 nm，粒徑分布較窄。靶向分子能更好的裸露 在外側，而不是被遮藏在里側，保證其能更好的發揮靶向作用，具有更好的靶向效果。
[0034]實施例十二交聯聚合物囊泡裝載蛋白藥物及體外釋放 室溫下向950 yL含不同濃度蛋白質(FITC標記的細胞色素 C，FITC-CC)的PB (5 mg/mL) 緩沖溶液中加入50 度為5mg/mL 的PEG5k-P(HPMA9k-LA)-PAA2.4k和Anis-PEG7.5k-P (HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k的DMSO(質量I: I)溶液，緩慢轉動混合液，使之逐漸形成一相。2小 時分散均勻后，通氮氣30min，加入10%的DTT溶液，37°C恒溫搖床中震蕩（200 rpm)24 h，使 之充分交聯。然后轉入透析袋(Mff⑶：300,000)，室溫下透析24h除去有機溶劑和游離的蛋 白，透析介質為磷酸鹽緩沖溶液(5 mM，pH 7.4)，期間至少換5次介質。載不同比例的蛋白 (l%-50wt%)的交聯聚合物囊泡的粒徑在150-160 nm，粒徑分布在0.12-0.18。得到的囊泡為 FITC-CC-Anis-RCCPs。熒光光譜儀測定FITC-CC的包裹效率為58%-100% AITC-CC的體外釋 放實驗是在37 °C恒溫搖床中震蕩（200 rpm)進行，每組各有三個平行樣。第一組，載FITC-CC的交聯聚合物囊泡在加入10 mM GSH模擬細胞內還原環境PB (10 mM，pH 7.4)中；第二 組，載FITC-CC的交聯聚合物囊泡在PB (10 mM，pH 7.4)中；載藥交聯聚合物囊泡的濃度為 100 mg/L，取0.5 mL放入透析袋(MWC0: 30,000 Da)中，每個試管中加入相應的透析介質 25 mL，在預定的時間間隔，取出5.0 mL透析袋外部介質用作測試，同時向試管中補加5.0 mL相應介質。使用熒光儀測定溶液中藥物濃度。加入10 mM DTT后，FITC-CC累積釋放量釋 放明顯要快于沒加 DTT的樣本，說明載藥交聯囊泡在10 mM的DTT的存在下，能有效釋放藥 物。
[0035]實施例十三靶向交聯聚合物囊泡載親水藥物DOX'HCl及體外釋放 采用透析法制備囊泡，pH梯度法裝載鹽酸阿霉素（D0X · HCDdO yL的TOG5.0k-P (HPMA7·6k-LA)-PDEA3·Ok的DMF溶液（5 mg/mL)及20 yL的CRGD-PEG6·0k-P(HPMA8·Ok-LA)-TOEA2.6k的DMF溶液(5 mg/mL)均勻混合之后，滴加入0.9毫升的檸檬酸鈉/檸檬酸緩沖溶液 (10 mM，pH 4.0)中，在37 °C搖床中4小時后，加入0.05 mL的PB(4M，pH 8.5)建立pH梯度， 隨后立即加入DOX · HCl(10%-30%)，搖床中放置5-10小時;再加入DTT(10.5微克，0.068 μΜ) 使囊泡交聯。最后裝入透析袋(Mff⑶7000)中對PB透析過夜，換五次液。載不同比例藥（10-30￥七％)，粒徑80-120 11111，粒徑分布0.10-0.16,0(?.!1(：1的包裹效率為65%-80%。0(^.!1(：1體 外釋放設計同實施例十。加入模擬腫瘤細胞內GSH后，DOX · HCl累積釋放量明顯要快于沒加 GSH的樣本，說明載藥交聯囊泡在10 mM的GSH的存在下，能有效釋放藥物。
[0036] 更換聚合物以及藥物，可以得到如表2的載藥量、包封率等結果。
[0037] 表2聚合物囊泡載藥物的載藥量、包封率
