一種稠環化合物、其制備方法和應用及其中間體化合物的制作方法

一種稠環化合物、其制備方法和應用及其中間體化合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種稠環化合物、其制備方法和應用及其中間體化合物。該化合物可以用作磷脂酰肌醇3?激酶的抑制劑。
【專利說明】
一種稠環化合物、其制備方法和應用及其中間體化合物
技術領域
[0001] 本發明屬于藥物化學領域，具體而言，涉及一種稠環化合物以及它們的制備方法 和其作為磷脂酰肌醇3-激酶抑制劑的用途。本發明同時涉及該化合物的中間體化合物。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是一類嚴重威脅人類健康的重大疾病。臨床上應用的大部分小分子抗腫 瘤藥物或是影響DNA的結構和功能、或是干擾核酸的合成與修復、或是抑制某種管家蛋白 (如微管蛋白）的合成與功能，因而具有普遍的細胞毒性，臨床應用中存在毒副作用大、易產 生耐藥性等缺點。
[0003] 分子靶向藥物的出現是抗腫瘤藥物發展史上的里程碑式事件。這類藥物作用于腫 瘤細胞的特定分子靶標，對腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等惡性生物學行為具有抑制作用從 而產生抗腫瘤作用。這些分子靶標在腫瘤組織中特異性表達或過高表達，而在正常組織中 不表達或常規表達，因此分子靶向藥物一般能夠選擇性地殺傷腫瘤細胞或抑制其生長增 殖，而對正常細胞的毒性作用較小。尋找和開發新的分子靶向藥物，代表了腫瘤精準治療的 發展方向。
[0004] 大量研究結果表明，人體內腫瘤的發生和發展與PI3K/Akt/mT0R信號通路的調節 和異常活化密切相關。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是磷脂 激酶家族中的一個重要成員，它能特異性地催化磷脂酰肌醇3位羥基的磷酸化，是PI3K/ Akt/mTOR信號通路上的關鍵位點，對細胞的增殖、生存和代謝等起關鍵作用。
[0005] PI3K依其結構特征、活化機制和底物選擇的不同，可分為I、II、III三種類型。由于 迄今為止功能研究最多的是I型PI3K，因此通常所說的PI3K就是指I型PI3K。〗型PI3K依其調 節亞基和上游調節分子的不同又分為IA和IB兩個亞類。IA亞類PI3K可被各種受體酪氨酸激 酶和Ras激活，包括ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ和ΡΙ3Κδ三個亞型，分別由各自的催化亞基pi 10與調節亞基 ρ85組成。IB亞類PI3Κ主要被G蛋白耦聯受體激活，僅ΡΙ3Κ γ -個亞型，它由催化亞基ρ 110 γ 和調節亞基ρ 101或ρ84組成。
[0006] 以上四種亞型的ΡΙ3Κ在體內的分布有所不同：ΡΙ3Κα和ΡΙ3Κβ在各種器官均有表 達，而ΡΙ3Κδ和ΡΙ3Κ γ主要分布在骨髓細胞中。四種亞型ΡΙ3Κ的功能也有所不同：ΡΙ3Κα與腫 瘤的關系最為密切，編碼PllOa的基因 PIK3CA的突變、擴增和過表達廣泛存在于多種惡性腫 瘤中，因此，ΡΙ3Κα被認為在腫瘤的發生和發展中起著重要的作用，此外還有研究表明ΡΙ3Κα 與胰島素信號傳導和葡萄糖代謝有關;ΡΙ3Κβ可激活血小板，因此在血栓性疾病的發展中起 著重要的作用，此外，ΡΙ3Κβ近年來被報道在PTEN缺失的癌癥患者中起著比ΡΙ3Κα還重要的 作用;ΡΙ3Κδ和ΡΙ3Κ γ與炎癥和免疫等有密切的關系。
[0007] 由于ΡΙ3Κ與癌癥等疾病的密切關系，以ΡΙ3Κ為靶標的抑制劑的開發受到了國際制 藥界的高度重視。
[0008] 第一個報道的ΡΙ3Κ合成抑制劑是LY294002,它對I類ΡΙ3Κ的抑制活性達微摩爾級， 對PI3Ka的IC5q值達0.63μΜ，在動物體內實驗中也顯示了一定的抗腫瘤作用，但由于安全性、 穩定性等原因，未能進入臨床試驗。
[0009]
[0010] 隨著PI3K晶體結構的闡明，PI3K抑制劑的藥物設計和發現得到了快速推進，目前 已有多種具有不同結構的PI3K抑制劑陸續被報道，包括嘧啶類、噻吩并嘧啶類、喹唑酮類、 雙烯酮類、咪唑并喹啉類、咪唑并吡啶類、苯并吡啶類及其他分子骨架化合物。
[0011] 嘧啶類、噻吩并嘧啶類及其衍生物：
[0012] GDC-0941 是由 Genentech 公司開發的一種泛 PI3K 抑制劑，其對 pll〇a、pl 1〇β、ρ110 δ、ρ110 γ的IC5q分別為31^、331^、31^、751^。〇)(：-0941的臨床1期試驗結果表明其在乳腺癌、
