一種人源抗菌肽ll-37突變體及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種人源抗菌肽LL?37突變體及其應用，通過對抗菌肽LL?37分子結構進行優化設計，將抗菌肽LL?37中的1號位亮氨酸、3號位甘氨酸、16號位谷氨酸、26號位天冬氨酸、34號位精氨酸、35號位蘇氨酸分別替換成：甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、蘇氨酸、精氨酸，實驗結果證明突變體具有優良的抗菌活性和穩定性；本發明主要用于（a）抑制細菌、病毒的生長繁殖及腫瘤細胞的增殖；或（b）殺滅細菌、病毒。
【專利說明】
一種人源抗菌肽LL-37突變體及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物醫藥技術領域，具體是一種人源抗菌肽LL-37突變體及其應用。
【背景技術】
[0002] 抗菌肽是生物體天然免疫的重要組成成分，自發現以來，由于其分子量低、抗菌譜 廣，抗菌機制獨特而顯示了其在醫學和農業上潛在的研究價值和應用價值，其研究及應用 已成為抗菌生物技術藥物領域的研究熱點。
[0003] 目前用于開發抗菌肽生物制劑主要是含有生物活性核心區域的內源性抗菌肽，此 類多肽用于藥品和食品領域，主要存在以下問題:①要解決藥效動力學、毒理學、以及潛在 的免疫毒性問題;②抗菌肽分子小，容易被蛋白酶降解，其穩定性有待提高;③小分子物質 的分離、純化困難;④抗菌肽的天然資源有限，依靠化學合成抗菌肽成本較高，而通過基因 工程在微生物體內直接表達基因，要解決提高抗菌肽生產效率、降低成本等問題;⑤與傳統 的抗生素相比，抗菌肽的抗菌活性還不夠理想，需要對抗菌肽做改良設計以提高其抗菌活 性。
[0004] 抗菌肽LL-37是來源于人的一種α-螺旋型陽離子抗菌肽，它具有廣譜抗菌活性，可 以抗多種革蘭氏陽性菌、陰性菌和真菌，而且還可通過免疫調節、促進創傷修復、誘導血管 生成等，是人體固有免疫防御系統的重要組成部分。文獻《The lipid A palmitoyltransferase PagP: molecular mechanisms and role in bacterial pathogenesis》和《Biofilms formed by gram-negative bacteria undergo increased lipid a palmitoylation，enhancing in vivo survival》中指出革蘭氏陰性菌細胞外膜 的棕櫚酰轉移酶PagP被激活后通過對脂質A酰化，修復細菌外膜通透性從而產生對抗菌肽 的抗性。
[0005] 目前，抗生素濫用導致的藥物殘留和細菌耐藥等問題越來越受到人們的重視，細 菌對傳統抗生素產生耐藥性已成為亟待解決的全球性問題。因此，通過抑制脂質A酰化這一 途徑，研發新的抗菌藥物，是本發明課題研究的重要內容。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的就是針對細菌耐藥性的問題，對抗菌肽LL-37進行優化設計，提供一 種抗菌活性更好、穩定性高的抗菌肽LL-37的突變體及其應用。
[0007] 本發明的一種人源抗菌肽LL-37突變體，所述序列中第一個氨基酸為甘氨酸(G)， 第三個氨基酸為亮氨酸(L)，第十六個氨基酸為谷氨酰胺(Q)，第二十六個氨基酸為賴氨酸 (K)，第三十四個氨基酸為蘇氨酸(T)，第三十五個氨基酸為精氨酸(R)，其它氨基酸殘基序 列不變。
