呼吸道合胞病毒抗原制備方法及利用該抗原制備的呼吸道合胞病毒抗體的快速檢測試劑盒的制作方法

呼吸道合胞病毒抗原制備方法及利用該抗原制備的呼吸道合胞病毒抗體的快速檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于診斷呼吸道合胞病毒感染的呼吸道合胞病毒抗原，制備該抗原的方法，用該抗原測定呼吸道合胞病毒感染的方法及試劑，屬于臨床醫學檢測領域。將人工合成優化的呼吸道合胞病毒F1基因構建原核表達載體，大腸桿菌表達呼吸道合胞病毒F1抗原，采用透析法、梯度稀釋法和凝膠層析法復性包涵體，獲得具有三維結構和免疫活性的重組呼吸道合胞病毒F1蛋白抗原。本發明應用膠體金免疫層析技術，以工程表達的呼吸道合胞病毒F1抗原為檢測抗原，以高效抗人IgG或IgM單克隆抗體作為捕獲抗體，用濾血膜過濾紅血球，依據“間接法”原理制備呼吸道合胞病毒抗體快速檢測試劑盒，用于檢測人體血清、血漿或全血中呼吸道合胞病毒抗體，具有檢測方法簡單，結果顯示準確、快速，無需特殊儀器設備的優點。
【專利說明】
呼吸道合胞病毒抗原制備方法及利用該抗原制備的呼吸道合 胞病毒抗體的快速檢測試劑盒
技術領域
[0001] 本發明涉及一種用于診斷呼吸道合胞病毒感染的呼吸道合胞病毒抗原，制備該抗 原的方法，用該抗原測定呼吸道合胞病毒的方法及試劑，屬于臨床醫學檢測領域。本發明在 由呼吸道合胞病毒引起的嬰幼兒急性下呼吸道感染的診斷中有重要意義。
【背景技術】
[0002] 呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus, RSV)簡稱合胞病毒，是世界 各地嬰幼兒急性下呼吸道感染最重要的病毒病原，流行面廣，發病率高，約50%的嬰兒肺炎 和90%的嬰兒支氣管炎均由RSV感染所致。在發展中國家，5歲以下兒童因 RSV感染住院病人 的死亡率為7%，發達國家為0.5%~2.0%。我國每年平約有1500萬嬰兒出生，90%以上小于2歲 的兒童都感染過呼吸道合胞病毒，且反復感染的幾率較高。此外，呼吸道合胞病毒可引起上 呼吸道疾病，癥狀包括發熱、鼻塞、咽炎和中耳炎，呼吸道癥狀的哮喘，支氣管炎，小支氣管 炎和肺炎。最新研究發現免疫功能缺陷的成年人及老年人也是RSV的易感人群。在我國呼吸 道合胞病毒還是引發流行性喘憋性肺炎的主要病原，可引起嬰幼兒尤其是新生兒較高的病 死率，與支氣管哮喘的發作也存在相關性。
[0003] 病原微生物感染的實驗室檢測主要包括對感染部位的病原菌的檢測和對患者血 清、體液中的抗體檢測兩種方法。目前呼吸道合胞病毒檢測主要有分離培養法、聚合酶鏈式 反應(PCR)法、免疫熒光抗體技術(IFA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和酶橋聯技術(APAAP) 等。培養法是呼吸道合胞病毒診斷的"金標準"，但這種方法通常耗時長久，要求嚴格的的運 輸過程和復雜的技術，不適合于快速診斷。聚合酶鏈式反應(PCR)法等核酸檢測技術雖然具 有較高的特異性和敏感性，但其準確性不高，極易造成污染。抗體檢測是比較理想的檢測呼 吸道合胞病毒感染的方法之一。目前常用的抗體檢測技術有免疫熒光抗體技術(IFA)、酶聯 免疫吸附試驗(ELISA)、酶橋聯技術(APAAP)等。IgM是人體感染RSV后初次免疫應答中出現 最早的免疫球蛋白，感染后卜3周在血清中檢出，提示新近感染，再次感染后一般IgM不出 現，因此IgM可作為感染早期的診斷標志；IgG是機體再次免疫應答的主要抗體，感染后7~8 周達到峰值，具有重要的免疫效應，可作為感染中后期及再次感染的診斷標志。本發明可對 血漿、血清或全血中的呼吸道合胞病毒抗體IgM/IgG進行同時檢測，確定感染階段。