[0014] BKM120是由Novartis公司開發的一種2,4_雙嗎啉取代嘧啶類的泛PI3K抑制劑，其 對口110〇、？11(^、？11(^、？110丫的比5()分別為5211]\1、16611]\1、11611]\1、26211]\1，用于治療轉移性乳 腺癌的研究正處于III期臨床。 卵巢；癌》爾伍查癒串去由且右檢辟的祐日*癒任_ it曰耐疼_f生較好。
[0013]
[0015]
[0016] 喹唑酮類及其類似物：
[0017] IC-87114是一種選擇性ΡΙ3Κδ抑制劑，其對ΡΙ3Κδ的IC5q為0.5μΜ，較之于對ΡΙ3Κα、 ΡΙ3Κβ、ΡΙ3Κ γ的抑制活性，選擇性高達58到100倍。
[0018]
[0019] CAL-101 (Idelalisib)也是一種選擇性 ΡΙ3Κδ 抑制劑，其對 ρΙΙΟδ 的 IC5q為 2 ·5ηΜ，較 之于對？110€[、？11(^、？110丫的抑制活性，選擇性高達40到300倍。基于？131^在炎癥中的重 要作用，最初關于CAL-101的藥理研究集中在其抗炎和治療自身免疫性疾病上。后來基于 ΡΙ3Κδ主要在骨髓細胞中表達，對CAL-101的藥理研究轉移到對白血病和淋巴瘤的治療上。 在多個臨床試驗結果的支持下，美國Π )Α于2014年7月批準了Idelalisib三個適應癥:與利 妥昔單抗(Rituxan)聯合治療復發的慢性淋巴細胞白血病、作為單藥治療復發性濾泡B細胞 非霍奇金淋巴瘤和復發性小淋巴細胞淋巴瘤。
[0020]
[0021]雙烯酮類及其類似物：
[0022] ?乂866是一種雙烯酮類的泛？131(抑制劑，其對？131(€[、？13狀、？131(丫的1(： 5()分別為 6ηΜ、3ηΜ、9ηΜ。目前處于I/II期臨床試驗中。
[0023]
[0024] 咪唑并喹啉類、咪唑并吡啶類及其類似物：
[0025] BAY80-6946是Bayer公司開發的一種高活性的泛PI3K抑制劑，其對ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ、 P13Κδ、P13Κ γ的IC5Q分別為0 · 5ηΜ、3 · 7nM、0 · 7ηΜ、6 · 4ηΜ。目前處于II期臨床試驗中。
[0026]
[0027] PIK75為咪唑并吡啶衍生物，是一種選擇性ΡΙ3Κα抑制劑，其對ρ11〇α、ρ11〇β、ρ11〇 δ、ρ110γ 的IC5Q分別為5·8ηΜ、1·3μΜ、0·51μΜ、76ηΜ。
[0028]
[0029]苯并吡啶類及其衍生物：
[0030] CN103788071A要求保護下述通式化合物，部分化合物顯示了較高的體外增殖抑制
作用。
[0031]
[0032]
[0033] XL147是一種選擇性PI3K抑制劑，其對ΡΙ3Κα、ΡΙ3Κβ、ΡΙ3Κδ、ΡΙ3Κγ 的IC5q分別為 39ηΜ、383ηΜ、36ηΜ、23ηΜ。
[0034]
[0035] PCT/US2009/045713公開了下述通式化合物或其藥學上可接受的鹽：
[0036]
[0037] 具體公開了 137個化合物，包括：
[0038] N-( 2-氯-5-( 3-甲氧基-6喹啉基)-3-吡啶基)-4-氟苯磺酰胺；
[0039] N-(2-氯-5-(4-苯氧基-6-喹啉基)-3-吡啶基）甲磺酰胺；
[0040] N-(2-氯-5-(6-喹啉基)-3-吡啶基)-4-氟苯磺酰胺）；
[0041] N-( 2-甲氧基-5-( 4-嗎啉基喹啉-6-基)吡啶-3-基）甲磺酰胺等。
[0042] PI3K小分子抑制劑作為新一類的分子靶向藥物，潛力巨大，前景廣闊。因此，需要 更多結構新穎、生物活性高、成藥性良好的PI3K抑制劑，用于腫瘤的靶向治療，以及用于抗 炎或治療自身免疫性疾病。

【發明內容】

[0043]本發明提供了一種新型的PI3K選擇性抑制劑。具體而言，本發明提供了一種由以 下通式（I)表示的稠環化合物或其藥學上可接受的鹽：
[0044]
[0045]其中，X表示0、S、NR、SO2或NH2Cl，R選自 H、C1-6的烷基，優選C1-4的烷基，Ri、R2、R 3、R4、 尺5、1?6、辦、1?8為獨立地選自由11、(：1-6的烷基、或具有0!1取代基的(： 1-6的烷基，優選為!1、(：1-4的烷 基或具有OH取代基的&-4的烷基。Ri、R 2、R3、R4、R5、R6、R7、R 8為獨立地選自由H、Ci-6的烷基、或 具有OH取代基的Ck的烷基。
[0046]具體而言，本發明可以選自以下化合物或其藥學上可接受的鹽：








[0057] 其他化合物的結構可以參照以上化合物進行解釋。