[0008] 本發明的一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼的多肽與人源抗菌肽LL-37相 比，人源抗菌肽LL-37中的1號位亮氨酸、3號位甘氨酸、16號位谷氨酸、26號位天冬氨酸、34 號位精氨酸、35號位蘇氨酸被分別替換成:甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、蘇氨酸、精氨 酸。
[0009] 本發明的一種載體，所述載體中含有上述的多核苷酸。
[0010] 本發明的一種遺傳工程化的宿主細胞，所述宿主細胞中含有上述載體。
[0011] 本發明的一種人源抗菌肽LL-37突變體蛋白的合成方法，包括以下步驟： (1) 利用蛋白質在線分析工具ExPasy、序列對比軟件MEGA software、蛋白質分析軟件 Antheprot、分子對接軟件autodock和動力學模擬軟件ADF2014 (Amsterdam Density Functional)對抗菌肽LL-37的核酸序列進行分析，為抗菌肽LL-37突變體設計提供理論基 礎； (2) 在抗菌肽LL-37突變體的兩端引入限制性酶切位點，通過酶切操作連接到酵母表達 載體上； (3) 將表達載體轉化導入GS115酵母菌中，經提取后鑒定得到重組基因工程菌； (4) 重組基因工程菌經誘導表達后離心分離收集上清液，經分離純化獲得重組抗菌肽 LL-37突變體蛋白。
[0012] 本發明中所述抗菌肽LL-37突變體基因前端加上組氨酸標簽并引入限制性內切酶 EcoR的酶切位點，后端加上一個終止密碼子并引入限制性內切酶XbaI的酶切位點。
[0013] 本發明中所述載體為pP I CZaA。
[0014] 本發明中所述酵母菌為畢赤酵母。
[0015] 本發明中所述分離純化方法為現有技術鹽析、沉淀、液相層析技術和透析的結合。
[0016] 本發明所述的突變體用于(a)抑制細菌、病毒的生長繁殖及腫瘤細胞的增殖;或 (b)殺滅細菌、病毒。
[0017] 本發明是基于抗菌肽LL-37不同長度的水解片段具有較好的生物學活性，以革蘭 陰性菌細胞膜棕櫚酰轉移酶PagP的耐藥機制為基礎，陽離子抗菌肽通過細菌PhoP-PhoQ調 節系統調控調控細胞膜棕櫚酰轉移酶PagP表達與活性，促進脂質A酰化，進而影響陽離子抗 菌肽與細菌細胞膜的結合，抑制抗菌肽活性。以該途徑為突破口，結合α-螺旋型陽離子抗菌 肽兩親性、α-螺旋程度等因素對抗菌肽LL-37的氨基酸殘基進行替換、增減等方式，重新設 計，獲得突變體的氨基酸序列和核苷酸序列。
[0018] 選取大腸埃希菌Escherichia coli (strain K12)細胞細胞膜棕櫚酰轉移酶PagP 作為受體，參見附圖1，以抗菌肽LL-37及其氨基酸殘基為配體，參見附圖2，進行分子對接和 動力學模擬。
[0019] 選取抗菌肽LL-37 5位苯丙氨酸到32位纈氨酸中間部位的氨基酸片段作為配體， 受體選取棕櫚酰轉移酶PagP外膜外側。使用AutoDock對抗菌肽LL-37片段與棕櫚酰轉移酶 PagP進行分子對接，設定格點空間大小為60*60*60 A3，坐標為（7.063，32.452，49.199)，采 用拉馬克遺傳算法對接。
[0020] 通過對接發現抗菌肽LL-37與棕櫚酰轉移酶PagP的結合位點，參見附圖3,包括抗 菌肽LL-37中的GLUl I，LEU28、LYS12、PHE27、ILE13和PHE6，棕櫚酰轉移酶PagP中的ARG94， TRP89，ASN65，SER3，GLU90、GLU90，ASN100、HIS102和THR92。重復多次對接后確定最好的對 接構象，對應的配體效率值見表1。 表i抗翦片段與櫬瘸露轉移駿為威、.對禳的梁體效率值、.
