一種基于Eps8-EGFR結合域的雙重抗腫瘤多肽的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種基于Eps8?EGFR結合域的雙重抗腫瘤多肽，該多肽的氨基酸序列為Glu?Phe?Leu?Asp?Cys?Phe?Gln?Lys?Phe(SEQ ID No：1)。本發明所述的雙重抗腫瘤多肽既能夠誘導細胞毒性T細胞，有效殺傷HLA?A*2402陽性、Eps8陽性腫瘤，又能夠直接抑制HLA?A*2402陽性、Eps8陽性腫瘤細胞增殖，可用于制備雙重抗腫瘤的藥物。
【專利說明】
一種基于Eps8-EGFR結合域的雙重抗腫瘤多肽
技術領域
[0001 ]本發明涉及有機化學領域，具體涉及來自哺乳動物的多肽，該多肽具有抗腫瘤活 性，適用于制備抗腫瘤藥物。
【背景技術】
[0002] 多肽藥物在臨床應用上具有非常重要的開發價值。部分多肽藥物具有促進機體免 疫功能的作用，稱為多肽疫苗。誘導強且特異性抗腫瘤免疫應答的新型腫瘤抗原的鑒定保 證了針對各種類型腫瘤的多肽疫苗的開發和臨床應用（Reche P，et al.J Immunol Res 2015；2015:349049；Jazirehi AR,et al.Cancer Res 2011；71(4):1406-1417；Andersen RS,et al. Cancer Immunol Immunother 2011;60(2):227-234;Gritzapis AD,et al.Cancer Res 2010；70(7):2686-2696；Klepin HD,et al.Oncologist 2009；14(3):222-232.)。迄今為止，已有許多實用腫瘤相關抗原衍生多肽的臨床試驗，均在不同程度上誘導 出抗腫瘤免疫應答(Walter S，et al .Nat Med2012; 18(8) :1254-1261 ;Bae J，et al .Clin Cancer Res 2012；18:485〇-60；Slingluff CJ,et al.Clin Cancer Res 2007；13:6386-95；Slingluff CJ,et al.Clin Cancer Res 2009；15:7036-44；Slingluff CJ,et al.J Clin Oncol 2011;29:2924-32.)
[0003] 由于治療驅動的免疫選擇會導致腫瘤抗原的刪除、突變或下調，進而導致腫瘤細 胞免疫逃逸，因此，對腫瘤細胞發生發展必不可少的腫瘤相關抗原是免疫療法的理想靶標， 可將腫瘤免疫逃逸的風險降至最低。
[0004] Eps8,即表皮生長因子受體通路底物8(Epidermal growth factor receptor Pathway Substrate 8，Eps8)，是表皮生長因子受體（EGFR，Epidermal Growth Factor Receptor)重要的激酶活性底物之一。已經證實，Eps8在許多腫瘤細胞中表達上調，包括宮 頸癌（Chen YJ, et al .Mol Cancer Ther 2008;7:1376-85.)、結直腸癌（Maa MC, et al.J Biol Chem2007;282:19399-409·)、垂體瘤（Xu M，et al.Endocrinology 2009;150:2064-71·)、口腔鱗癌（Chu PY，et al.Asia Pac J Clin Oncol 2012;8:e77-81·)、胰腺導管癌 (Welsch T，et al.Cancer Lett 2007;255:205-18·)、乳腺癌（Yao J，et al.Cancer Res 2006;66:4065-78·)、甲狀腺癌（Griffith 0L，et al.J Clin Oncol 2006;24:5043-51·)、 食管癌（Bashir M，et al .Cell Commun Signal 2010;8:13.)及惡性膠質瘤（Ding X，et al.Oncol Rep 2013 ; 29 : 697-703 .)等實體腫瘤，及多發性骨髓瘤（李玉華等.