一種納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物及其制備方法、用圖
【專利摘要】一種納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物及其制備方法、用途，涉及甲氨蝶呤衍生物的合成方法和用途技術領域。將4?(4,6?二甲氧基三嗪?2?基)?4?甲基嗎啉鹽酸鹽溶于硫酸軟骨素的水溶液，取得活化溶液，再將酸性甲氨蝶呤的水溶液與活化溶液混合，取得二次活化混合液，最后將二次活化混合液置于超純水中透析、凍干，取得納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物。本發制備方法簡單，成本低，產品可用于制備防治、阻止惡性腫瘤引起的溶骨性病變、治療高血鈣癥、減少骨吸收的注射劑。
【專利說明】
一種納米甲氨蝶昤的硫酸軟骨素衍生物及其制備方法、用途
技術領域
[0001 ]本發明涉及甲氨蝶呤衍生物，特別涉及一種甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物及其合 成方法和用途。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤已經成為一類嚴重危害人類身心健康的疾病，給社會帶來了沉重的經濟 負擔。我國近20年發病率上升了69%，每年新增癌癥發病例220萬，每五個死者中就有一個死 于癌癥。隨著我國物質生活水平提高帶來的飲食、生活方式、工作方式、人口老齡化等問題， 癌癥的發病率逐年升高。研究新的抗癌藥物以及減少現有抗癌藥物毒性是當前醫學研究的 熱點。
[0003] DNA和RNA的復制和修復需要利用四氫葉酸作為底物來完成這些重要的生物化學 反應。四氫葉酸在體內由葉酸還原酶還原葉酸來生物合成。甲氨蝶呤(MTX)是葉酸類似物， 是一類抗代謝類抗腫瘤藥物。MTX可以與葉酸還原酶結合，通過競爭性抑制阻斷四氫葉酸的 形成，從而抑制DNA、RNA、蛋白和胸苷酸的合成。甲氨蝶呤廣泛應用于絨毛膜上皮癌、惡性葡 萄胎、各類急性白血病、各種軟組織肉瘤、銀肩病等。也可以作為免疫抑制劑治療類風濕疾 病。大劑量的靜脈輸注甲氨蝶呤是病人化療的重要治療方案之一，但是大劑量的甲氨蝶呤 帶來的骨髓抑制，肝功能損害，腎功能損害以及黏膜損害仍然給臨床帶來了問題。
[0004] 下式為甲氨蝶呤的結構式：
硫酸軟骨素是(CS)是一類硫酸化的糖胺聚糖，廣泛分布于動物組織的細胞外基質和細 胞表面，主要分布于軟骨、骨、血管壁、肌腱和肌膜中。由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-半乳糖 以1，3糖苷鍵形成二糖單位，相對分子質量一般為25000~30000。就硫酸化程度、硫酸基和 兩種差異向異構糖醛酸再鏈內的分布來說，呈現高度的不均一性。硫酸軟骨素與多種蛋白 質分子的相互作用。硫酸軟骨素被用于治療骨關節炎、慢性膀胱炎、增強免疫功能、治療銀 雪病、抗凝血抗血栓、抗動脈粥樣硬化、保護和修復神經元、治療慢性神精炎癥，并且越來越 多的研究證明外源CS的攝入可以起到治療癌癥的作用。
[0005] 下式先硫釀餘魯麥的姑抝忒.