[0021] 從上表1可以看出，8種LL-37片段作為配體與受體對接時，配體效率從_1.6100~ -2.2389Kcal/mol，為后續LL-37突變體的設計奠定了實驗基礎。
[0022] 利用ADF2014 (Amsterdam Density Functional)軟件，米用ReaxFF方法，首先對 抗菌肽LL-37和棕櫚酰轉移酶PagP進行優化，獲得最小能量結構下的原子位置和晶格參數。 然后，設定ReaxFF模擬參數與條件，在100*100*100 A3的周期性空間內，采用隨機均勻的方 式放入4個抗菌肽LL-37分子和1個棕櫚酰轉移酶PagP分子，溫度設定為室溫298K，采用 Velocity Verlet(NVT)系綜，進行0皮秒內的內部壓力弛豫分析，使溫度和壓力在預定值附 近波動，經過不同時間節點，分析體系構象。在對產物的識別分析中，為研究分子的性質，采 用密度泛函理論(使用PBE-D3(BJ)泛函，TZ2P基組)計算分子間鍵能。
[0023] ReaxFF方法模擬表明： 在〇皮秒時，體系呈周期性地隨機分布于單元為100*100*100 A3的空間內，分子之間的 最短距離不小于2.5埃。
[0024]體系經過8.75皮秒時，由于LL-37與棕櫚酰轉移酶PagP的疏水基團互相融合發生 接觸，參見圖4,其中球形原子為LL-37與PagP發生接觸的原子，結構圖中紅色、藍色、白色、 灰色小球分別表示0、N、H、C原子，左邊區域來自抗菌肽LL-37，右邊區域來自棕櫚酰轉移酶 PagP0
[0025]體系經歷20皮秒，沒有觀察到解離的趨勢，此時計算弱鍵-C-O-H…NH2-CH2-的鍵 能為 _14 · 97kcal/mol。
[0026]上述研究結果表明，抗菌肽LL-37與大腸埃希菌外膜上的棕櫚酰轉移酶PagP發生 接觸的原子構象比較穩定，其弱鍵-C-O-H…NH2-CH2-的鍵能達到-14.97kcal/mol，該鍵是連 接抗菌肽LL-37與棕櫚酰轉移酶PagP的重要橋梁，其中-NH 2來自抗菌肽LL-37分子的中部， 在抗菌肽LL-37彎折攀爬到棕櫚酰轉移酶PagP表面之后，-NH2基團被帶到了接觸區域，進而 形成穩定的化學鍵。
[0027]因此，抗菌肽LL-37分子結構的柔性，分子中的氨基在抗菌肽發揮抗菌活性的過程 中扮演了重要角色，同時為抗菌肽LL-37突變體設計提供了可靠的理論基礎。
【附圖說明】
[0028] 圖1大腸埃希菌Escherichia coli (strain K12)細胞細胞膜棕櫚酰轉移酶PagP 3D模式圖； 圖2抗菌肽hCAP-18/LL-37 3D模式圖； 圖3抗菌肽LL-37片段與棕櫚酰轉移酶PagP結合位點； 圖4體系經過8.75皮秒后抗菌肽LL-37與棕櫚酰轉移酶PagP的"糾纏"結構； 圖5抗菌肽LL-37及其突變體的親疏水性氨基酸分布和螺旋圖（左邊:抗菌肽LL-37;右 邊:LL-37突變體）； 圖6抗菌肽LL-37突變體的色譜圖； 圖7抗菌肽LL-37突變體的質譜圖； 圖8抗菌肽LL-37及其突變體對臨床1號菌株的抗菌活性圖； 圖9抗菌肽LL-37及其突變體對臨床2號菌株的抗菌活性圖； 圖10抗菌肽LL-37及其突變體對臨床3號菌株的抗菌活性圖； 圖11抗菌肽LL-37及其突變體對臨床4號菌株的抗菌活性圖； 圖12抗菌肽LL-37及其突變體對臨床5號菌株的抗菌活性圖； 圖13抗菌肽LL-37及其突變體對臨床6號菌株的抗菌活性圖； 圖14抗菌肽LL-37及其突變體對臨床7號菌株的抗菌活性圖； 圖15抗菌肽LL-37及其突變體對臨床8號菌株的抗菌活性圖； 圖16抗菌肽LL-37及其突變體對臨床9號菌株的抗菌活性圖； 圖17抗菌肽LL-37及其突變體對臨床10號菌株的抗菌活性圖； 圖18抗菌肽LL-37及其突變體對臨床11號菌株的抗菌活性圖； 圖19抗菌肽LL-37及其突變體對ATCC25922菌株的抗菌活性圖； 圖20抗菌肽LL-37及其突變體對ATCC35218菌株的抗菌活性圖； 圖21抗菌肽LL-37、抗菌肽LL-37突變體及硫酸多粘菌素 B對ATCC25922大腸埃希菌標準 菌株的抑菌率。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1抗菌肽LL-37突變體蛋白的合成方法 (1)抗菌肽LL-37突變體基因的設計和合成 在抗菌肽LL-37突變體基因前端加上組氨酸標簽并引入限制性內切酶EcoR的酶切位 點，后端加上一個終止密碼子并引入限制性內切酶XbaI的酶切位點，合成密碼子優化基因， 連接到大腸桿菌克隆載體PUC57上，得到重組載體pUC57-LL-37 revised。
[0030] (2)重組抗菌肽LL-37突變體基因的表達載體構建 選擇PPICZaA作為載體，將上述重組載體pU57-LL-37 revised經酶切、純化后與pPICZa A按照3:1的分子數進行連接，進行轉化與誘導表達。