山東醫藥 2011;51:9-11·)、白血病（Li YH, et al.Clin Lab 2013 ； 59( 11~12): 1261-1269 ；Li YH, et al · Leuk Res 2015; 39(6) :575-581 ;Kang Η, et al.Blood2012; 119:1872-81.)等血液系統 腫瘤。進一步分析發現，EpsS表達上調促進腫瘤細胞增殖與轉移，抑制腫瘤細胞凋亡，降低 藥物敏感性，與腫瘤患者預后差密切相關(胃618〇111'，6丨31.〇311〇61'1^1^ 2007;255:205-18；Chen YJ,et al.Mol Cancer Ther 2008；7:1376-85；Ding X,et al.Oncol Rep 2013； 29:697-703；Li YH,et al .Future Oncol 2013;9( 10): 1587-1594·)。以上研究說明Eps8是 腫瘤發生發展的關鍵分子和預后因子。
[0005] 另有部分多肽藥物發揮抑制腫瘤增殖、轉移等生物學活性的作用，稱為多肽抑制 劑。這類多肽藥物以阻斷促瘤相關信號通路為目的。近十年已有多個抗腫瘤多肽藥物被批 準上市，如應用于前列腺癌的促性腺激素釋放激素(GnRH)詰抗劑abarelix(AbareIix: abarelix-depot-F,abarelix-depot-M,abarelix-L,PPI 149,R 3827.Drugs R D 2003；4 (3) :161-166.)和degarelix(Frampton JE,et al .Drugs 2009;69(14) :1967-1976.)，及應 用于多發性骨髓瘤的蛋白酶體抑制劑carfilzomib(McCormack PL.Drugs 2012;72(15): 2023-2032.) 〇
[0006] 公開號為CN 103694333Α的專利申請公開了一種EPS8抗腫瘤CTL表位肽，并驗證了 其促進CTL細胞殺傷腫瘤細胞的效果。但是，本發明人的后續研究發現，上述CTL表位肽的腫 瘤細胞增殖抑制效果不理想，抑制率均低于50%。
[0007] 因此，開發雙重抗腫瘤效應的多肽，即，該多肽既可促進CTL細胞殺傷腫瘤細胞，又 可直接抑制腫瘤細胞增殖、克隆形成，對抗腫瘤藥物的設計具有重大意義。
【發明內容】
[0008] 本發明所要解決的技術問題的提供一種基于EPS8-EGFR結合域的雙重抗腫瘤多 肽，該多肽既可引發相應分子特異性的CTL，又可阻斷Eps8/EGFR信號通路，抑制腫瘤細胞的 增殖。
[0009] 本發明解決上述問題的技術方案為：
[0010] -種基于EPS8-EGFR結合域的雙重抗腫瘤多肽，該多肽的氨基酸序列為6111-?1^- Leu-Asp-Cys-Phe-Gln-Lys-Phe(SEQ ID No：l)〇
[0011]上述雙重抗腫瘤多肽可按SEQ ID NO: 1所示序列采用固相合成法合成得到。
[0012] 上述雙重抗腫瘤多肽位于Eps8-EGFR結合域上，既具有免疫原性，又可阻斷EGFR/ EpsS信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖，因此可用于制備腫瘤疫苗，還可以用于制備抗腫瘤的 藥物。
[0013] 本發明所述的雙重抗腫瘤多肽能夠誘導特異性T細胞免疫應答，表現為刺激特異 性T細胞分泌高水平IFN-γ并對Eps8陽性腫瘤細胞產生特異性殺傷效應。本發明所述的雙 重抗腫瘤多肽還可阻斷EGFR/Eps8的信號通路，直接抑制腫瘤細胞增殖，因此可與常規化療 藥物聯用。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發明所述雙重抗腫瘤多肽的質譜圖。
[0015] 圖2為本發明所述雙重抗腫瘤多肽誘導的特異性CTL分泌IFN-γ能力的檢測結果 圖，其中，圖A為誘導CTL分泌IFN- γ顯微照片；圖B誘導CTL分泌IFN- γ斑點數的條形圖。
[0016] 圖3為本發明所述雙重抗腫瘤多肽誘導的特異性CTL對Eps8陽性、HLA-A$2402陽性 結腸癌細胞SW620體外殺傷能力的曲線圖，圖中的橫坐標表示效應細胞（CTL)與靶細胞 (SW620)的比值(效靶比），縱坐標表示殺傷率（％)。