[0058] 本發明同時提供了包含上述化合物或其藥學上可接受的鹽的藥物組合物。本發明 稠環化合物或其藥學上可接受的鹽或所述的藥物組合物可以有效地抑制PI3K的活性。 [0059]所述化合物或其藥學上可接受的鹽，或所述藥物組合物作為PI3K抑制劑，可以作 為抗腫瘤藥物用于腦癌、頭頸癌、食管癌、肺癌、肝癌、胃癌、腎癌、胰腺癌、前列腺癌、結直腸 癌、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌、白血病、骨髓異常增生綜合癥、肉瘤、骨肉瘤或橫紋 肌瘤等腫瘤的治療。
[0060]所述化合物或其藥學上可接受的鹽，或所述藥物組合物作為PI3K抑制劑，可以作 為抗炎藥物用于慢性阻塞性肺病、哮喘等疾病的治療。
[0061] 所述化合物或其藥學上可接受的鹽，或所述藥物組合物作為PI3K抑制劑，可以作 為治療自身免疫性疾病(例如風濕性關節炎、銀肩病、系統性紅斑狼瘡)的藥物。
[0062] 本發明的化合物可以通過以下方法制備。所述方法包括使式（ΙΙΓ)的化合物與式 (IV)的化合物反應，得到式(I)的化合物的步驟：
[0063]
[0064] 其中X、R1、R2、R3、R4、R5、R 6、辦和心如前文所定義。
[0067] 本發明還提供了一種式(I)的化合物的制備方法，所述方法包括使式(IV'）的化合 物與式(ΠI)的化合物反應，得到式(I)的化合物的步驟：
[0065] 所述方法還包括使式(II)的化合物與式(III)的化合物反應得到式(ΙΙΓ)的化合 物白勺來藤.
[006d
[0068]
[0069] 其中父、1^、1?2、1?3、1?4、1?5、1? 6、1?7和1?8如前文所定義。
[0070] 所述方法還包括使式(II)的化合物與式(IV)的化合物反應得到式(IV'）的化合物 的步驟，
[0071]
[0072] 通過上述方法，能夠以高產率得到所需化合物。
[0073] 另外，本發明還提供了一種式(ΙΙΓ)的化合物或式(IV'）的化合物，
[0074]
[0075] 其中乂、1^、1?2、1?3、1?4、1^、1?6、辦和1? 8如前文所定義。式(111'）的化合物或式（1￥'）的化 合物可以用作合成式(I)的化合物的原料或中間體。
[0076] 發明人通過大量探索及試驗驗證，在稠環上特異性的引入氰基，與沒有氰基的化 合物以及氰基用其他取代基代替的化合物相比，本發明得到的上述化合物或其藥學上可接 受的鹽具有出乎預料的、非顯而易見對PI3K的抑制活性。
【具體實施方式】
[0077] 以下實施例中使用的原料、試劑均為市購。
[0078] 實施例1:Ν-(5-(3-氰基-4-硫代嗎啉基喹啉-6-基)-2_甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰 胺(化合物3)
[0079]
[0080] 步驟I :N-(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲烷磺酰胺
[ΠΠΗ11
123 將6-溴-4-氯喹啉-3-甲腈（140mg，0 · 6mmol)，N-(2-甲氧基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜環戊硼烷-2-基）吡啶-3-基）甲磺酰胺(203mg，0 · 618mmol，1 · 03eq)和2N碳酸 鉀水溶液(0. 9mL，1.8mmo I，3. Oeq)于二氧六環(6mL)中的混合物脫氣，并加入二(三苯基膦） 二氯化鈀（2Img，0.03mmol，0.05eq)。將產生的反應混合物脫氣并回充氬氣(三個循環），然 后在100 °C下氬氣氣氛中攪拌7小時。將反應混合物冷卻至室溫，用水(30mL)稀釋，乙酸乙酯 萃取(30mLX3)。合并有機層并用食鹽水(30mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，經快速 柱色譜(硅膠，二氯甲烷/甲醇=350:1，v/v)純化得到黃色固體(82mg，產率35 % )。 2 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.47(s,lH),9.21(s,lH),8.55(d,J = 2.2Hz,lH),8.44 (d ,J=1.6Hz,lH) ,8.39(dd ,J = 8.8,1.6Hz,lH) ,8.29(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.09(d ,J = 2.2Hz, lH),4.01(s,3H),3.13(s,3H). 3 步驟2: N-( 5-( 3-氰基-4-硫代嗎啉基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺
[0085]
[0086] 將N-(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基）-2-甲氧基吡啶-3-基）甲烷磺酰胺（156mg， 0.4mmol)溶于NMP(5mL)中，加入碳酸鐘（83mg，0·6mmol，I · 5eq)和硫代嗎琳（62mg，0 ·6mmol, 1.5eq)。將產生的反應混合物在100°C下攪拌2小時。冷卻反應混合物，用水(30mL)稀釋反應 混合物，乙酸乙酯(20mL X 3)萃取。合并有機層，依次用水(20mL)和食鹽水（I OmL)洗滌，無水 硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，經快速柱色譜（硅膠，DCM/MeOH= 100 :1，v/v)純化得白色固體 (63mg，產率為 34.6%)。
[0087] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.44(s,lH),8.81(s,lH),8.50(s,1H),8.25-8.15(m, 2H),8.13-8.03(m,2H),4.01(s,3H),3.88(br s,4H),3.13(s,3H),2.95(br s,4H).
[0088] 實施例2:
[0089] N-(5-(3-氰基-4-嗎啉基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺(化合物6)
[0090]
[0091]
[0092]
[0093] 將6_漠_4_氣-卩奎琳_3_甲臆（535mg，2 .Ommol)和嗎琳（523mg，6 .Ommol，3eq)于二氧 六環(7.5mL)中、在100°C下攪拌。反應結束后真空濃縮，濃縮液用水(20mL)稀釋，乙酸乙酯 (2〇11^\3)萃取。合并有機層，依次用水（2〇11^)和食鹽水（2〇11^)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過 濾，濃縮，經快速柱色譜(硅膠，石油醚/乙酸乙酯= 3:1，v/v)純化得到黃色固體(556mg，產 率為 87.4%)。
[0094] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)58.81(s,lH),8.20(d,J = 2.0Hz,lH),7.99(dd,J = 8.8, 2.0Hz,lH),7.93(d ,J = 8.8Hz,lH),3.87(t ,J = 4.4Hz,4H),3.68(t ,J = 4.4Hz,4H).
[0095] 步驟2: N_( 5-( 3-氰基-4-嗎啉基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺
[0096]
[0097] 將6-溴-4-嗎啉基喹啉-3-甲腈(96mg，0 · 3mmol)，N-(2-甲氧基-5-(4，4，5，5-四甲 基-1，3，2-二氧雜環戊硼烷-2-基)吡啶-3-基）甲磺酰胺（118mg，0.36mmol，1.2eq)和2N碳酸 鉀水溶液(〇. 45mL，3. Oeq)于二氧六環(4mL)中的混合物脫氣，然后加入[I，1 '-雙(二苯基膦 基)二茂鐵]二氯化鈀（1111^，0.015111111〇1，0.0569)。將產生的反應混合物脫氣并回充氬氣(三 個循環），然后在l〇〇°C下氬氣氣氛中攪拌5小時。將反應混合物冷卻至室溫，用（30mL)水稀 釋，用乙酸乙酯（30mL X 3)萃取。合并有機層并用食鹽水（30mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過 濾，濃縮，經快速柱色譜(硅膠，二氯甲烷/甲醇= 200:1，v/v)純化得到白色固體（104mg，產 率為 78.9%)。
[0098] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.45(s,lH),8.79(s,lH),8.48(d,J = 2.4Hz,lH),8.20 (d ,J=1.6Hz,lH) ,8.18(dd ,J = 8.6,2.0Hz,lH) ,8.08(d ,J = 8.6Hz , 1H) ,8.05(d ,J = 2.4Hz, lH),4.00(s,3H),3.91(t ,J = 4.4Hz,4H),3.73(t ,J = 4.4Hz,4H),3.13(s,3H).