[0031] 連接體系的配制:2.5yL酵母表達載體PPICZaA，9. OyL純化的核酸片段，4. OyL連接 酶緩沖液（10倍），〇.5yL T4連接酶，用二次蒸餾水補充至40yL混合均勻，在16°C條件下放置 12h，形成混合物備用。連接產物轉化至感受態的大腸埃希菌感受態細胞DH5a中，篩選重組 質粒。
[0032] (3)重組抗菌肽LL-37突變體基因的畢赤酵母工程菌構建 將篩選的重組質粒進行測序，測序正確的質粒經SacI線性化處理后，轉入畢赤酵母 63115。接種入51111^?0液體培養基中，30°(：，250印111振蕩培養2411，取11^上述培養菌液接入 3001111710001^錐形瓶的￥1^液體培養基中，30°(：，250印111培養至光密度(00)達到1.3-1.5后， 在4°C，1500g離心5min，丟棄上清液，加入300mL的預冷二次蒸餾水重懸菌體，在4°C，1500g 離心5min，丟棄上清液，加入150mL的預冷二次蒸餾水重懸菌體，在4°C，1500g離心5min，丟 棄上清液，加入20mL的預冷lmo 1/L無菌山梨醇溶液重懸菌體，離心后，丟棄上清液，加入ImL 的預冷lmoI/L無菌山梨醇溶液(含10%-15%甘油），輕輕混勻后，IOyL每管分裝備用。加入1 Ομ L線性質粒至IOOyL畢赤酵母菌GSl 15感受態細胞中，輕輕搖勻后將混合物轉移至電轉杯中， 將電轉杯至于冰塊上5-10min，電擊IOms，電壓為IOms，電阻為200 Ω，電擊完成后立即加入 ImL預冷山梨醇溶液，婚后后轉至1.5mL離心管中，30°C靜置或緩慢搖菌培養lh。取200yL菌 液涂布在含l〇〇yg/mL Zeocin的YH)平板上，30°C培養3天后，平板上即長出克隆，隨機挑選 10個克隆，并在含Zeocin的YPD平板上劃線純化，通過PCR鑒定陽性克隆菌pPICZaA-LL37 revised/GS115〇
[0033] (4)重組抗菌肽LL-37突變體的誘導表達及純化 挑取經PCR鑒定的陽性克隆，接種至20mL BMGY培養基中，30°C，300 rpm培養16-18 h 至0D600=5; 3000g離心5 min收集菌體，加入少量BMGY培養基重懸菌體至0D600=1時轉接至 200 mL BMGY培養基中，30°C，300rpm搖菌培養并進行誘導表達;每24h向培養基中補加100% 甲醇至其終濃度達0.5%，連續誘導72 h，將培養后的菌液經超聲處理，裂解細胞，離心后洗 滌、溶解;3000g離心5min收集培養上清定容后，緩慢加入固體硫酸銨至其飽和度達到80%， 置于4 °C沉降過夜；1000 Og離心30min收集蛋白沉淀，加入TBS (pH 7.5)溶解蛋白沉淀 后，在TBS緩沖液中充分透析;4°C，8000g離心30min，取上清，使用0.45 μπι濾膜進行抽濾，除 去大蛋白顆粒；將TBS平衡的蛋白樣品上到TBS充分清洗的Ni-NTA親和層析柱 (GEHealthcare)中，再用TBS清洗柱子；用含200mM咪挫的TBS緩沖液洗脫，并收集洗脫峰，將 收集的蛋白樣品于PBS緩沖液中充分透析，即得到了抗菌肽LL-37突變體蛋白。
[0034] (5)抗菌肽LL-37突變體檢測 采用高效液相色譜分析上述抗菌肽LL-37突變體蛋白純度，參見圖6;采用質譜測定抗 菌肽LL-37突變體的分子大小，參見圖7。
[0035]從圖6可以看出，從IOmiη開始無雜峰出現，抗菌肽LL-37突變體的出峰時間為 12.078min，波峰單一、波形呈正態分布，抗菌肽LL-37突變體純度達到96.85%，可以用于抑 菌實驗等活性的研究。圖7的質譜圖顯示，突變體的分子量為4505.4 Da，與理論估計的分子 量一致，說明該物質是目的多肽。
[0036]實施例2抗菌肽LL-37突變體的應用 將本發明的抗菌肽LL-37突變體加入按照藥劑學上常用輔料，制成注射劑、噴霧劑、滴 劑、貼劑、軟膏劑等。
[0037]實施例3抗菌肽LL-37及其突變體的理化性能 利用蛋白質在線分析工具和蛋白質分析軟件Antheprot，分析抗菌肽LL-37及其突變體 的系列及其理化性能，得到抗菌肽LL-37及其突變體的核苷酸系列和理化性能表，分別見下 表2和表3所不。
[0038]
從上表3可以看出，抗菌肽LL-37突變體的理論等電點明顯提高、半衰期明顯延長，說明 在相同PH環境下，抗菌肽LL-37突變體的凈電荷量明顯提高、體外穩定性更好；突變體的螺 旋程度和親疏水性與抗菌肽LL-37相比，未見明顯差異，參見附圖5。
[0039] 實施例4抗菌肽LL-37突變體的抑菌活性 將合成所得的多肽，采用抑菌實驗研究其抗菌活性。以臨床收集分離得到的11種致病 大腸埃希菌和2種大腸埃希菌標準菌株為抑菌對象，利用美國臨床和實驗室標準協會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)2012版檢驗標準及操作規范文 {φΜΟΤ-ΑΘ：Methods for Dilution Antimicrobial susceptibility Tests for Bacterial That Grow Aerobically；Approved Standard-Ninth Edition做抑菌實驗，研 究多肽的抗菌活性。
