一種北沙參多糖及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種北沙參多糖及其制備方法和應用，涉及多糖類技術領域。北沙參多糖的分子量為26.3 kDa；北沙參多糖的單糖組成和摩爾比為：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖=2.05：1.00：7.06；并提供了北沙參多糖的一級結構重復單元。本發明北沙參多糖具有提取工藝簡單、組分純度高、抗腫瘤和抗氧化活性好、毒副作用小的優點，適用于抗氧化或抗腫瘤新藥的開發和應用。
【專利說明】
一種北沙參多糖及其制備方法和應用
技術領域
[0001]本發明涉及多糖類技術領域。
【背景技術】
[0002] 北沙參為傘形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.)，以根入 藥。北沙參味甘甜，是臨床常用的滋陰藥，養陰清肺，祛痰止咳。主治肺燥干咳、熱病傷津、口 渴等癥。主產于山東、河北、遼寧、內蒙古等地。別名萊陽參、海沙參、銀沙參、遼沙參、蘇條 參、條參、北條參。北沙參主要含香豆素類成分、佛手柑內酯、補骨脂素、花椒毒素及多糖等。 而多糖是其最主要的活性成分，總糖含量達70%以上。
【發明內容】
[0003] 本發明要解決的技術問題是提供一種北沙參多糖及其制備方法和應用，具有提取 工藝簡單、組分純度高、抗腫瘤和抗氧化活性好、毒副作用小的優點，適用于抗氧化或抗腫 瘤新藥的開發和應用。
[0004] 為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是:一種北沙參多糖，北沙參多糖 的分子量為26.3 kDa;北沙參多糖的單糖組成和摩爾比為：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05: 1.00:7.06;北沙參多糖的一級結構重復單元如下：
[0005] 上述北沙參多糖的制備方法，包括以下步驟： (1) 提取 取干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，除去含有的脂溶性化合物;藥材殘渣蒸餾水提 取，濃縮，加入無水乙醇沉淀，干燥后得北沙參粗多糖； (2) 分離和純化 a、 除蛋白； b、 除色素； c、 進一步分離和純化，得到所述的北沙參多糖。
[0006] 優選的，進一步分離和純化，包括： 1) 、透析:將除色素完畢的北沙參粗多糖裝入透析袋，分別用自來水、蒸餾水透析，透析 后袋內液冷凍干燥后得北沙參二級粗多糖； 2) 、離子交換柱層析:使用DEAE-cellulose 52纖維素柱層析對北沙參二級粗多糖進行 分離純化，收集，減壓濃縮、透析和冷凍干燥，得到北沙參精多糖； 3)、凝膠柱層析:使用葡聚糖凝膠Sephadex G-IOO柱層析對北沙參精多糖進行純化，收 集，得到組分單一的北沙參多糖。
[0007] 優選的，步驟（1)提取為：取干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，使用體積分數為 95%的食用乙醇提取，除去含有的脂溶性化合物;藥材殘渣揮干乙醇，加入蒸餾水提取，水提 液減壓濃縮，在攪拌條件下加入無水乙醇使最終乙醇體積含量為75-85%，在3_5°C下靜置 22-26 h，離心，收集沉淀，冷凍干燥后得北沙參粗多糖。