實施例十四MTT法測試聚合物囊泡的細胞毒性 MTT法使用人肺癌細胞(H460、A549)和人成纖維細胞(L929)。以5\103個/!1^將細胞種 于96孔板，每孔100 yL，24小時后養至細胞貼壁70%左右。然后，實驗組各孔中分別加入含有 不同濃度(0.1-0.5 mg/mL)的囊泡樣品（以實施例六的空交聯聚合物囊泡和實施例七的空 靶向交聯聚合物囊泡為例），另設細胞空白對照孔和培養基空白孔(復4孔）。培養24小時后， 每孔加入MTT(5.0 mg/mL)10 yL，繼續培養4小時后每孔加入150 yL DMSO溶解生成的結晶 子，用酶標儀于570 nm處測吸光度值(A)，以培養基空白孔調零，計算細胞存活率。附圖5為 交聯聚合物囊泡對H460的細胞毒性結果，可看出，當交聯聚合物囊泡的濃度從0.1增到0.5 mg/mL時，H460的存活率仍高于90%，說明該交聯聚合物囊泡具有良好的生物相容性。其他聚 合物囊泡的細胞毒性的測定于此類似，毒性均很小，具有良好的生物相容性。
[0038]實施例十五MTT法測載藥聚合物囊泡對H460肺癌細胞的毒性 測試對象為實施例十的MTX-Anis-RCCPs(MTX'2Na濃度為10 yg/mL，靶向分子含量從 20%、30%、50%到70%，無靶向載藥交聯聚合物囊泡及游離MTX· 2Na組作為對照組。細胞的培養 和實施例十四相同，共同培養4小時后，吸出樣品換上新鮮培養基繼續孵育44 h后，而后的 MTT加入、處理和測定吸光度同實施例十四。參見附圖6,結果顯示，50%靶向分子含量具有 最佳的靶向性。用自由藥、無靶向和50%祀向的載藥囊泡做對H460細胞的毒性實驗，MTX· 2Na 濃度范圍為0.001、0.01、0.1、0.5、1、5、10、20和40以8/111^附圖7是載藥交聯聚合物囊泡對 H460細胞的毒性，可看出載MTX'2Na的含50% Anis靶向交聯聚合物囊泡對H460細胞的半致 死濃度（IC5q)為2.4 yg/mL，遠低于自由藥，比無靶向囊泡的半致死濃度小4倍，說明本發明 的囊泡能很好的將藥物傳送到細胞內，并有效的釋放，最終殺死癌細胞，而靶向納米粒的效 果要更好。
[0039] 實施例十六ΜΤΧ-RCCPs和MTX-Anis-RCCPs交聯囊泡的血液循環 所有動物實驗操作符合蘇州大學動物實驗中心規定。實驗選用體重為18~20克左右，4 ~6周齡的Balb/C裸鼠。囊泡Anis-RCCPs由PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl ,8k和厶1^8-PEG7.5k-P(HPMA12.0k-LA)-PDMA2.3k按1:1混合而成，此比例形成的載MTX的交聯囊泡粒徑 為147納米，粒徑分布為0.19。將載MTX· 2Na的無靶向囊泡ΜΤΧ-RCCPs、靶向囊泡MTX-AniS-RCCPs和Trexall通過尾靜脈注射小鼠體內（MTX藥量為15 mg/kg)，在0、0.25、0.5、1、2、4、8、 12和24小時定點取血約10 yL，通過差量法準確計算血液重量，再加100 yL、l%的曲拉通和 500 yL無水甲醇萃取(含有20 mM的DTT);然后離心（20000轉/分鐘，20分鐘），取上層清液， 通過高效液相色譜測每個時間點MTX· 2Na的量。圖8中橫坐標為時間，縱坐標為每克血液中 的MTX·2Na占總的MTX·2Na注射量(ID %/g)。由圖可知，Trexalll的循環時間很短，2小時已很 難檢測到MTX'2Na，而交聯聚合物囊泡在24小時后仍有12 ID %/g。靶向載藥交聯聚合物囊 泡、載藥交聯聚合物囊泡在小鼠體內的消除半衰期分別為5.24、4.32小時，而Trexal 1的僅 為0.29小時，所以靶向載藥交聯聚合物囊泡在小鼠體內穩定，有較長循環時間。