[0040] 圖 8-圖20 表示經過濃度為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、500yg/mL 的抗菌 肽LL-37及其突變體處理過后的13株大腸埃希菌的光密度(OD)值的變化，結果顯示抗菌肽 LL-37及其突變體對13株大腸埃希菌均有不同程度抑制作用。
[0041] 圖8表示LL-37及其突變體對臨床1號菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為2.5 yg/ mL時，LL-37突變體對臨床1號菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強(p〈0.05)。
[0042] 圖9表示LL-37及其突變體對臨床2號菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為0.625 μ g/mL時，LL-37突變體對臨床2號菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強(ρ〈0.05)。
[0043]圖10表示LL-37及其突變體對臨床3號菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為0.625 yg/mL時，LL-37突變體對臨床3號菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強(ρ〈0.05)。
[0044] 圖11表示LL-37及其突變體對臨床4號菌株的抑菌作用，結果顯示LL-37與其突變 體對臨床4號菌株的抑菌能力相當。
[0045] 圖12表示LL-37及其突變體對臨床5號菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為2.5 μ g/mL時，LL-37突變體對臨床5號菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強(ρ〈0.05)。
[0046]圖13表示LL-37及其突變體對臨床6號菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為0.625 yg/mL時，LL-37突變體對臨床6號菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強(ρ〈0.05)。
[0047]圖14表示LL-37及其突變體對臨床7號菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為1.25 μ g/mL時，LL-37突變體對臨床7號菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強(ρ〈0.05)。
[0048]圖15表示LL-37及其突變體對臨床8號菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為1.25μ g/mL時，LL-37突變體對臨床8號菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強(ρ〈0.05)。
[0049]圖16表示LL-37及其突變體對臨床9號菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為5yg/mL 時，LL-37突變體對臨床9號菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強(p〈0.05)。
[0050]圖17表示LL-37及其突變體對臨床10號菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為1.25 yg/mL時，LL-37突變體對臨床10號菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強(p〈0.05)。
[00511圖18表示LL-37及其突變體對臨床11號菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為1.25μ g/mL時，LL-37突變體對臨床11號菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強(ρ〈0.05)。
[0052]圖19表示LL-37及其突變體對ATCC25922菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為 0.625yg/mL時，LL-37突變體對ATCC25922菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強（p〈 0.05)〇