[0008] 進一步優選的，步驟(1)提取為:取干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，使用北沙參 6-10倍質量的體積分數為95%的食用酒精55-65 °C條件下提取2-3次，除去含有的脂溶性化 合物;藥材殘渣揮干乙醇，加入藥材殘渣18-22倍質量的蒸餾水，使用超聲功率200-300 W的 超聲波提取儀75-85°C條件下輔助提取15-20 min，然后在75-85°C恒溫下水浴提取2.5-3.5 h，過濾后重復提取2-3次，合并水提液，減壓濃縮至水提液體積的八分之一至十分之一;在 攪拌條件下加入無水乙醇使最終乙醇體積含量為75-85%，在3-5°C下靜置22-26 h，離心，收 集沉淀，冷凍干燥后得北沙參粗多糖。
[0009] 優選的，步驟(2)分離和純化中： a、 除蛋白為:將北沙參粗多糖溶于8-12倍質量的蒸餾水中，溫度調至45-55°C，保持25-35 min，緩慢加入木瓜蛋白酶，調pH值為6，攪拌1.5-2.5 h后，溫度調至85-95 °C，保持25-35 min，冷至室溫，離心，收集上清液，即北沙參粗多糖溶液，再使用Sevag法除蛋白，北沙參粗 多糖溶液中加入氯仿和正丁醇，北沙參粗多糖溶液、氯仿和正丁醇的體積比例為25:5:1;震 蕩15-25 min，靜置，離心，去掉下層的有機層和中間層的白色蛋白；重復萃取操作直至中間 層無白色蛋白出現，在紫外分光光度計下200-400 nm掃描，在260-280 nm之間無吸收，說明 除蛋白完全； b、 除色素為:除蛋白后的北沙參粗多糖溶液用HPD-100型大孔樹脂吸附色素;大孔樹脂 先用無水乙醇浸泡，清洗，然后用蒸餾水徹底清洗，充分溶脹;除蛋白后的北沙參粗多糖溶 液的毫升數和大孔樹脂的克數比例為12:1，靜態吸附12 h，抽濾，減壓濃縮，得到除色素的 北沙參粗多糖。
[0010] 優選的，步驟(2)分離和純化中：1)、透析:將除色素完畢的北沙參粗多糖裝入截留 量為3500 Da的透析袋，分別用自來水、蒸餾水透析48 h和24 h，透析后袋內液冷凍干燥后 得北沙參二級粗多糖。
[0011] 優選的，步驟(2)分離和純化中：2)、離子交換柱層析:使用DEAE-cellulose 52纖 維素柱層析對北沙參二級粗多糖進行分離純化，稱取北沙參二級粗多糖，使用北沙參二級 粗多糖95-105倍質量的蒸餾水溶解，過0.45 μπι的微孔濾膜過濾，上清液上樣于DEAE-cellulose 52 纖維素層析柱 ，分別使用蒸餾水和 0-0.8 M 的梯度 NaCl 溶液進行洗脫 ，流速設 定為0.5 mL/min，自動部分收集器收集，每管收集5.0 mL;苯酸-硫酸法跟蹤檢測北沙參多 糖的流出；以吸光度值為縱坐標，洗脫液管數為橫坐標繪制洗脫曲線，收集第二個洗脫主 峰，減壓濃縮、分別用自來水、蒸餾水透析48h和冷凍干燥，得到北沙參精多糖。
[0012] 優選的，步驟(2)分離和純化中：3)、凝膠柱層析:使用葡聚糖凝膠Sephadex G-100 柱層析對北沙參精多糖進行純化，稱取北沙參精多糖，用95-105倍質量蒸餾水溶解，過0.45 ym的微孔濾膜過濾，上清液上樣于Sephadex G-100層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速設定為 0.5 mL/min，自動部分收集器收集洗脫液，每管收集5.0 mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖的 流出；以吸光度值為縱坐標，洗脫液管數為橫坐標繪制洗脫曲線，收集第一個洗脫峰，得到 組分單一的北沙參多糖。
[0013]另一方面，本發明還提供了北沙參多糖在制備抗腫瘤藥物或抗氧化活性藥物中的 應用。
[0014]采用上述技術方案所產生的有益效果在于：本發明北沙參多糖具有提取工藝簡 單、組分純度高、抗腫瘤和抗氧化活性好、其對人肝癌細胞IfepG2的IC5q是43.26 yg/mL，毒副 作用小的優點，適用于抗氧化或抗腫瘤新藥的開發和應用。
【附圖說明】