[0099] 實施例3 :N-(5-(3-氰基-4-(2,6-二甲基嗎啉基）喹啉-6-基）-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺(化合物2)
[0100]
[0101] 制備方法如實施例1，步驟2)中將N-(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶- 3-基）甲烷磺酰胺
￡室溫下反應。
[0102] 1H NMR(400MHz,DMS0)59.42(s,1H) ,8.76(s,lH) ,8.45(d,J = 2.0Hz, 1H) ,8.26-8.14(m,2H) ,8.12-8.01 (m,2H),4.00(s,3H),3.99-3.90(m,2H),3.85(d J= 12.4Hz ,2H), 3.29-3.18(m,2H),3.13(s,3H),1.17(d ,J = 6.1Hz,6H).
[0103] 實施例4:N-(5-(3-氰基-4-(4-甲基哌嗪-I-基)喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基） 甲磺酰胺(化合物1)
[0104]
123 制備方法如實施例1，其中步驟2)將N-(5_(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2_甲氧基吡 啶-3-基）甲烷磺酰胺與N-甲基哌嗪在室溫下反應。 2 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.42(s，lH)，8.75(s，lH)，8.44(d，J = 2.2Hz，lH)，8.19 (d J= 1.6Hz, 1H) ,8.16(dd ,J = 8.8,1.6Hz,0H) ,8.06(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.04(d ,J = 2.2Hz, lH),4.00(s,3H),3.72(br s,4H),3.13(s,3H),2.65(br s,4H),2.31(s,3H). 3 實施例5: (R)-N-(5-(3-氰基-4-(3-甲基嗎啉基）喹啉-6-基）-2-甲氧基吡啶-3- 基）甲磺酰胺(化合物4)
[0108]
[0109] 制備方法如實施例1，其中步驟2)將N-(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡 啶-3-基）甲烷磺酰胺?
i在同樣條件下反應。
[0110] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.45(s，lH)，8.89(s，lH)，8.49(d，J = 2.4Hz，lH)，8.33 (d J= 1.6Hz, 1H) ,8.23(dd ,J = 8.8,2.0Hz,lH) ,8.13(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.06(d ,J = 2.4Hz, 1H),4.18-4.05(m,2H),4.01(s,3H),4.00-3.93(m,1H),3.92-3.82(m,1H),3.82-3.73(m, lH),3.63(dd J = 10.8,4.0Hz,lH),3.30-3.26(m,lH),3.13(s,3H),l.ll(d ,J = 6.4Hz,3H).
[0111] 實施例6: (S)-N-(5-(3-氰基-4-(3-甲基嗎啉基）喹啉-6-基）-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺(化合物5)
[0112]
[0113] 制備方法如實施例1，其中步驟2)將N-(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡 啶-3-基）甲烷磺酰胺與
生同樣條件下反應。
[0114] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.45(s，lH)，8.89(s，lH)，8.49(d，J = 2.4Hz，lH)，8.32 (d J= 1.6Hz, 1H) ,8.23(dd ,J = 8.8,2.0Hz,lH) ,8.13(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.06(d ,J = 2.4Hz, 1H) ,4.18-4.05(m,2H) ,4.01(s,3H) ,4.00-3.93(m,lH) ,3.93-3.72(m,2H) ,3.63(dd J = 11.2,4.0Hz,lH),3.30-3.26(m,lH),3.14(s,3H),l.ll(d,J=6.4Hz,3H).
[0115] 實施例7:N-(5-(3-氰基-4-((23,61〇-2,6-甲基嗎啉基)喹啉-6-基)-2-甲氧基吡 啶-3-基）甲磺酰胺(化合物56)
[0116]
[0117] 制備方法如實施例1，其中，步驟2)將N_(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2_甲氧基吡 啶-3-基）甲烷磺酰胺』
E同樣條件下反應。
[0118] 1H NMR(500MHz,DMS0-d6)59.42(s,lH),8.77(s,lH),8.45(s,1H),8.22-8.15(m, 2H) ,8.11-7.99(m,2H) ,4.00(s,3H),3.98-3.91 (m,2H),3.85(d J= 12.5Hz ,2H),3.23(t J = 11.5Hz,2H),3.13(s,3H),1.17(d ,J = 6.0Hz,6H).