[0040] 實施例十七RCCPs-Cy5和Anis-RCCPs-Cy5交聯囊泡的血液循環 動物同實施例十七。首先用Cy5-NH2和PEG5k-P (HPMA9. Ok-LA) -PAA2.4k通過酰胺化反 應制備Cy5標記的聚合物PEG5k-P(HPMA9.0k-LA)-PAA2.4k-Cy5( 1個Cy5/分子鏈）。囊泡 Αη?8-Κ(ΧΡ8-〇γ5?ΡΕ651?-Ρ(ΗΡΜΑ9·01?-?Α)-ΡΑΑ2·41?-〇75、ΡΕ651?-Ρ(ΗΡΜΑ9·01?-?Α)-ΡΑΑ2 · 4k、和Ani S-PEG7 · 5k-P(ΗΡΜΑ9 · 2k-LA)-ΡΑΑ2 · 4k按1:9:10混合而成，形成的聚合物囊 泡粒徑為160納米，粒徑分布為0.12。將RCCPs-Cy5交聯囊泡、Anis-RCCPs-Cy5靶向交聯囊 泡和Anis-RCNCPs-Cy5囊泡通過尾靜脈注射小鼠體內（Cy5濃度為4 μΜ)，在0、0.25、0.5、I、 2、4、8、12和24小時定點取血約10 yL，通過差量法準確計算血液重量，再加如100 yL濃度 為1%的曲拉通和500 yL二甲亞砜萃取(其中含有20 mM的DTT);然后離心（20000轉/分鐘， 20分鐘)后，取上層清液，通過熒光光譜儀測得每個時間點Cy5的量。圖9中橫坐標為時間，縱 坐標為每克血液中的Cy5占總的Cy5注射量(ID %/g)。由圖可知，Anis-RCNCPs-Cy5的循環時 間很短，2小時已很難檢測到Cy5,而交聯聚合物囊泡在24小時后仍有12 ID %/g。由計算可 知，靶向交聯聚合物囊泡、非靶向交聯聚合物囊泡在小鼠體內的消除半衰期分別為6.32、 6.10小時，而靶向非交聯囊的僅為1.61小時，所以本發明的交聯聚合物囊泡在小鼠體內穩 定，有較長循環時間。
[0041 ] 實施例十八ΜΤΧ-RCCPs和MTX-Anis-RCCPs交聯聚合物囊泡在荷H460肺癌小鼠的 體內生物分布 動物同實施例十七，在皮下注射IX IO7個H460人肺癌細胞，大約3~4周后，腫瘤大小為 100~200 mm3時開始實驗。由PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k和Anis-PEG7.5k-P (HPMAl 2. Ok-LA )-PDMA2.3k 制備 MTX-Ani s-RCCPs 和無靶向交聯聚合物囊泡 MTX-RCCPs，尾靜 脈注射小鼠體內（MTX'2Na:15 mg/kg)，8小時后處死老鼠，將腫瘤及心，肝，脾，肺和腎組織 取出，清洗稱重后加入500 yL 1%的曲拉通通過勻漿機磨碎，再加入900 yL無水甲醇萃取 (其中含有20 mM的DTT)。離心（20000轉/分鐘，20分鐘）后，取上層清液，通過高校液相色譜 測得每個時間點MTX'2Na的量。圖10中橫坐標為組織器官，縱坐標為每克腫瘤或組織中的 MTX'2Na 占總 MTX'2Na 注射量（IDa/o/gXAnisSO/RCCPsJCCPs 和 Trexall 注射 12 小時在腫瘤積 累的MTX· 2Na量分別為5 · 3、1 · 2和 0 · 6 ID%/g，MTX-Ani s-RCCPs是MTX-RCCPs和Trexal 1 的 4.5和9倍，說明載藥1^(^1^-1?0^通過主動靶向在腫瘤部位積累較多，結果見表3。