[0015] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明； 圖1是本發明北沙參多糖Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析洗脫曲線圖； 圖2是本發明北沙參多糖的紫外-可見掃描圖（700-200 nm); 圖3是本發明北沙參多糖的紅外譜圖； 圖4 A是本發明北沙參多糖的核磁譜圖（1H-13C HSQC); 圖4 B是本發明北沙參多糖的核磁譜圖（1H-13C HMBC); 圖5是本發明北沙參多糖的抗氧化活性(清除DPPH自由基)結果圖； 圖6是本發明北沙參多糖的抗氧化活性(螯合Fe2+)結果圖； 圖7是本發明北沙參多糖對人肝癌細胞HepG2的抑制活性(丨，_ n=：3〕圖； 圖8是本發明北沙參多糖抑制S18q荷瘤小鼠腫瘤生長實驗各組腫瘤組織圖； 圖9是本發明S18q荷瘤小鼠體重變化曲線圖。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1 一種北沙參多糖，北沙參多糖的分子量為26.3 kDa;北沙參多糖的單糖組成和摩爾比 為：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05:1.00:7.06;北沙參多糖的一級結構重復單元如下：
[0017] 上述北沙參多糖的制備方法，包括以下步驟： (1)提取 取干燥的河北道地藥材北沙參500 g，粉碎，使用北沙參7.89倍質量的體積分數為95% 的食用酒精60°C條件下提取2次，除去含有的脂溶性化合物;藥材殘渣揮干乙醇，加入藥材 殘渣20倍質量的蒸餾水，使用超聲功率260 W的超聲波提取儀80°C條件下輔助提取15 min， 然后在80°C恒溫下水浴提取3 h，過濾后重復提取2次，合并水提液，使用旋轉蒸發儀減壓濃 縮至水提液體積的十分之一;在攪拌條件下加入無水乙醇使最終乙醇體積含量為80%，在4 °C下靜置24 h，5000rpm條件下離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥后得北沙參粗多糖。
[0018] (2)分離和純化 a、除蛋白：將北沙參粗多糖溶于10倍質量的蒸餾水中，溫度調至50°C，保持30 min，緩 慢加入木瓜蛋白酶，調pH值為6，攪拌2 h后，溫度調至90°C，保持30 min，冷至室溫，5000rpm 離心15 min，收集上清液，即北沙參粗多糖溶液;北沙參粗多糖溶液使用Sevag法除蛋白，北 沙參粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇，北沙參粗多糖溶液、氯仿和正丁醇的體積比例為25: 5:1;劇烈震蕩20 min，靜置，用離心機5000rpm離心15 min，去掉下層的有機層和中間層的 白色蛋白；重復萃取操作5次，直至中間層無白色蛋白出現，在紫外分光光度計下200-400 nm掃描，在260-280 nm之間無吸收，說明除蛋白完全。
[0019] b、除色素:除蛋白后的北沙參粗多糖溶液用HPD-100型大孔樹脂(滄州寶恩吸附材 料科技有限公司）吸附色素;大孔樹脂先用無水乙醇浸泡，清洗，然后用蒸餾水徹底清洗，充 分溶脹;除蛋白后的北沙參粗多糖溶液的毫升數和大孔樹脂的克數比例為12: l(v/w)，靜態 吸附12 h，抽濾，減壓濃縮，得到除色素的北沙參粗多糖。
[0020] C、進一步分離和純化，包括： 1)、透析:將除色素完畢的北沙參粗多糖裝入截留量為3500 Da的透析袋，分別用自來 水、蒸餾水透析48 h和24 h，透析后袋內液冷凍干燥后得北沙參二級粗多糖。