[0119] 實施例8:N-(5-(3-氰基-4-(1， 1-二氧代硫代嗎啉基)喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺(化合物67)
[0120]
[0121 ] 制備方法如實施例1，其中，步驟2)將N_(5-(4-氯-3-氰基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡 啶-3-基）甲烷磺酰胺』
￡同樣條件下反應。
[0122] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.44(s，lH)，8.88(s，lH)，8.59(d，J = 2.0Hz，lH)，8.33 (d J= 1.6Hz, 1H) ,8.20(dd ,J = 8.8,1.6Hz,lH) ,8.13(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.08(d ,J = 2. OHz, lH),4.05(br s,4H),4.01(s,3H),3.56(br s,4H),3.13(s,3H).
[0123] 實施例9:N-(5-(3-氰基-4-(哌嗪-I-基)喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰 胺(化合物68)
[0124]
[0125] 按照實施例1的方法制備中間體4-(3-氰基-6-(6-甲氧基-5-(甲磺酰胺基）吡啶_ 3-基)喹啉-4-基)哌嗪-1-碳酸叔丁酯，再使用鹽酸甲醇溶液脫除Boc基團得到化合物68。
[0126] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.63(br s，2H)，9.46(s，lH)，9.00(s，lH)，8.54(d，J= 2.2Hz,lH) ,8.27(dd ,J = 8.8,1.6Hz,lH) ,8.23(d ,J=1.6Hz,lH) ,8.17(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.08(d ,J = 2.2Hz,lH),4.01(br s, 7H), 3.46(br s,4H) ,3.14(s,3H).
[0127] 實施例10其余化合物制備方法如實施例1，差別在于步驟2中采用下述表1中的原 料替換硫代嗎啉。
[0128] 表1



[0133] 對比例化合物：
[0134] 對比例1化合物:N-(2-甲氧基-5-(4-嗎啉基喹啉-6-基)吡啶-3-基）甲磺酰胺
[0135]
123456 步驟1:4-(6-溴喹啉-4-基)嗎啉 2 將6_漠 _4_氣-卩奎琳（243mg，1 · Ommol)和嗎琳（523mg，6 · Ommol，6eq)于二氧六環 (3mL)中的溶液在110 °C下攪拌48小時。在真空中濃縮反應混合物冷卻至室溫，用水(20mL) 稀釋，用乙酸乙酯（20mL X 3)萃取。用水(20mL)和食鹽水(20mL)洗滌合并的有機層，用無水 硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留物經快速柱色譜(硅膠，二氯甲烷/甲醇=1 〇〇: 1)純化得到產 物為淡黃色油狀物(21 Img，產率為72 % )。 3 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)58.75(d,J = 5.0Hz,lH),8.15(d,J = 2.2Hz,lH) ,7.92(d, J = 8.8Hz,lH) ,7.84(dd,J = 8.8,2.2Hz,lH) ,7.07(d,J = 5.0Hz,lH) ,3.94-3.82(m,4H), 3.20-3.09(m,4H). 4 步驟2:N-(2-甲氧基-5-(4-嗎啉基喹啉-6-基)吡啶-3-基）甲磺酰胺 5 將6-溴-4-嗎啉基喹啉（105mg，0 · 36mmol)，N-(2-甲氧基-5-(4,4,5,5-四甲基-1, 3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基）吡啶-3-基）甲磺酰胺（14111^，0.43111111〇1，1.26卩)和2~碳酸鉀水 溶液(〇. 54mL，1.08mmol，3. Oeq)于二氧六環(4mL)中的混合物脫氣，然后加入[I，1 '-雙(二 苯基膦基)二茂鐵]二氯化鈀（1311^，0.018111111〇1，0.0569)。將產生的反應混合物脫氣并回充 氬氣（三個循環），然后在l〇〇°C下氬氣氣氛中攪拌5小時。將反應混合物冷卻至室溫，用 (30mL)水稀釋，用乙酸乙酯（30mL X3)萃取。用食鹽水(30mL)洗滌合并的有機層，用無水硫 酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留物經快速柱色譜(硅膠，二氯甲烷/甲醇=60:1)純化得到產物為 淡黃色固體(11411^，產率為76.4%)。 6 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.42(s,lH),8.72(d,J = 4.9Hz,lH),8.45(d,J = 2.0Hz, 1H) ,8.16(dJ=1.2Hz,lH),8.10-7.98(m,3H),7.04(d,J = 5.0Hz,lH),4.00(s,3H),3.95-3.86(m,4H),3.27-3.19(m,4H),3.13(s,3H).