[0042] 實施例十九Cy5-CC-Ani s-RCCPs和泡Cy5-CC-RCCPs載蛋白交聯聚合物囊泡在荷 H460肺癌小鼠的體內生物分布 生物分布實驗中腫瘤的接種以及尾靜脈給藥同實施例十八c^SPEGSkKHPMALOk-LA)-PAA2 · 4k/Anis-PEG7 · 5k-P(HPMA9 · 2k-LA)-PAA2 · 4k 制備的載 Cy5 標記的 CC(Cy5-CC)的 靶向交聯聚合物囊泡Cy5-CC-Anis-RCCPs。將Cy5-CC-Anis-RCCPs、非靶向交聯聚合物囊泡 CC-Cy5_RCCPs和自由蛋白Cy5_CC通過尾靜脈注射小鼠體內（Cy5_CC:0.25 mg equiv./kg)， 8小時后處死老鼠，將腫瘤及心，肝，脾，肺和腎組織取出，清洗稱重后加入500yLl%的曲拉 通通過勻漿機磨碎，再加入900yL二甲亞砜萃取（其中含有20mM的DTT)。離心（20000轉/分 鐘，20分鐘)后，取上層清液，通過熒光光譜儀測得每個時間點Cy5-CC的量。圖11中橫坐標為 組織器官，縱坐標為每克腫瘤或組織中的Cy5-CC占總CC-Cy5注射量（ID%/g) XyS-CC-Anis-RCCPs、Cy5-CC-RCCPs和Cy5-CC注射8小時在腫瘤積累的Cy5-CC量分別為11.5、3.9和2.5 10%/^，075-〇>厶1118-1?〇^8是〇75-〇：-1?〇^8和〇75-〇：的3.0和4.6倍，說明載藥〇75-〇：-Anis-RCCPs通過在腫瘤積累較多，見表3。
[0043] 實施例二十MTX-Anis-RCCPs和MTX-RCCPs交聯囊泡在荷H460皮下肺癌的小鼠中 的抑瘤效果、體重變化和存活率 腫瘤的接種以及尾靜脈給藥同實施例十八，在大約兩周后，腫瘤大小為30~50 mm3時開 始實驗。由PEG5k-P(HPMAll .9k-LA)-PDMAl .8k和Anis-PEG7·5k-P(HPMA12·0k-LA)-pDMA2.3k按l:l混合制備的載MTX·2Na的靶向交聯聚合物囊泡MTX-Anis-RCCPs。將MTX- An i s-RCCPs、MTX-RCCPs、Tr exa 11以及PBS分別在O、3、6、9和12天通過尾靜脈注射小鼠體內 (MTX· 2Na藥量為15 mg/kg)。在O~21天，每三天稱量小鼠的體重，游標卡尺測量腫瘤體積，月中 瘤體積計算方法為:V=(L X WXH)/2，（其中L、W、H分別為腫瘤的長度、寬度和厚度）。持續觀 察小鼠的生存到45天。由圖12中可知，MTX-Anis-RCCPs治療組21天時，腫瘤得到明顯抑制， 而載藥MTX-RCCPs組腫瘤有一定的增長。Trexall不能抑制腫瘤的增長，而且其小鼠體重在 15天時降低了 23%，說明對小鼠的毒副作用很大。相比之下MTX-Ani s-RCCPs和MTX-RCCPs組 的小鼠體重幾乎沒有改變，說明載藥交聯聚合物囊泡對小鼠沒有毒副作用。MTX-Anis-RCCPs治療組在45天后全部存活，Trexall組在31天時已全部死亡，MTX-RCCPs組在38天時也 全部死亡。MTX-Anis-RCCPs治療21天的老鼠的主要器官沒有受到損傷，而Trexall組對小鼠 的心、肝臟有很大損傷，結果見表3。
[0044]實施例二^^一靶向交聯囊泡GrB-Ani s-RCCPs多次低劑量給藥和單次高劑量給 藥在荷H460皮下肺癌的小鼠中的抑瘤效果、體重變化和存活率 腫瘤的接種以及尾靜脈給藥同實施例十九。由PEG5k-P(HPMA9.0k-LA9) -PAA2.4k和 Anis-PEG7.5k-P(HPMA9.2k-LA)-PAA2.4k按l:l混合制備的載GrB的靶向交聯聚合物囊泡 GrB-Anis-RCCPs(多次給藥）、GrB-Anis-RCCPs(單次給藥）、及PBS分別在0、4、8和12天通過 尾靜脈注射小鼠體內（GrB藥量為50 yg/kg)。