[0021 ] 2)、離子交換柱層析:使用DEAE-Cellulose 52纖維素(瑞典Pharmacia公司）柱層 析對北沙參二級粗多糖進行分離純化，稱取北沙參二級粗多糖，使用北沙參二級粗多糖100 倍質量的蒸餾水溶解，過0.45 μπι的微孔濾膜過濾，上清液上樣于DEAE-cellulose 52纖維 素層析柱，分別使用蒸餾水和梯度NaCl溶液(0-0.8 M)的進行洗脫，流速設定為0.5 mL/ min，自動部分收集器收集，每管收集5.0 mL;苯酚-硫酸法跟蹤檢測北沙參多糖的流出；以 吸光度值為縱坐標，洗脫液管數為橫坐標繪制洗脫曲線，收集第二個洗脫主峰，減壓濃縮、 透析和冷凍干燥，得到北沙參精多糖。
[0022] 3)、凝膠柱層析:使用葡聚糖凝膠Sephadex G-100(瑞典Pharmacia公司）柱層析對 北沙參精多糖進行純化，稱取北沙參精多糖，用100倍質量蒸餾水溶解，過〇.45 μπι的微孔濾 膜過濾，上清液上樣于Sephadex G-100層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速設定為0.5 mL/ min，自動部分收集器收集洗脫液，每管收集5.0 mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖的流出；以 吸光度值為縱坐標，洗脫液管數為橫坐標繪制洗脫曲線，收集第一個洗脫峰，得到組分單一 的北沙參多糖。
[0023] 實施例2 北沙參多糖的純度驗證： 經過旋光度法、紫外-可見光譜掃描法、凝膠柱層析(GPC)法驗證北沙參多糖的純度，結 果表明北沙參多糖為均一性良好的精多糖。在常溫下(20°C)，在水中具有良好的溶解性，不 溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑。
[0024]旋光度法驗證北沙參多糖的純度:經分離純化后的北沙參多糖醇沉所得的20%和 40%乙醇沉淀物水溶液，測定其旋轉角，計算其比旋光度，數值基本恒定，平均值為[(?^=-20.60° (c = 0.5 mg/mL，H2O)，表明純化后多糖樣品均一性良好。
[0025]凝膠柱層析(GPC)法驗證北沙參多糖的純度：見圖1所示，由圖1洗脫曲線圖可知， 分離純化后的北沙參多糖在Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析中獲得單一、對稱的洗脫峰。 [0026]紫外-可見光譜掃描法驗證北沙參多糖的純度：見圖2所示，由圖2可知，在700 - 200 nm處，北沙參多糖的掃描曲線呈平滑曲線，并無明顯的蛋白及核酸雜質吸收。
[0027] 實施例3 北沙參多糖的結構表征 采用完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化-Smith降解、甲基化反應等化學分析方法； 紅外光譜、氣質聯用、高效離子色譜、核磁共振等儀器分析技術，表征了北沙參多糖的化學 結構。
[0028] (1)北沙參多糖分子量的測定 采用凝膠滲透過濾法(GPC)測定多糖分子量，分別稱取1.0 mg標準葡聚糖T4、T7、T10、 丁40、了70、了200，溶解于1.0 11^蒸餾水中，分別上凝膠柱56口1^(^7 3-300冊（1.6\90.0 cm)，以蒸餾水作洗脫液，調節流速為0.3 mL/min，自動部分收集器收集每管0.6 mL，用苯 酚-硫酸法檢測樣品出峰液分布，計算各標準葡聚糖出峰的洗脫體積Ve，通過已知分子量為 200萬的藍葡聚糖來確定凝膠柱的空體積Vo,通過無水葡萄糖來確定凝膠柱的總柱體積Vt。 以有效分配系數(Kav)為縱坐標，以IgMw為橫坐標作標準曲線，分配系數Kav由以下公式求 得：
式中：Ve:待測樣品的洗脫體積;Vo:凝膠層析柱的空體積;Vt:凝膠柱層析柱的總體 積。
[0029] 精確稱取北沙參多糖樣品2.0 mg，溶于2.0 mL洗脫液，上Sephacry S-300 HR凝膠 層析柱，同上法測定多糖的分子量分布，根據所得的多糖樣品的出峰洗脫體積，代入上述標 準曲線中，計算出樣品的分子量為26.3 kDa。