[0004] 呼吸道合胞病毒的F蛋白（Fusion protein)具有較好的免疫原性，F蛋白是呼吸道 合胞病毒重要的膜蛋白成分，與病毒進入細胞并形成特征性的合胞體有關，還具有促使RSV 在感染細胞間傳播及溶血的作用，也是激發機體產生保護性抗體最主要的病毒抗原。合胞 病毒表達的F蛋白前體FO是沒有活性的，要經過剪切加工形成Fl和F2的復合體，才能成為有 活性的蛋白，且抗原表位主要集中在Fl段。目前所用的F蛋白來源主要是直接從病毒純化或 者利用真核系統表達，存在產量較低等問題。因此，制備一種特異性強、檢測敏感度高的呼 吸道合胞病毒抗原及一種快速檢測呼吸道合胞病毒抗體的試劑盒非常有實際需要。

【發明內容】

[0005] 本發明的第一目的是提供一種呼吸道合胞病毒特異性抗原，該抗原是F蛋白的部 分序列經過優化后原核表達所得，具有免疫原性高，無特異反應，抗原表位集中等優點。
[0006] 本發明的第二目的是提供一種制備呼吸道合胞病毒抗原的方法，通過該方法制備 的呼吸道合胞病毒抗原具有表達量高，收率高和免疫反應性強的特點。
[0007] 本發明的第三目的是提供一種檢測呼吸道合胞病毒抗體的方法，該方法為快速 "一步檢測法"，具有靈敏度高、特異性強，檢測速度快、操作簡便，無需專門設備，適用于臨 床檢測、流行病學調查和場地檢疫等多種場合。
[0008] 本發明的第四目的是提供一種呼吸道合胞病毒抗體快速檢測試劑盒，它是一種特 異性強、靈敏度高、快速、簡便的"一步法"呼吸道合胞病毒抗體檢測試劑盒。
[0009] 本發明的主要內容如下。
[0010] (1)呼吸道合胞病毒抗原，它是一種采用基因工程技術表達的抗原。
[0011] (2)-種制備呼吸道合胞病毒抗原的方法，包括人工合成優化的呼吸道合胞病毒F 蛋白抗原部分基因序列F1，構建原核表達載體，大腸桿菌表達呼吸道合胞病毒Fl抗原蛋白， 采用透析法、梯度稀釋法和凝膠層析法復性包涵體，獲得具有三維結構和免疫活性的重組 呼吸道合胞病毒Fl蛋白抗原。
[0012] (3)-種呼吸道合胞病毒抗體快速檢測方法，包括上述（1)中的呼吸道合胞病毒抗 原固定到硝酸纖維素膜，一種標記抗體(二抗）固定到固相載體，待測樣品與標記抗體(二 抗)接觸，若待測樣品中存在呼吸道合胞病毒抗體，則呼吸道合胞病毒抗體與標記二抗形成 抗體-標記二抗復合物，"復合物"在硝酸纖維素膜水平移動，遇到固定到膜上的呼吸道合胞 病毒抗原產生反應，帶有標記的"復合物"就被特異地固定到抗原上，固定抗原的位置就會 有顯色反應;若待測樣品不含呼吸道合胞病毒抗體，則"復合物"不能固定到抗原的位置上， 此處就沒有顯色反應，可依據硝酸纖維素膜固定抗原位置是否有顯色反應，來判斷檢測結 果，即待測樣品中是否有呼吸道合胞病毒抗體。
[0013] (4)上述(3)呼吸道合胞病毒抗體檢測方法，其中待測樣品是全血、血漿或者血清。
[0014] (5 )上述(3 )或(4 )中測定呼吸道合胞病毒抗體的方法，其中的標記抗體(二抗)是 標記的抗人I gM或I gG抗體。
[0015] (6)上述(3)-(5)中標記抗體是膠體金屬顆粒或者彩色膠乳顆粒標記的抗體。