在0~21天，每兩天稱量小鼠的體重，如實施例 二十測量腫瘤體積和觀察小鼠到60天。由圖13中可知，GrB-Anis-RCCPs(多次給藥）、GrB-Anis-RCCPs(單次給藥)治療組21天時，腫瘤得到明顯抑制，而PBS組腫瘤有明顯的增長。所 有組的小鼠體重幾乎沒有改變，說明載藥交聯聚合物囊泡對小鼠沒有毒副作用。PBS組小鼠 在32天全部死亡，而GrB-Anis-RCCPs(多次給藥）、GrB-Anis-RCCPs(單次給藥)治療組能分 別延長至50天和60天。GrB-Anis-RCCPs治療21天的老鼠的主要器官沒有受到損傷，而 Trexall組對小鼠的心、肝臟有很大損傷。因此，本發明的靶向交聯聚合物囊泡載藥后可有 效抑制腫瘤的增長，對小鼠沒有毒副作用，還可以延長荷瘤老鼠的生存時間。
[0045]實施例二十二靶向交聯囊泡Epi-cNGQ-RCCPs在荷A549皮下肺癌的小鼠中的抑 瘤效果、體重變化和存活率 A549皮下腫瘤的接種同實施例十九。由cNGQ-PEG6.0k-P(HPMAl 1.0k-LA)-PAA2.4k/ PEG5k-P(HPMA11.0k-LA)-PAA2.6k按l:l混合制備的載Epi·HCl的靶向交聯聚合物囊泡 Epi-cNGQ-RCCPs。將Epi-cNGQ-RCCPs、Epi-RCCPs、自由 Epi 以及PBS分別在0、3、6、9和 12天通 過尾靜脈注射小鼠體內（EpiHCl藥量為10 mg/kg)。如實施例二十、在0~21天內稱量小鼠的 體重、量腫瘤體積和觀察小鼠到60天。由結果可知，Epi-cNGQ-RCCPs治療21天時，腫瘤得到 明顯抑制，而PBS組腫瘤有明顯的增長。所有組的小鼠體重幾乎沒有改變，說明載藥交聯聚 合物囊泡對小鼠沒有毒副作用。PBS組小鼠在30天全部死亡，而Epi-cNGQ-RCCPs組能延長壽 命至>60天，并對老鼠的主要器官沒有受到損傷，結果見表3。
[0046] 實施例二十三靶向交聯囊泡Epi-cNGQ-RCCPs在荷A549原位肺癌的小鼠中的抑瘤 效果、體重變化和存活率 實驗選用體重為18~20克左右，4~6周齡的Balb/C裸鼠，在肺部直接注射5 X IO6個帶有 生物發光的A549人肺癌細胞(A549-Luc)，大約10天后，通過小動物活體成像系統觀察，老鼠 肺部出現熒光，成功建立A549原位肺癌模型。接著，如實施例二十二中的藥劑Epi-cNGQ-RCCPs、Epi-RCCPs、自由Epi以及PBS在0、4、8和12天通過尾靜脈注射小鼠體內（Epi · HCl: 10 mg/kg)。從O~16天，每四天稱量小鼠的體重，用小動物活體成像儀監測小鼠肺部腫瘤生物發 光強弱，觀察小鼠的生存到60天。結果可知，Epi-cNGQ-RCCPs組16天內，肺部腫瘤生物發光 強度持續減弱，而Epi-RCCPs組肺部的腫瘤生物發光強度有一定增長，但兩組體重幾乎沒有 改變。EPi · HCl雖然也能抑制腫瘤的增長，但小鼠體重在4天時降低了 15%，說明其對小鼠的 毒副作用很大。Epi-cNGQ-RCCPs組在60天后仍全部存活，Epi · HCl組在30天時已全部死亡， PBS組在20天時也全部死亡。因此，載藥靶向交聯聚合物囊泡Epi-cNGQ-RCCPs可有效抑制原 位肺癌腫瘤的增長，對小鼠沒有毒副作用，并有效延長荷瘤老鼠的生存時間。采用類似的實 驗方法研究了多種載不同藥物(MTX·2Na、PEM·Na、GrB、DOX·HCl)的交聯聚合物囊泡和靶向交 聯聚合物囊泡對荷肺癌小鼠的影響，結果見表3。因此，本發明的聚合物制備的藥物載體載 藥后可有效抑制肺癌腫瘤增長，對小鼠沒有毒副作用，還可以延長荷瘤老鼠的生存時間。 [0047]表3載藥交聯囊泡對肺癌的體內外抗腫瘤結果