[0030] (2)北沙參多糖的單糖組成 取北沙參多糖樣品使用三氟乙酸完全酸水解后，進行HPAEC-PAD測定，經與標準單糖的 高效離子色譜保留時間對照，并根據各峰的保留時間和峰面積比計算出各單糖的組成和摩 爾比，為鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05:1.00:7.06。
[0031] (3)北沙參多糖的紅外圖譜如圖3所示： 由圖3可知:3436、2961、1641 ^413^0770^1為多糖的特征吸收峰。
[0032] (4)北沙參多糖的核磁共振圖譜如圖4A、圖4B所示： 采用化學分析法（如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化-Smith降解、甲基化等）以 及儀器分析方法（如紫外光譜、紅外光譜、核磁共振、氣相色譜、氣質聯用、高效離子色譜 等)對多糖的初級結構進行表征，得到北沙參多糖的一級結構重復單元如下：
結構式中，A、B、C、D、E是代表對應核磁共振圖譜（圖4A、圖4B)上面的吸收峰的符號。
[0033] 實施例4 北沙參多糖的抗腫瘤和抗氧化活性： 考察了北沙參多糖體外抗氧化活性，包括清除DPPH自由基活性和鐵離子螯合能力測定 兩個實驗： (I)DPPH自由基清除活性 稱取20.0 mg的DPPH試劑，加入無水乙醇溶解，用250 mL容量瓶定容至刻度，得到濃度2 X10-4 mol/L的DPPH溶液(4°C冰箱保存），96孔酶標板中，加入190 yL· DPPH，10 yL不同濃度 的抗壞血酸(維生素 C，Vc)以及樣品（水溶，設終濃度梯度為1600、800、400、200、100、50、25、 〇 yg/mL)，反應總體積為200 yL，混合均勻后避光，水平搖床上振搖反應30 min，測定在490 nm波長下吸光度值的變化，每個濃度設3組平行，取平均值。對DPPH自由基的抑制率按下列 公式進行計算：
其中，A1為樣品溶液+DPPH溶液;A2為樣品溶液+無水乙醇;Ao為DPPH溶液+無水乙醇。 [0034]實驗結果如圖5所示。
[0035] (2)Fe2+螯合作用測試 取0.8 mL不同濃度的北沙參多糖樣品水溶液，加入氯化亞鐵溶液，渦旋均勻，然后加螯 合劑Ferroizine，混勾后于562 nm處測定吸光度值。然后取超純水代替北沙參多糖樣品水 溶液，加入氯化亞鐵和Ferroizine，混勾后在室溫下放置10 min，于562 nm處測定吸光度 值，作為空白對照組，乙二胺四乙酸(EDTA)作為陽性對照品。螯合作用計算公式如下： 鐵離子螯合能力(％) = (A空白-A樣品)/A空白X 100% 實驗結果如圖6所示。
[0036]從兔和圖6結果顯示:在25到1600yg/mL的濃度范圍內，北沙參多糖具有較強的體 外抗氧化作用，并且呈現出良好的量效關系。
[0037] (3)體外抗腫瘤活性測試 人肝癌細胞HepG2 (購于中山大學醫學院細胞庫），采用MTT實驗檢測法，即將處于對數 生長期的腫瘤細胞，制成含有細胞3-4 X IO3個/mL單細胞懸液，分別接種于無菌的96孔板 中，100 UL/孔。置于5% C02,37°C培養箱中，培養12 h。設空白對照組(加等體積RPMI1640培 養液）、陽性對照組(順鉑)和給藥組，每個濃度組3個復孔，加入藥物，每孔總反應體積為200 μL。將其置5% CO2培養箱中，37°C培養48 h，實驗終止前4 h加入20 uL的MTT(5.0 mg/mL)， 繼續培養4 h。棄去上清液，加入二甲基亞砜200 μL7孔，置于振蕩儀上振蕩10 min，用酶標 儀于波長570 nm處測定吸光度值A57〇,按下列公式求出生長抑制率。