[0016] (7)-種快速檢測呼吸道合胞病毒抗體的試劑盒，它所用抗原為上述(1)中的呼吸 道合胞病毒抗原，所用方法為上述(3)中所說方法。
[0017] (8)上述(7)中用于檢測的試劑盒，在樣品墊上固定有濾血膜，所述濾血膜是由固 定有抗紅細胞單抗或者多抗的無紡布或玻璃纖維構成。
[0018] 下面對本發明進行詳細闡述。
[0019] 本發明的呼吸道合胞病毒抗原，主要通過將優化的呼吸道合胞病毒F蛋白部分基 因 Fl構建到原核表達載體pET30a，pET30a-Fl基因表達載體轉化大腸桿菌，篩選陽性重組 菌，IPTG誘導重組菌表達呼吸道合胞病毒Fl蛋白，經細菌裂解、包涵體溶解和重組蛋白結構 復性與純化等步驟獲得。
[0020] 下面將詳述本發明制備呼吸道合胞病毒抗原的方法。
[0021]從GenBank獲取呼吸道合胞病毒F蛋白基因序列，根據呼吸道合胞病毒F蛋白基因 優化密碼子，人工合成呼吸道合胞病毒F蛋白部分基因序列F1。目的基因經雙酶切后與經同 樣雙酶切獲得的原核表達載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞、篩選陽性重組菌。陽性克隆 菌經質粒提取、雙酶切和測序鑒定，證明插入的目的基因正確。重組菌經IPTG誘導表達、離 心得重組菌沉淀，菌體重懸于緩沖液后超聲裂解，離心獲得包涵體形式的的蛋白沉淀，洗滌 后溶于尿素溶液后復性。變性蛋白需要經過結構復性與純化才能獲得天然蛋白的免疫反應 原性和達到呼吸道合胞病毒抗體檢測的應用標準。
[0022]對于呼吸道合胞病毒重組蛋白Fl包涵體復性方法，可應用透析法、梯度稀釋法、凝 膠層析法等，優選透析法和梯度稀釋法相結合的方法，因為它們易于控制，蛋白復性率高。
[0023] 對于包涵體復性后呼吸道合胞病毒Fl蛋白的純化方法，可應用凝膠層析、親和層 析等，優選凝膠層析法，因為它最易于控制，收率高。
[0024] 通過基因重組獲得的呼吸道合胞病毒Fl蛋白抗原具有較高的特異性和敏感性。
[0025] 對于快速測定抗體的方法，這里列舉的是優選的方法，如應用各種標記抗體的免 疫層析測定，應用各種標記抗體的免疫滲濾法等。
[0026]下面詳述免疫層析測定方法。
[0027] 抗呼吸道合胞病毒抗體免疫層析測定方法包括下述步驟:呼吸道合胞病毒Fl蛋白 抗原固定到固相載體1上，標記抗體(二抗）固定到固相2上，待測樣品與標記抗體(二抗)接 觸，若待測樣品存在呼吸道合胞病毒抗體，則呼吸道合胞病毒抗體與二抗反應形成抗體-標 記二抗復合物，該"復合物"在固相1上水平移動，遇到固定到載體1上的呼吸道合胞病毒抗 原產生反應，帶有標記的"復合物"就被特異地固定到抗原上，固相載體上固定抗原的位置 就會有顯色反應;若待測樣品不含呼吸道合胞病毒抗體，則"復合物"不能固定到抗原的位 置上，此處就沒有顯色反應，可依據固相載體上固定抗原位置是否有顯色反應，來判斷檢測 結果，即待測樣品中是否有呼吸道合胞病毒抗體。
[0028] 對于固相載體1，可應用例如硝酸纖維素膜(NC膜）、PVDF膜等。優選硝酸纖維素膜。
[0029] 對于固相載體2,可應用例如玻璃纖維素膜，無紡布等任何一種形式。優選無紡布 作結合物釋放墊，因為它最易于控制。
[0030 ]對于標記的抗體，這里指的是用不同標記物標記的抗體，這里指的是抗人I gM抗體 或抗人IgG抗體，可依據被檢測抗體的種類適當應用。
【附圖說明】 [0031]