[0053]圖20表示LL-37及其突變體對ATCC35218菌株的抑菌作用，結果顯示在濃度為 0.625yg/mL時，LL-37突變體對ATCC35218菌株的抑菌效果與LL-37相比顯著性增強（p〈 0.05)〇
[0054]從上述抑菌實驗結果可以得出，LL-37及其突變體對13種不同大腸埃希菌株的最 小抑菌濃度(MIC)，見下表4。
[0055]從表4可以看出，抗菌肽LL-37及其突變體對13株不同大腸埃希菌株的最小抑菌濃 度均< 20yg/mL，除臨床4號菌株最小抑菌濃度相同外，抗菌肽LL-37突變體對其他12株大腸 埃希菌的最小抑菌濃度(MIC)均明顯小于LL-37( p<0.01)。
[0056]實施例5抗菌肽LL-37突變體的穩定性 根據抑菌實驗確定突變體的最低抑菌濃度，選擇濃度為1.25yg/mL的抗菌肽LL-37及其 突變體、硫酸多粘菌素 B分別作用于ATCC25922大腸埃希菌標準菌株，分別經過6h、12h、24h、 48h處理后，抗菌肽LL-37及其突變體、硫酸多粘菌素 B對ATCC25922大腸埃希菌標準菌株的 抑菌效果，參見圖21所示。硫酸多粘菌素 B是目前臨床使用的多肽類抗生素，它主要通過干 擾細菌膜通透性與核糖體功能而發揮抗菌作用，對革蘭陰性桿菌，如大腸桿菌、綠膿桿菌、 副大腸桿菌、肺炎克雷白桿菌、嗜酸桿菌、百日咳桿菌及痢疾桿菌等有抑制或殺菌作用。 [0057] 從圖21可以看出，抗菌肽LL-37突變體經過6h、12h、24h、48h作用于ATCC25922大腸 埃希菌標準菌株均可明顯抑制大腸埃希菌的增殖，其抑菌效果明顯好于硫酸多粘菌素 B(P〈 0.05)和抗菌肽LL-37(p〈0.01)。濃度為1.25yg/mL的LL-37突變體經過48h作用后，仍能較好 的抑制ATCC25922大腸埃希菌標準菌株，由此可見，抗菌肽LL-37突變體的穩定性好。
【主權項】
1. 一種人源抗菌肽LL-37突變體，其特征在于:所述序列中第一個氨基酸為甘氨酸(G)， 第三個氨基酸為亮氨酸(L)，第十六個氨基酸為谷氨酰胺(Q)，第二十六個氨基酸為賴氨酸 (K)，第三十四個氨基酸為蘇氨酸(T)，第三十五個氨基酸為精氨酸(R)，其它氨基酸殘基序 列不變。2. -種分離的多核苷酸，其特征在于:所述多核苷酸編碼的多肽與人源抗菌肽LL-37相 比，人源抗菌肽LL-37中的1號位亮氨酸、3號位甘氨酸、16號位谷氨酸、26號位天冬氨酸、34 號位精氨酸、35號位蘇氨酸被分別替換成:甘氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、賴氨酸、蘇氨酸、精氨 酸。3. -種載體，其特征在于:所述載體中含有如權利要求2所述的多核苷酸。4. 一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于:所述宿主細胞中含有如權利要求3所述的 載體。5. -種人源抗菌肽LL-37突變體蛋白的合成方法，其特征在于:包括以下步驟： (1) 利用蛋白質在線分析工具ExPasy、序列對比軟件MEGA software、蛋白質分析軟件 Antheprot、分子對接軟件auto dock和動力學模擬軟件ADF2014 (Amsterdam Density Functional)對抗菌肽LL-37的序列進行分析，為抗菌肽LL-37突變體設計提供理論基礎； (2) 以分子對接和動力學模擬的結果為基礎，對抗菌肽LL-37部分氨基酸殘基進行替換 或順序調整，得到其突變體，在抗菌肽LL-37突變體基因的兩端引入限制性酶切位點，通過 酶切操作連接到酵母表達載體上； (3) 將表達載體轉化導入GS115酵母菌中，經提取后鑒定得到重組基因工程菌； (4) 重組基因工程菌經誘導表達后離心分離收集上清液，經分離純化獲得重組抗菌肽 LL-37突變體蛋白。6. 根據權利要求5所述的一種人源抗菌肽LL-37突變體蛋白的合成方法，其特征在于： 所述抗菌肽LL-37突變體基因前端加上組氨酸標簽并引入限制性內切酶EcoR的酶切位點， 后端加上一個終止密碼子并引入限制性內切酶Xbal的酶切位點。7. 根據權利要求5所述的一種人源抗菌肽LL-37突變體蛋白的合成方法，其特征在于： 所述載體為pPICZaA。8. 根據權利要求5所述的一種人源抗菌肽LL-37突變體蛋白的合成方法，其特征在于： 所述酵母菌為畢赤酵母。9. 根據權利要求5所述的一種人源抗菌肽LL-37突變體蛋白的合成方法，其特征在于： 所述分離純化方法為鹽析、沉淀、液相層析技術和透析的結合。10. -種人源抗菌肽LL-37突變體的應用，其特征在于:所述突變體用于(a)抑制細菌、 病毒的生長繁殖及腫瘤細胞的增殖;或(b)殺滅細菌、病毒。
【文檔編號】C07K14/47GK105859867SQ201610366249
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】楊浩, 劉俊, 付靖瑜, 韓躍武, 羅鵬程, 汪宏良
【申請人】黃石市中心醫院