[0038] 生長抑制率(％)=(1 -給藥組A57Q值/對照組A57〇)X100 使用人肝癌細胞HepG2細胞株檢測了北沙參多糖的體外抗腫瘤活性，見圖7所示，由圖7 可知，北沙參多糖具有較強的抗腫瘤活性，其對人肝癌細胞IfepG2的IC5q是43.26 yg/mL。
[0039] (4)體內抗腫瘤活性測試 實驗動物為昆明小鼠，雄性，體重18-22g。購于中山大學實驗動物中心，許可證號:SCXK (粵）2011-0029。
[0040] 小鼠飼養于中山大學實驗動物中心。攝食專用飼料，自由飲水。光照黑暗各12 h， 室溫20~24°C，相對濕度40%~70%。每盒6只，每周更換2次墊底木肩，每周消毒2次給水瓶， 每日更換新鮮無菌水。適應性飼養7 d后進行實驗。
[0041 ] a腫瘤模型建立 1)細胞復蘇、接種 從液氮罐中取出Si8〇凍存細胞，37°C速融，轉移入離心管中離心，800 rpmX 5 min，離 心完畢棄上清。加入I3BS緩沖液重懸后離心800 rpm X 5 min，離心完畢棄上清，重復一次。 加入PBS緩沖液重懸，臺盼藍染液染色后細胞計數。調整細胞濃度為3 X IO7 cells/ml。于超 凈工作臺中按0.2 ml/只接種于昆明小鼠腹腔。
[0042] 2)腫瘤細胞小鼠體內傳代 10 d后，腹水形成。抽取小鼠腹水，臺盼藍染液染色后細胞計數。調整細胞濃度為2 X IO7個/ml。于超凈工作臺中按0.2 ml/只接種于昆明小鼠腹腔。傳代兩次后建立實驗動物腫 瘤模型。
[0043] 3)建立實驗動物腫瘤模型 取接種8 d生長良好的S18q小鼠，消毒其腹部皮膚，用無菌注射器抽吸腹水，生理鹽水二 倍稀釋，瘤細胞懸液為乳白色半透明狀態，臺盼藍染色后用血球計數板在倒置式顯微鏡下 計數，活細胞數為98%以上，調整細胞濃度為2 X IO7個/ml。無菌條件下接種細胞懸液于小鼠 右前肢腋下，每只0.2 ml。
[0044] b實驗分組和給藥 將40只接種S18q細胞的小鼠稱重，隨機分為4組：空白對照組、陽性對照組（環磷酰 胺，CTX)、北沙參多糖低劑量組、北沙參多糖高劑量組，每組10只。
[0045] 接種24 h后，開始給藥，給藥容積為0.2 ml/10g。陽性對照組CTX劑量為25 mg/kg， 參照云芝多糖給藥劑量200 mg/kg，設定北沙參多糖低、高劑量組分別為100、400 mg/kg，空 白對照組給予等量的0.5% CMC溶液，除陽性對照組腹腔注射給藥外，其他三組灌胃給藥。每 天固定時間給藥1次并記錄小鼠體重及活動情況，連續10 d。
[0046] c抑瘤率和臟器指數的計算 末次給藥24 h后稱體重，計算體重增加值;頸椎脫白處死小鼠，剖取瘤塊、脾臟及胸腺 并稱重，計算抑瘤率、脾臟指數及胸腺指數。公式如下： 抑瘤率(％) =(空白組瘤重-給藥組瘤重)/空白組瘤重X 1 〇〇% 脾臟指數=小鼠脾重(mg)/小鼠體重(g) 胸腺指數=小鼠胸腺重(mg)/小鼠體重(g)。
[0047] d統計方法 所有數據均以均數土標準差丨:如)：表示。t檢驗采用SPSS11.5統計軟件包完成，以 p〈0.05表示具有統計學意義。
[0048] e實驗結果 北沙參多糖對小鼠 S18O移植瘤的生長抑制作用，見表1所示：
::注r;與空:白鄉照:組1?較，Cl.賅,，〇Jl·。 利用S18Q荷瘤小鼠模型對北沙參多糖體內抗腫瘤作用進行初步研究。實驗結果表明：空 白對照組平均瘤重大于lg，陽性對照藥環磷酰胺顯著抑制&80移植瘤的生長，其瘤重與空白 對照組比較具有顯著性差異(P〈〇. 01);北沙參多糖高低劑量組的抑瘤率分別為33.1%和 20.7%，其中高劑量組瘤重與空白對照組比較具有明顯差異(p〈0.05)。各組腫瘤組織見圖8 所示。
[0049] 北沙參多糖對Siso荷瘤小鼠體重的影響見圖9所示。