[0032]圖1顯示了發明試劑一檢測板的外觀結構示意圖。
[0033]圖2顯示了發明試劑一檢測條的外部結構示意圖。
[0034] 圖中各數字表示內容如下：1-檢測板;2-加樣孔;3-檢視窗;4-加樣端吸水紙層;5-金標抗體層;6-控制線;7-檢測線;8-檢測層;9-吸水端吸水層;10-襯板。
【具體實施方式】
[0035] 1)重組呼吸道合胞病毒F蛋白抗原重組表達、結構復性與純化:呼吸道合胞病F蛋 白基因參考GenBank序列U63644.1，選取部分基因進行合成(AA162-387aa)，合成時去除信 號肽序列并且進行大腸桿菌稀有密碼子優化，表達載體pET30a，連接時酶切位點為BamH I/ Hind III，目的基因共681bp(226aa)，轉化到BL2UDE3)，表達的重組蛋白共274aa，分子量 30.8 kDa，等電點7.66，重組蛋白以包涵體形式表達。
[0036]重組表達載體的構建與鑒定:分別用BamH I和Hind III對呼吸道合胞病毒目的基 因片段Fl及pET30a進行雙酶切，酶切產物純化回收后，16°C連接過夜，再轉入E. coli DH5a 感受態細胞，挑取轉化菌落提取質粒進行PCR、酶切及測序鑒定。經PCR及雙酶切鑒定，均證 實有大小約700bp的基因片段插入載體，與預期結果一致。測序結果表明插入目的基因片段 為681bp，核酸序列與設計合成的呼吸道合胞病毒Fl蛋白基因序列完全相同，構建的表達載 體開放閱讀框正確，可以表達重組蛋白。
[0037] 重組蛋白的誘導表達:取5〇uL pET30a-Fl/BL21(DE3)菌液加入到5mL含lOOyg/mL 卡那霉素的LB培養基中，37°C、200rpm培養過夜，次日按1:50增菌于含卡那霉素的LB培養基 中，培養至吸光值OD6qq為0.6左右時，加入Immo 1/L IPTG，進行誘導表達4小時，5000rpm離心 30分鐘，收集菌體，用TE緩沖液懸浮，充分混勻，-80 °C反復凍融3次，超聲破菌，4 °C、 12000rpm離心15min，收集上清，沉淀用2M尿素洗2次，4°C、12000rpm離心15min，沉淀用8M尿 素溶解，4 °C保存。SDS-PAGE分析蛋白表達情況。
[0038]重組蛋白的結構復性與純化:室溫條件下用lOmmol/L，pH7.2的I3BS緩沖液對呼吸 道合胞病毒Fl蛋白8M尿素的溶解液進行梯度透析稀釋，按溶液中尿素濃度分別為6mo 1/L、 4mo I /L、3mo I /L控制稀釋梯度，每個梯度稀釋的時間分別為3-4h。將完成稀釋復性的含 3mol/L尿素的復性液4°C放置24h。稀釋復性的溶液10000rpm/min離心除去沉淀物質，上清 液通過以S-300為介質的凝膠層析分離法進行純化，從而獲得重組呼吸道合胞病毒Fl蛋白 抗原。所得重組呼吸道合胞病毒Fl蛋白抗原組分進行SDS-PAGE檢測，確定蛋白質的分子量 及蛋白純度。結果顯示主蛋白條帶出現在30.8 kDa處，蛋白純度達95%以上。
[0039] 2)呼吸道合胞病毒抗體金標快速檢測試劑的制備： 將上述所得呼吸道合胞病毒Fl蛋白作檢測抗原包被檢測線，參照圖2,制備呼吸道合胞 病毒抗體金標快速檢測試劑，其組成成分包括:在襯板（10)上設有加樣端吸水層(4)、檢測 層(8)和吸水層(9)，在檢測層(8)和加樣端吸水層(4)之間設有金標抗呼吸道合胞病毒抗體 層(5)，在檢測層(8)上包被有檢測線(7)和質控線(6)。其中加樣端吸水層(4)和吸水端吸水 層(9)由多層濾紙制成;檢測層(8)為硝酸纖維素膜;金標抗體層為玻璃纖維或無紡布浸取 膠體金標記抗體。