公開號為CN 104371009 A的專利又獻提供J 一柙GnKH多肱-甲m蝶呤偶聯物、其制 備方法及用途，該發明提供一種含有甲氨蝶呤的藥物組合物，增加藥物的靶向性。公開號為 CN 104667279 A的專利文獻通過佐劑聯合給藥來減少甲氨蝶呤的毒性。
[0006] 但是，這些現有技術存在原料成本高，工藝制作復雜，操作要求繁瑣等問題，因而 無法大規模生產。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于克服上述缺陷，研制一種硫酸軟骨素衍生物。
[0008] 本發明硫酸軟骨素衍生物是以甲氨蝶呤修飾的硫酸軟骨素的納米球，所述納米甲 氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的結構式為：
上式中，m為未連上甲氨蝶呤的硫酸軟骨素循環結構的量，m為20~300的整數;η為連上 甲氨蝶呤的硫酸軟骨素循環結構的量，η為22~150的整數。
[0009] 本發明可制成注射劑，對防治、治療絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、各類急性白血病、 各種軟組織肉瘤、銀肩病等疾病方面具有療效。本發明可以提高甲氨蝶呤在體內的通透性， 減少藥物對黏膜的刺激性，并且使甲氨蝶呤緩慢釋放，降低甲氨蝶呤在體內的副作用，改善 人體康復治療水平，提高患者用藥安全質量。
[0010] 本發明中所述硫酸軟骨素包括硫酸軟骨素 A( CS-A)、硫酸軟骨素 C( CS-C)、硫 酸軟骨素 D( CS-D)或硫酸軟骨素 E( CS-E)中的一種。這些具體材料為硫酸軟骨素的不同 取代基團。
[0011] 本發明還提出以上納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的制備方法。
[0012]本發明制備方法步驟是： 1) 將4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽溶于硫酸軟骨素的水溶液中，取 得活化溶液； 2) 將酸性甲氨蝶呤的水溶液與活化溶液混合，經磁力攪拌，取得二次活化混合液； 3) 將二次活化混合液置于超純水中透析、凍干，取得納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生 物。
[0013] 本發明以4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽為耦合劑，將硫酸軟骨 素中活化后的羧酸鈉和甲氨蝶呤中的氨基耦聯成酰胺鍵將二者結合，以使甲氨蝶呤修飾在 硫酸軟骨素上，形成納米球。
[0014] 本發明直接通過化學方法修飾甲氨蝶呤，該甲氨蝶呤改進型藥物不僅制備方法簡 單，成本低，原料簡單易得，對工藝要求低，可以大規模生產。
[0015] 為了在硫酸軟骨素上面連上更多的甲氨蝶呤，形成的納米粒可以包裹更多的藥 物，所述硫酸軟骨素和甲氨蝶呤的混合摩爾比為1:1~20。
[0016] 為了活化盡可能多的羧基基團，有利于連上更多的甲氨蝶呤，所述4-(4,6_二甲氧 基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽溶和甲氨蝶呤的混合摩爾比為1.2:1。
[0017] 為了盡可能快的透析出不需要的雜質，在透析前三次每2h換一下水，之后每4h換 一次水。
[0018] 為了活化盡可能多的羧基，所述步驟1)中，所述4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽與硫酸軟骨素的水溶液中硫酸軟骨素的混合摩爾比為1.2:1。
[0019] 本發明的第三個目的是：提出納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的應用，用于制 備防治、阻止惡性腫瘤引起的溶骨性病變、治療高血鈣癥、減少骨吸收的注射劑。
[0020] 該注射劑可以顯著降低腫瘤細胞的活力、抑制腫瘤細胞的增殖。
【附圖說明】
[0021 ]圖1為實施例1取得的納米粒分散在水中的原子力圖。
[0022]圖2為實施例2取得的納米粒分散在水中的原子力圖。
[0023] 圖3為甲氨蝶呤、甲氨蝶呤-硫酸軟骨素的濃度與腫瘤細胞活力的關系圖。
【具體實施方式】
[0024] 為了更加完整的介紹本發明的特點，下面結合具體實施案例進一步介紹由含氨基 的甲氨蝶呤和硫酸軟骨素反應生成的新型藥物及其制備方法和該藥物在絨毛膜上皮癌、惡 性葡萄胎、各類急性白血病、各種軟組織肉瘤、銀肩病方面的應用。
[0025] -、甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的制備： 實施例1: I、將1.0 g硫酸軟骨素溶于20mL超純水。
[0026] 將0.769g的4-(4,6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽溶于步驟（1)得到的 溶液，活化30min。
[0027] 2、將1.2g的甲氨蝶呤溶于IOmL的超純水，調節pH為酸性至完全溶解。
[0028] 3、將步驟(3)得到的溶液加入步驟(2)活化后的溶液中，置于磁力攪拌器攪拌反應 5h〇
[0029] 4、5h后將反應液倒入透析袋中，于超純水中透析48h，每4h換一次水。
[0030] 5、48h后將步驟(5)所得的透析袋中溶液凍干得到所要目標產物。
[0031] 6、對目標產物分析，其結構式如下：
上式中，m為:20~300的整數;η為:22~150的整數。
[0032] 實施例2: 1、將53.2mg硫酸軟骨素溶于5mL超純水。
[0033] 2、將40.91mg的4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽溶于步驟（1)得 到的溶液，活化30min。
[0034] 3、將63.84mg的甲氨蝶呤溶于5mL的超純水，調節pH為酸性至完全溶解。
[0035] 4、將步驟(3)得到的溶液加入步驟(2)活化后的溶液中，置于磁力攪拌器攪拌反應 6h〇