[0050] 如圖9所示:在給藥過程中，陽性對照環磷酰胺組小鼠體重增加緩慢。而北沙參多 糖對S18q荷瘤小鼠的體重無顯著影響。
[0051] 北沙參多糖對S18q荷瘤小鼠免疫器官指數的影響，見表2所示： 由表2可知：與空白對照組相比，陽性對照藥環磷酰胺顯著減小S18q荷瘤小鼠的脾臟指 數和胸腺指數(P〈〇. 01 )，而北沙參多糖對318〇荷瘤小鼠的脾臟指數和胸腺指數無顯著影響。 :閨:與_自頻纖_
[0052] 本發明北沙參多糖具有提取工藝簡單、組分純度高、抗腫瘤和抗氧化活性好、其對 人肝癌細胞HepG2的IC5q是43.26 yg/mL，毒副作用小的優點，適用于抗氧化或抗腫瘤新藥的 開發和應用。
【主權項】
1. 一種北沙參多糖，其特征在于:所述北沙參多糖的分子量為26.3 kDa;北沙參多糖的 單糖組成和摩爾比為：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05:1.00:7.06;北沙參多糖的一級結構重 復單元如下：2. 如權利要求1所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 提取 取干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，除去含有的脂溶性化合物；藥材殘渣蒸餾水提 取，濃縮，加入無水乙醇沉淀，干燥后得北沙參粗多糖； (2) 分離和純化 a、 除蛋白； b、 除色素； c、 進一步分離和純化，得到所述的北沙參多糖。3. 根據權利要求2所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，所述進一步分離和 純化，包括： 1) 、透析:將除色素完畢的北沙參粗多糖裝入透析袋，分別用自來水、蒸餾水透析，透析 后袋內液冷凍干燥后得北沙參二級粗多糖； 2) 、離子交換柱層析:使用DEAE-cellulose 52纖維素柱層析對北沙參二級粗多糖進行 分離純化，收集，減壓濃縮、透析和冷凍干燥，得到北沙參精多糖； 3) 、凝膠柱層析:使用葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析對北沙參精多糖進行純化，收 集，得到組分單一的北沙參多糖。4. 根據權利要求2所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(1)提取為:取 干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，使用體積分數為95%的食用乙醇提取，除去含有的脂溶 性化合物;藥材殘渣揮干乙醇，加入蒸餾水提取，水提液減壓濃縮，在攪拌條件下加入無水 乙醇使最終乙醇體積含量為75-85%，在3-5°C下靜置22-26 h，離心，收集沉淀，冷凍干燥后 得北沙參粗多糖。5. 根據權利要求4所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(1)提取為:取 干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，使用北沙參6-10倍質量的體積分數為95%的食用酒精 55-65Γ條件下提取2-3次，除去含有的脂溶性化合物；藥材殘渣揮干乙醇，加入藥材殘渣 18-22倍質量的蒸餾水，使用超聲功率200-300 W的超聲波提取儀75-85°C條件下輔助提取 15-20 min，然后在75-85 °C恒溫下水浴提取2.5-3.5 h，過濾后重復提取2-3次，合并水提 液，減壓濃縮至水提液體積的八分之一至十分之一;在攪拌條件下加入無水乙醇使最終乙 醇體積含量為75-85%，在3-5 °C下靜置22-26 h，離心，收集沉淀，冷凍干燥后得北沙參粗多 糖。6. 