[0040] 檢測試劑制備程序包括:制備金標抗體層(5)，檢測層(8)的質控線(6)、檢測線(7) 的包被，然后在襯板(10)上組合金標測試條和檢測卡（1)。在塑料襯板(10)的兩端分別粘貼 加樣端吸水紙層(4)和吸水端吸水層(9);在其中段粘貼包被檢測線和質控線的纖維素層 (8)，在加樣端吸水紙層(4)與纖維素膜層(8)的交接部位，夾貼含金標抗體層(5)的玻璃纖 維，玻璃纖維的4/5部分在加樣端吸水紙層(4)中間，1/5部分在纖維素膜層(8)上。然后按照 4毫米寬、8厘米長規格切條。參照圖2,將檢測條組裝于塑料盒內形成檢測卡（1)。盒蓋上加 樣孔(2)正對測試條的加樣端吸水紙層(4)，觀察孔(3)正對纖維素膜的檢測層(8)。
[0041] 上述金標抗體層的制備包括下述步驟：i .膠體金的制備，取IOOmg氯金酸溶于 1000 mL三蒸水中，加入15mL濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，煮沸15分鐘，可得到直徑為15-50 納米的膠體金顆粒溶液；? .膠體金標記抗人IgG或IgM單克隆抗體，取IOOmL膠體金溶液， 用0.2M碳酸鉀溶液調pH為8.4，加入Img抗人IgG/IgM單克隆抗體，攪拌20分鐘，再加入240mg 牛血清白蛋白（BSA)，繼續攪拌5分鐘，4°C靜置2-4小時；iii .將上述膠體金溶液2000轉/分 鐘離心10-15分鐘，去沉淀，得到上清；iv .將上清液10000轉/分鐘離心60分鐘得到沉淀； V.沉淀溶于4mL 0.02M pH7.4的Tris-Hcl緩沖液得到膠體金溶液，該溶液中含有0.25% BSA和0.02%疊氮鈉 ；vi.將膠體金溶液浸入玻璃纖維或者無紡布至液體開始滲出為止，37 °C干燥2小時形成金標抗體層(5)。
[0042]所述的檢測層(8)是在硝酸纖維素膜上設有重組呼吸道合胞病毒Fl蛋白抗原構成 的檢測線(7)和由羊或兔抗鼠 IgM抗體或IgG抗體形成的質控線(6)。其制備方法是:取上述 1)所制備的重組呼吸道合胞病毒Fl蛋白抗原，調濃度為1.5mg/mL，加入2%的甲醇，用噴膜機 在纖維素膜中段噴檢測線(7);再取羊或兔抗鼠 IgM/IgG抗體調濃度為1.5mg/mL，用噴膜機 在纖維素膜中段，距檢測線〇.5cm處，噴涂質控線(6)，按2yl/cm設置噴膜量，噴膜后置于37 。(:干燥2小時，再用0.0IM pH7.0含10%小牛血清的PBS在37°C下封閉30分鐘，0.0IM pH7.0的 PBS漂洗，45 °C干燥。
[0043] 3)呼吸道合胞病毒抗體的測定 取血清樣品1〇此滴于檢測板（1)的樣品孔⑵內，再滴加 IOOyL樣品稀釋液于樣品孔(2) 內，在觀察窗（3)觀察檢測結果，觀察結果20分鐘內有效。若樣品中含有抗呼吸道合胞病毒 抗體，則在觀察窗內看到檢測線和質控線出現兩條紅色線條，檢測結果判為陽性;若血清中 不含有抗呼吸道合胞病毒抗體，則在觀察窗質控線位置看到一條紅色線，檢測結果判定為 陰性;若觀察窗內一條紅色都看不到，則檢測結果無效。