[0142] 對比例2化合物:N-(5-(3-(二氟甲基)-4-嗎啉基喹啉-6-基）-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺
[0143]
[0144] 步驟1:2-(((4-溴苯基)氨基)亞甲基)丙二酸二乙酯
[0145] 將 4-溴苯胺（10.328,60!11111〇1)和2-乙氧基亞甲基丙二酸二乙酯（12.968,60111111〇1， I.Oeq)的混合物在150°C下攪拌3小時。將反應混合物冷卻至室溫，用正己烷（IOOmL)稀釋。 抽濾收集產生的白色固體，用正己烷（50mL X 2)洗滌，真空中干燥得到產物為白色固體 (19.2g，產率為93.9%)，不作進一步純化直接用于下一步。
[0146] 步驟2:6-溴-4-羥基喹啉-3-羧酸乙酯
[0147] 將攪拌中的2-(((4-溴苯基)氨基)亞甲基）丙二酸二乙酯（10g，29.2mmol)和二苯 醚（IOOmL)的混合物加熱至回流。在其加熱至回流的過程中，將氮氣緩慢鼓泡進入反應混合 物在，然后在回流過程中在溶劑上方輕輕地吹氮氣。將反應混合物回流1小時，然后在氮氣 流下冷卻至室溫。用正己烷（IOOmL)稀釋反應混合物，抽濾收集產生的白色固體，用正己烷 (50mLX 3)洗滌，真空中干燥，得到產物為白色固體(7.8g，產率為90%)，不作進一步純化直 接用于下一步。
[0148] 步驟3:6_溴-4-氯喹啉-3-羧酸乙酯
[0149] 將6-溴-4-羥基喹啉-3-羧酸乙酯（IOg)于三氯氧磷（IOOmL)中的混合物在120 °C下 回流3小時。將反應混合物在真空中蒸發除去三氯氧磷。將殘留物倒入冰水中，用飽和碳酸 氫鈉水溶液調節pH值至6。用乙酸乙酯（IOOmL X 3)萃取產生的混合物。用食鹽水（IOOmL X 2) 洗滌合并的有機層，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留物經快速柱色譜(硅膠，石油醚/乙 酸乙酯=80:1)純化得到產物為白色固體(IOg，產率為94.1 % )。
[0150] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.19(s，lH)，8.53(d，J = 2.0Hz，lH)，8.14(dd，J = 8.9， 2.0Hz,lH),8.11(d ,J = 8.9Hz,lH),4.44(q ,J = 7.1Hz,2H),1.39(t ,J = 7.1Hz,3H).
[0151] 步驟4:6-溴-4-氯喹啉-3-甲醛
[0152] 在_80°C下氬氣氣氛中，向6-溴-4-氯喹啉-3-羧酸乙酯（I. 573g，5mmol)與無水二 氯甲烷（24mL)中的溶液中滴加 DIBAL-H溶液（1M甲苯溶液，8mL，8mmoI，1.6eq)。將產生的反 應混合物在-80°C下攪拌1小時，然后用甲醇淬滅，用水(20mL)稀釋，用二氯甲烷(20mLX3) 萃取。用水(30mL)和食鹽水(30mL)洗滌合并的有機層，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留 物經快速柱色譜(硅膠，石油醚/乙酸乙酯=15:1)純化得到產物為白色固體（I.075g，產率 為 79.5%)〇
[0153] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)5l0.54(s,lH),9.18(s,lH),8.57(d,J = 2.0Hz,lH),8.19 (dd ,J = 8.8,2.0Hz,lH),8.12(d ,J = 8.8Hz,lH).
[0154] 步驟5:6-溴-4-嗎啉基喹啉-3-甲醛
[0155] 將6-溴-4-氯喹啉-3-甲酸（324mg，I · 2mmol)和嗎啉（314mg，0 · 314mL，3 · 6mmol， 3. Oeq)于二氧六環（2.5mL)中的混合物在110°C下攪拌2.5小時。用水(30mL)稀釋反應混合 物，用乙酸乙酯（20mL X 3)萃取。用水(30mL)和食鹽水(30mL)洗滌合并的有機層，用無水硫 酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留物經快速柱色譜(硅膠，石油醚/乙酸乙酯=5:1)純化得到產物 為黃色固體(338mg，產率為87.7 % )。
[0156] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)5l0.42(s,lH),8.97(s,lH),8.34(d,J = 2.0Hz,lH),7.97 (dd ,J = 8.8,2.0Hz,lH),7.93(d ,J = 8.8Hz,lH),3.93-3.84(m,4H),3.68-3.57(m,4H).