[0017]圖4為本發明所述雙重抗腫瘤多肽誘導的特異性CTL對Eps8陽性、HLA-A*2402陽性 結腸癌細胞C〇1〇320體外殺傷能力的曲線圖，圖中的橫坐標表示效應細胞(CTL)與靶細胞 (C〇1〇320)的比值(效靶比），縱坐標表示殺傷率（％)。
[0018]圖5為本發明所述雙重抗腫瘤多肽誘導的特異性CTL對Eps8陽性、HLA-A$2402陽性 非小細胞肺癌細胞A549體外殺傷能力的曲線圖，圖中的橫坐標表示效應細胞(CTL)與革巴細 胞(A549)的比值(效靶比），縱坐標表示殺傷率（％ )。
[0019]圖6為本發明所述雙重抗腫瘤多肽誘導的特異性CTL對Eps8陽性、HLA-A*2402陽性 肝癌細胞HepG2體外殺傷能力的曲線圖，圖中的橫坐標表示效應細胞（CTL)與革El細胞 (!fepG2)的比值(效靶比），縱坐標表示殺傷率（％ )。
[0020] 圖7為本發明所述雙重抗腫瘤多肽作用48h對Eps8陽性、HLA-A$2402陽性腫瘤細胞 增殖抑制率的曲線圖，圖中的橫坐標表示多肽濃度，縱坐標表示增殖抑制率（％ )。
[0021] 圖8為本發明所述雙重抗腫瘤多肽對Eps8陽性、HLA-A$2402陽性腫瘤細胞克隆形 成的抑制率的條形圖，圖中的橫坐標表示多肽濃度，縱坐標表示克隆形成抑制率（％)。 表示與相應的溶劑對照組(〇虛)相比，P〈〇.05;圖中表示與相應的溶劑對照組(ΟμΜ)相 比，P〈0.01;圖中'表示與相應的溶劑對照組(ΟμΜ)相比，P〈0.001。
[0022] 圖9為公開號為CN 103694333Α的專利申請所述CTL表位肽對Eps8陽性、HLA-A* 0201陽性的SW480細胞增殖抑制率的曲線圖。
【具體實施方式】
[0023]實施例l(Eps8-EGFR結合域多肽的篩選）
[0024]本發明所述的EpsS-EGFR結構域來源的抗腫瘤多肽，是根據抗原的一級結構，采用 免疫信息學手段，運用在線生物學軟件SYFPEITHI (http : //www .syfpeithi.de/bin/ MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)(該算法記載于Rammensee H , e t al·Immunogenetics 1999;50(3-4):213-219·)和BIMAS(http://www-bimas·cit.nih.gov/ molbio/hla_bind/)(該算法記載于Parker KC,et al .J Immunol 1994； 152(1): 163-175.) 對Eps8分子EGFR結合域的HLA-A$2402限制性進行預測分析，篩選出氨基酸序列為SEQ ID No: 1所示的多肽，并記為Eps8-327AEQ ID No: 1所示的多肽由杭州中肽生化有限公司根據 本發明人所提供的序列，采用Fmoc固相肽合成法合成。采用反相高壓液相色譜儀對其合成 的目標產物進行純化和純度分析，結果顯示其純度>95%，再采用質譜法進行鑒定和分子量 測定，得到如圖1所示的質譜圖。
[0025]下述實施例2-7分別對本例所得到的多肽Eps8-327(SEQ ID N〇:l)的雙重抗腫瘤 效果進行驗證。
[0026]實施例2[體外致敏抗原呈遞細胞(APC)的誘導]
[0027]使用外周血單個核細胞衍生的樹突狀細胞(DC)作為APC，參考別處所述(Nakahara S，et al.Cancer Res 2003Jul 155,63(14) :4112-8)在體外誘導DC。具體而言，利用 Ficoll-Plaque密度梯度法分離健康志愿者(HLA-A4402陽性）外周血中分離單個核細胞 (PBMCs)，通過貼壁法分離原始DC，在含有10%FBS的PRMI-1640、1000U/ml粒細胞-巨噬細胞 集落刺激因子(GM-CSF)和1000U/ml白介素 4(IL-4)的培養液中培養。在培養第7天，在含3μ g/ml02-微球蛋白的培養基中，利用每一種合成肽(20μg/ml)沖激經細胞因子誘導的DC 3小 時。所生成的細胞在細胞表面表達DC相關分子，如⑶80、⑶83、⑶86和HLA- Π 分子(數據未顯 示)。
[0028]實施例3(體外CTL的誘導）