[0044] 4)全血樣本的測定 本發明實現的呼吸道合胞病毒快速檢測方法對抗凝全血樣本可直接檢測，無需血漿或 血清分離，其實現的原理在于，在樣品墊增加一層濾血膜，濾血膜中固化有抗人血紅細胞抗 體(單抗或多克隆抗體），檢測時，當抗凝血全血進入濾血膜后血液中紅細胞被抗體結合到 濾血膜上，血漿滲入樣品墊，完成檢測，結果判定同3)所述。
[0045] 5 )對臨床樣品的敏感性和特異性 用本發明的抗原及檢測方法制備呼吸道合胞病毒抗體(IgM)金標檢測試劑，檢測50份 臨床呼吸道合胞病毒I gM抗體陽性血清樣品和90份臨床呼吸道合胞病毒I gM抗體陰性血清 樣品進行特異性和敏感性試驗。同時，為了驗證本發明的效果，對用本發明的呼吸道合胞病 毒抗原進行的金標檢測試劑盒與歐蒙公司（EUR(HMMUn)產的ELISA試劑盒進行符合率對比 分析，結果見表1、表2。
[0046] 耒1，太發明抗庖的賠異忡75?咸忡給涮結里"
[0047]表1結果顯示，本發明抗原的敏感性達到96.00%，特異性達到96.67%。本發明的抗 原可以用于進一步研發呼吸道合胞病毒抗體檢測試劑盒。
[0048]表2:本發明的檢測試劑與歐蒙公司試劑的符合率分析。
[0049] 表2結果顯示，本發明檢測方法與歐蒙公司ELISA試劑的陽性符合率為94.00%，陰 性符合率為97.78%，總符合率為96.43%，說明本發明試劑盒的檢測結果與歐蒙公司ELISA檢 測試劑盒具有較好的符合率。因此，本發明具有較好的臨床應用價值。
[0050] 需要指出的是，以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不限制本發明，凡在本 發明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范 圍內。
【主權項】
1. 一種呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，它是呼吸道合胞病毒F蛋白的F1段序列進行序列優 化后采用基因工程技術表達，利用透析法、梯度稀釋法和凝膠層析法復性得到的大小為 30.8 kDa的重組抗原，具有表達穩定，表達量高，免疫原性高等優點。2. -種呼吸道合胞病毒抗體快速檢測方法，包括應用權利要求1中的呼吸道合胞病毒 抗原固定到硝酸纖維素膜，膠體金顆粒或彩色膠乳顆粒標記抗體(二抗），所用檢測抗體為 血清或者全血的IgM或IgG;若待測樣品中存在呼吸道合胞病毒抗體，則呼吸道合胞病毒抗 體與標記二抗反應形成抗體-標記二抗復合物，"復合物"在硝酸纖維素膜水平移動，遇到固 定在硝酸纖維素膜上的呼吸道合胞病毒抗原產生反應，帶有標記的"復合物"就被特異地固 定到抗原上，固定抗原的位置就會有顯色反應，若待測樣品中不含呼吸道合胞病毒抗體，則 "復合物"不能固定到抗原的位置上，此處就沒有顯色反應，可依據硝酸纖維素膜上固定抗 原位置是否有顯色反應，來判斷樣品中是否有呼吸道合胞病毒抗體。3. -種呼吸道合胞病毒抗體快速檢測試劑盒，它所用抗原為權利要求1所述的F1蛋白， 所用方法為權利要求2所述方法。4. 一種呼吸道合胞病毒抗體快速檢測試劑盒，其樣品墊由玻璃纖維或無紡布和濾血樣 品墊組合構成，所述濾血樣品墊由經抗人血紅細胞單克隆抗體或多抗抗體固化處理的玻璃 纖維或無紡布構成。
【文檔編號】C07K14/135GK105859843SQ201610284711
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】李克生, 杜惠芬
【申請人】蘭州雅華生物技術有限公司