【主權項】
1. 一種側鏈含硫辛酰基的聚合物，其特征在于，所述側鏈含硫辛酰基的聚合物的結構 式如下：其中，m 為 68 ~227，x/(x+y) = 0.5 ~1; R1選自以下基團中的一種：R2、R3選自以下方案之一： ① R2、R3同為H; ② R2為CH3，R3為Η或者以下基團中的一種：P(HPMA-LA)鏈段的分子量是PEG鏈段分子量的3~10倍，ΡΙοη鏈段的分子量是PEG鏈段 分子量的30%~70%。2. 根據權利要求1所述側鏈含硫辛酰基的聚合物，其特征在于:所述R1選自以下基團中 的一種：所述m為113~170; ΡΙοη鏈段的分子量是PEG鏈段分子量的35%~50%。3. 權利要求1或者2所述側鏈含硫辛酰基的聚合物的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟： (1) 在氮氣環境下，氮二羥丙基甲基丙烯酰胺、聚乙二醇化合物和有機引發劑溶在有機 溶劑中；然后于密封反應器里，60~70°C反應1~3天;然后將反應物在冰乙醚中沉淀，再經 抽濾并真空干燥濾餅得到PEG-PHPMA; (2) 氮氣環境下，將PEG-PHPMA和有機引發劑溶在有機溶劑里，然后加入2-(二甲基氨 基）甲基丙烯酸乙酯；然后于密封反應器里，60~70°C反應1~3天;然后將反應物在冰乙醚 中沉淀，再經抽濾并真空干燥濾餅得到PEG-PHPMA-PDMA; (3) 在氮氣環境下，硫辛酸溶在有機溶劑中，配制硫辛酸溶液;將N，N-二環己基碳二亞 胺于有機溶劑中，配制N，N-二環己基碳二亞胺溶液;然后冰水浴下，將N，N-二環己基碳二亞 胺溶液滴加入硫辛酸溶液中；滴加完成后，密封室溫反應10~15小時;反應結束后，過濾反 應液，得到硫辛酸酐溶液； (4)氮氣環境下，將硫辛酸酐溶液加入到含有4-二甲基氨基吡啶的有機溶劑中，密封條 件下，于30°C反應1~3天;然后將反應物在冰乙醚中沉淀，再經抽濾并真空干燥濾餅得到側 鏈含硫辛酰基的聚合物。4. 一種肺癌特異革E1向的聚合物，其特征在于:所述肺癌特異革E1向的聚合物由權利要求1 所述側鏈含硫辛酰基的聚合物鍵合腫瘤特異性靶向分子制備得到。5. 根據權利要求4所述肺癌特異祀向的聚合物，其特征在于：所述革E1向分子為Ani s、 cRGD、cNGQ、CC-9 或者 CPP33 多肽分子。6. -種聚合物囊泡，其特征在于，所述聚合物囊泡的制備方法為以下制備方法中的一 種： (1) 由權利要求1或者2所述側鏈含硫辛酰基的聚合物制備得到； (2) 由權利要求4或者5所述肺癌特異靶向的聚合物制備得到； (3) 由權利要求1或者2所述側鏈含硫辛酰基的聚合物與權利要求4或者5所述肺癌特異 靶向的聚合物制備得到； (4) 在權利要求1或者2所述側鏈含硫辛酰基的聚合物制備的囊泡表面偶聯靶向分子后 得到。7. 權利要求6所述聚合物囊泡在制備治療肺癌的藥物中應用。8. 根據權利要求7所述的應用，其特征在于：所述治療肺癌的藥物為小分子抗肺癌藥 物、蛋白質抗肺癌藥物或者核酸抗肺癌藥物。9. 權利要求1或者2所述側鏈含硫辛酰基的聚合物在制備治療肺癌的藥物中的應用。10. 權利要求4或5所述肺癌特異靶向的聚合物在制備治療肺癌的藥物中的應用。
【文檔編號】C08F8/34GK105859990SQ201610234759
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月14日
【發明人】孟鳳華, 楊煒靜, 鐘志遠
【申請人】蘇州大學