根據權利要求2所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(2)分離和純 化中： a、 除蛋白為:將北沙參粗多糖溶于8-12倍質量的蒸餾水中，溫度調至45-55°C，保持25-35 min，緩慢加入木瓜蛋白酶，調pH值為6，攪拌1.5-2.5 h后，溫度調至85-95 °C，保持25-35 min，冷至室溫，離心，收集上清液，即北沙參粗多糖溶液，再使用Sevag法除蛋白，北沙參粗 多糖溶液中加入氯仿和正丁醇，北沙參粗多糖溶液、氯仿和正丁醇的體積比例為25:5:1;震 蕩15-25 min，靜置，離心，去掉下層的有機層和中間層的白色蛋白；重復萃取操作直至中間 層無白色蛋白出現，在紫外分光光度計下200-400 nm掃描，在260-280 nm之間無吸收，說明 除蛋白完全； b、 除色素為:除蛋白后的北沙參粗多糖溶液用HPD-100型大孔樹脂吸附色素;大孔樹脂 先用無水乙醇浸泡，清洗，然后用蒸餾水徹底清洗，充分溶脹;除蛋白后的北沙參粗多糖溶 液的毫升數和大孔樹脂的克數比例為12:1，靜態吸附12 h，抽濾，減壓濃縮，得到除色素的 北沙參粗多糖。7. 根據權利要求3所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(2)分離和純 化中：1)、透析:將除色素完畢的北沙參粗多糖裝入截留量為3500 Da的透析袋，分別用自來 水、蒸餾水透析48 h和24 h，透析后袋內液冷凍干燥后得北沙參二級粗多糖。8. 根據權利要求3所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(2)分離和純 化中：2)、離子交換柱層析:使用DEAE-cellulose 52纖維素柱層析對北沙參二級粗多糖進 行分離純化，稱取北沙參二級粗多糖，使用北沙參二級粗多糖95-105倍質量的蒸餾水溶解， 過0.45 μπι的微孔濾膜過濾，上清液上樣于DEAE-cellulose 52纖維素層析柱，分別使用蒸 餾水和0-0.8 Μ的梯度NaCl溶液進行洗脫，流速設定為0.5 mL/min，自動部分收集器收集， 每管收集5.0 mL;苯酚-硫酸法跟蹤檢測北沙參多糖的流出；以吸光度值為縱坐標，洗脫液 管數為橫坐標繪制洗脫曲線，收集第二個洗脫主峰，減壓濃縮、分別用自來水、蒸餾水透析 48h和冷凍干燥，得到北沙參精多糖。9. 根據權利要求3所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(2)分離和純 化中：3)、凝膠柱層析:使用葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析對北沙參精多糖進行純化， 稱取北沙參精多糖，用95-105倍質量蒸餾水溶解，過0.45 μπι的微孔濾膜過濾，上清液上樣 于Sephadex G-100層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速設定為0.5 mL/min，自動部分收集器收 集洗脫液，每管收集5.0 mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖的流出；以吸光度值為縱坐標，洗脫 液管數為橫坐標繪制洗脫曲線，收集第一個洗脫峰，得到組分單一的北沙參多糖。10. 如權利要求1所述的一種北沙參多糖的應用，其特征在于，北沙參多糖在制備抗腫 瘤藥物或抗氧化活性藥物中的應用。
【文檔編號】A61P39/06GK105859903SQ201610280824
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】景永帥, 張丹參, 吳蘭芳, 戎欣玉
【申請人】河北科技大學