[0036] 5、6h后將反應液倒入透析袋中，于超純水中透析48h，每4h換一次水。
[0037] 6、48h后將步驟(5)所得透析袋中溶液凍干得到所要目標產物。
[0038] 7、對目標產物進行分析，分析其結構式如下：
上式中，m為：20~300的整數;η為：22~150的整數。
[0039]二、通過原子力顯微鏡驗證以上兩種實施例制成的產物： 如圖1、2所示，兩例制成的甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物納米球直徑約為200nm，為納 米級產物。
[0040] 三、應用： 1、制成納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物注射劑： 一種甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍物制備成的注射劑，包括PH 7.4的磷酸緩沖鹽溶液以及 分散于磷酸緩沖鹽溶液的納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物，其中納米甲氨蝶呤的硫酸軟 骨素衍生物的濃度為lmg/ml。
[0041 ] 2、應用及驗證結果： 為了驗證納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物對腫瘤細胞的抑制作用。以Hela細胞給予 甲氨蝶呤、甲氨蝶呤-硫酸軟骨素治療48小時，觀察細胞活力，并通過本領域眾所周知的MTT 實驗來計算細胞活力情況，得到圖3結果。
[0042] 圖3中，曲線"甲氨蝶呤"代表：曲線代表甲氨蝶呤不同濃度的給藥量抑制腫瘤細胞 的生長情況，細胞活力越低代表抑制效果越好。
[0043] 圖3中曲線"甲氨蝶呤-硫酸軟骨素"代表：曲線代表甲氨蝶呤一硫酸軟骨素不同濃 度的給藥量抑制腫瘤細胞的生長情況，細胞活力越低代表抑制效果越好。
[0044] 由圖3可以看出，采用本發明制備的納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物，制成納米 甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物注射劑可以顯著降低腫瘤細胞的活力、抑制腫瘤細胞的增 殖。
[0045] 可見，采用本發明制成的注射劑可用于防治、阻止惡性腫瘤引起的溶骨性病變、治 療高血鈣癥、減少骨吸收，或用于防治、治療絨毛膜上皮癌、惡性葡萄胎、各類急性白血病、 各種軟組織肉瘤、銀肩病等疾病。
【主權項】
1. 一種納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物，其特征在于所述硫酸軟骨素衍生物是以甲 氨蝶呤修飾的硫酸軟骨素的納米球，所述納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的結構式為：上式中，m為:20~300的整數;η為:22~150的整數。2. 根據權利要求1所述納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物，其特征在于，所述硫酸軟骨 素包括硫酸軟骨素 A( CS-A)、硫酸軟骨素 C( CS-C)、硫酸軟骨素 D( CS-D)或硫酸軟骨素 E( CS-E)中的一種。3. 如權利要求1所述納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的制備方法，其特征在于包括 以下步驟： 1)將4-(4，6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽溶于硫酸軟骨素的水溶液中，取 得活化溶液； 2 )將酸性甲氨蝶呤的水溶液與活化溶液混合，經磁力攪拌，取得二次活化混合液； 3)將二次活化混合液置于超純水中透析、凍干，取得納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生 物。4. 根據權利要求3所述納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的制備方法，其特征在于所 述硫酸軟骨素包括硫酸軟骨素 A( CS-A)、硫酸軟骨素 C( CS-C)、硫酸軟骨素 D( CS-D)或 硫酸軟骨素 E( CS-E)中的一種。5. 根據權利要求3或4所述納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的制備方法，其特征在于 所述硫酸軟骨素和甲氨蝶呤的混合摩爾比為1:1~20。6. 根據權利要求3或4所述納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的制備方法，其特征在于 所述4-(4,6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽溶和甲氨蝶呤的混合摩爾比為1.2: 1〇7. 根據權利要求3所述納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的制備方法，其特征在于在 透析過程中每2~6h換一次水。8. 根據權利要求3所述納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的制備方法，其特征在于所 述步驟1)中，所述4-(4,6_二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉鹽酸鹽與硫酸軟骨素的水溶液 中硫酸軟骨素的混合摩爾比為1.2:1。9.如權利要求1所述納米甲氨蝶呤的硫酸軟骨素衍生物的應用，用于制備防治、阻止惡 性腫瘤引起的溶骨性病變、治療高血鈣癥、減少骨吸收的注射劑。
【文檔編號】A61P3/14GK105859912SQ201610288963
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月5日
【發明人】朱沛志, 王進宇, 劉冠雄, 張文靜
【申請人】揚州大學