[0029] 上述經多肽沖激的0(：用絲裂霉素(：(1^〇滅活(3(^8/1111，3〇1^11)，以1 :20比例與自 體⑶8+T細胞（由⑶8陽性分離試劑盒通過正選擇獲得)混合，于含IL-7 10ng/ml的培養基中 培養。第3天，在培養基中加入IL-2至終濃度為20U/ml。在第7天和第14天，用經肽沖激的、滅 活的自體DC進一步刺激T細胞。第21天收集細胞檢測CTL功能（Olson BM，et al.Cancer Immunol Immunother 2011;60(6):781-792;Andersen RS,et al. Cancer Immunol Immunother 2011；60(2):227-234.)〇
[0030] 實施例4(CTL分泌IFN- γ功能）
[0031] 利用IFN-γ-ELISP0T檢測上述CTL活性。具體而言，按試劑盒操作說明，于96孔硝 酸纖維素膜培養板預孵育捕獲抗體過夜，次日計數并調整上述效應細胞至I X IO6Ail，接種 于培養板，每孔1〇〇μ1，孵育24h，洗板，分別孵育一抗、二抗，顯色，最后用ELISP0T讀板器對 斑點進行計數。分組包括:正對照組:效應細胞+1〇μ1 PHA，終濃度1~4μg/ml;實驗組:效應 細胞;背景負對照組：IOOyl的Lympho-Spot無血清培養基。
[0032] 結果:如圖2所示，與溶劑對照組相比，Eps8-327誘導的T細胞分泌IFN-γ數顯著增 加，Ρ〈0·001〇
[0033]實施例5(CTL殺傷腫瘤細胞功能）
[0034]利用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測CTL殺傷腫瘤細胞的能力。具體而言，按照Cyto Tox% KNon-Radioactive Cytotoxicity Assay試劑盒操作說明，以上述CTL為效應細胞， 以各腫瘤細胞(SW620、C〇1〇320、A549和HepG2)為靶細胞，檢測特異性T細胞對腫瘤細胞的殺 傷能力。設置實驗組、效應細胞自發釋放組、靶細胞自發釋放組、靶細胞最大釋放組、背景對 照組和體積校正組。將效應細胞和靶細胞共孵育，反應4h后加入底物顯色30min，終止反應 后，酶標儀測定波長490nm的吸光度(A)值，計算CTL對腫瘤細胞的殺傷率。殺傷率（％ )= [(實驗組的相對A值-靶細胞自發釋放組的相對A值-效應細胞自發釋放組的相對A值)/(靶 細胞最大釋放組的相對A值-靶細胞自發釋放組的相對A值）]X 100%。其中，實驗組、靶細胞 自發釋放組及效應細胞自發釋放組分別減去培養基對照組A值獲得其相應的相對A值;靶細 胞最大釋放組減去體積控制組獲得其相應的相對A值。
[0035] 結果：如圖3-圖6所示，與溶劑對照組相比較，來源于EpsS-EGFR結合域的多肽 Eps8-327誘導的特異性T細胞顯著殺傷Eps8陽性、HLA-A*2402陽性的腫瘤細胞SW620、 C〇1〇320(結腸癌）、A549(非小細胞肺癌)及H印G2(肝癌）.
[0036]實施例6[抑制腫瘤細胞增殖(CCK-8法）]
[0037] 取對數生長期細胞用I3BS洗滌，計數后重懸于含體積分數10 %胎牛血清RPMI 1640 培養基中至密度為5\104/!111，以10(^1/孔接種于96孔板，置于孵箱過夜，待細胞貼壁后換 成無血清培養基進行4h饑餓處理，棄培養液，用PBS洗兩遍，然后加入配制好的相應濃度 (25、50、75、100、125、150、175以1〇的多肽溶液，分別培養4811后每孔加入1(^100(-8溶液，培 養箱中繼續培養3h。置于酶標儀中，讀取450nm波長處吸光度值。實驗重復三次，均設3個復 孔，取平均值為最終結果。
[0038] 結果：如圖7所示，源自Eps8-EGFR結合域的多肽Eps8-327顯著抑制HLA-A*2402和 Eps8陽性的結腸癌細胞SW620、C〇1〇320、HT_29的增殖。Eps8-327對SW620的半數抑制濃度 (IC 5Q)為26.79yM(95%CI :17.34-41.38)，對C〇1〇320細胞的IC5QSl08.3yM(95%CI:101.8-115.2)，對!11'-29細胞的1〇5()為149.34]\1(95%(：1 :129.7-171.9)。
[0039] 實施例7[抑制腫瘤細胞克隆形成(平板克隆實驗）]
[0040] 取對數生長期各腫瘤細胞，含10 %FBS的完全培養液重懸，加入候選多肽至終濃度 為100μΜ、200μΜ，以500個細胞/孔接種于6孔板，置37°C、5%⑶ 2孵箱中培養7-14天，形成肉 眼可見克隆后(含50個細胞以上），用PBS緩沖液漂洗細胞一次，吸盡殘余液體。加入4%多聚 甲醛室溫固定20min，棄固定液，PBS緩沖液漂洗細胞一次，加入0.5 %結晶紫染液，室溫染色 10-20min，棄染色液，蒸餾水沖洗后晾干，計算細胞克隆形成率=(克隆數/接種細胞數）X 100%〇
[00411 結果：如圖8所示，源自Eps8-EGFR結合域的多肽Eps8-327抑制腫瘤細胞HT-29、 SW620、C010320及H印G2克隆形成。
[0042] 實施例8(對比實驗）
[0043]本例采用CCK-8法對公開號為CN 103694333A的專利申請所述的四個CTL表位肽 EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360和EPS8-455抑制腫瘤細胞增殖的能力進行驗證，具體步驟如 下：取對數生長期SW480細胞用I 3BS洗滌，計數后重懸于含體積分數10 %胎牛血清RPMI 640 培養基中至密度為5\104/!111，以10(^1/孔接種于96孔板，置于孵箱過夜，待細胞貼壁后換 成無血清培養基進行4h饑餓處理，棄培養液，用PBS洗兩遍，然后加入配制好的相應濃度的 多肽溶液，分別培養48h后每孔加入10μ1 CCK-8溶液，培養箱中繼續培養3h。置于酶標儀中， 讀取450nm波長處吸光度值。實驗重復三次，均設3個復孔，取平均值為最終結果。
[0044] 結果：如圖 9 所示，四個 CTL 表位肽 EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360 和 EPS8-455 在 0-100μΜ濃度區間對SW480細胞增殖沒有抑制作用，僅在高濃度150-200μΜ區間表現出抑制作 用，但其抑制率仍低于50%。將圖9與圖7比較可見，四個CTL表位肽EPS8-101、EPS8-276、 EPS8-360和EPS8-455抑制SW480細胞增殖的能力明顯弱于本發明所述多肽Eps8-327(SEQ ID No：1)〇
[0045] 總之，本發明鑒定了源自Eps8-EGFR結合域的新型多肽，這些多肽一方面可以誘導 CTL殺傷腫瘤細胞，另一方面可以顯著抑制腫瘤增殖、克隆形成，具有雙重抗腫瘤效應，適用 于腫瘤免疫療法和腫瘤靶向療法。
[0046] 上述實施例2-8說明，本發明所述多肽本發明所述多肽Eps8-327(SEQ ID N〇:l)與 公開號為CN 103694333A的專利申請所述的四個CTL表位肽EPS8-101、EPS8-276、EPS8-360 和EPS8-455的功能和作用具有下述不同：1、本發明所述多肽為HLA-A$2402限制性多肽，適 用于HLA-A*2402陽性人群；公開號為CN 103694333A的專利申請所述的四個CTL表位肽為 HLA-AM201限制性多肽，適用于HLA-AM201陽性人群;2、本發明所述多肽除了激活抗腫瘤免 疫反應外，還具有直接抑制腫瘤細胞增殖、克隆形成等生物學活性的作用，而公開號為CN 103694333A的專利申請所述的四個CTL表位肽僅能激活抗腫瘤免疫反應。
【主權項】
1. 一種基于Eps8-EGFR結合域的雙重抗腫瘤多肽，該多肽的氨基酸序列為6111-?1^-Leu-Asp-Cys-Phe-Gln-Lys-Phe(SEQ ID No：l)〇2. 根據權利要求1所述的一種基于Eps8-EGFR結合域的雙重抗腫瘤多肽，其特征在于， 該雙重抗腫瘤多肽是采用固相合成法合成的。3. 權利要求1所述的多肽在制備促進抗腫瘤免疫應答和抑制腫瘤細胞生物學活性的雙 重抗腫瘤的藥物中的應用。
【文檔編號】C07K14/47GK105859865SQ201610293675
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月5日
【發明人】李玉華, 周煒均, 謝曉靈
【申請人】南方醫科大學