[0157] 步驟6:4-(6-溴-3-(二氟甲基)喹啉-4-基)嗎啉
[0158] 在〇°C下向6-溴-4-嗎啉基喹啉-3-甲醛（321mg，I .Ommol)和乙醇（11.6yL， 0 · 2mmol，0 · 2eq)于二氯甲燒（5mL)中的溶液中加入二乙胺基三氟化硫（645mg，526yL， 4. Ommol，4eq)。將產生的反應混合物在0°C下攪拌0.5小時，在室溫下攪拌3小時。將反應混 合物倒入冰水中（20mL)，用飽和碳酸氫鈉水溶液調節pH至7，用二氯甲燒(20mL X 3)萃取。用 水(30mL)和食鹽水(30mL)洗滌合并的有機層，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留物經快 速柱色譜(硅膠，石油醚/乙酸乙酯=10:1~4:1)純化得到產物為黃色固體(296m g，產率為 86.3%)〇
[0159] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)58.98(s,lH),8.36(d,J=1.8Hz,lH),8.01(d,J = 9.0Hz, 1H) ,7.97(dd,J = 9.0,1.8Hz,lH),7.53(t,J = 54.4Hz,lH) ,3.91-3.82(m,4H),3.37-3.24 (m,4H).
[0160] 步驟7:N-(5-(3-(二氟甲基)-4-嗎啉基喹啉- 6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰 胺
[0161] 將 4-(6-溴-3-(二氟甲基)喹啉-4-基)嗎啉(8611^，0.25_〇1)，^(2-甲氧基-5-(4， 4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜環戊硼烷-2-基）吡啶-3-基）甲磺酰胺（99mg，0.30mmol， 1.4eq)和2N碳酸鉀水溶液(0.375mL，0.75mmol，3eq)于二氧六環(4mL)中的混合物脫氣，然 后加入PdCl 2(dppf) (13mg，0.0175mmol，0.07eq)。將產生的反應混合物脫氣并回充氬氣(三 個循環），然后在l〇〇°C下氬氣氣氛中攪拌5小時。將反應混合物冷卻至室溫，用水(30mL)稀 釋，用乙酸乙酯萃取(30mL X 3)。用飽和食鹽水(30mL)洗滌合并的有機層，用無水硫酸鈉干 燥，過濾，濃縮。殘留物經快速柱色譜(硅膠，DCM/CH 30H= 100 :1)純化得到產物為黃色固體 (95mg，產率為 81.8%)。
[0162] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.46(s，lH)，8.94(s，lH)，8.49(d，J = 2.4Hz，lH)，8.38 (d J= 1.2Hz, 1H) ,8.17(dd ,J = 8.8,1.6Hz,lH) ,8.14(d ,J = 8.8Hz , 1H) ,8.07(d ,J = 2.4Hz, 1H) ,7.54( t,J = 54.6Hz,lH) ,4.01 (s , 3H), 3.93-3.85(m, 4H), 3.43-3.35(m,4H), 3.13(s, 3H).
[0163] 對比例3化合物:N-(5-(3-(l，l-二氟乙基)-4-嗎啉基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲磺酰胺
[0164]
[0165] 步驟1:6-溴-3-碘喹啉-4-酚
[0166] 將6_漠卩奎琳_4_酸(2· 15g，9·6mmol)和N-鵬代丁二醜亞胺（2·6g，11 ·6mmol，I · 2eq) 于冰醋酸（25mL)中的混合物在50 °C下攪拌1小時。將反應混合物倒入水（IOOmL)中，抽濾收 集產生的黃色固體，用甲醇洗滌，在50°C下烘干，得淡黃色固體(2.7g，產率81 %)。該粗產物 不作進一步純化直接用于下一步。
[0167] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)5l2.37(s,lH) ,8.57(d,J = 4.6Hz,lH) ,8.19(d,J = 2.4Hz,lH),7.84(dd ,J = 8.8,2.4Hz,lH),7.57(d ,J = 8.8Hz,lH).
[0168] 步驟2:6-溴-4-氯-3-碘喹啉
[0169] 將6-溴-3-碘喹啉-4-酚（2 · 769g，7 · 9lmmol)于三氯氧磷（25mL)中的混合物回流 2.5小時。在真空中濃縮反應混合物，用水(IOOmL)稀釋殘留物。用飽和碳酸氫鈉水溶液中和 產生的混合物，用乙酸乙酯（I OOmL X 3)萃取。用水（I OOmL)和食鹽水（I OOmL)洗滌合并的有 機層，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留物經快速柱色譜(硅膠，石油醚/乙酸乙酯= 25: 1)純化得到產物為白色固體(0.93g，產率32 % )。
[0170] 1H NMR(400MHz，CDC13)S9.11(s，1H)，8.43(d，J = 2.0Hz，1H)，7.95((1, J = 8.8Hz， lH),7.84(dd ,J = 8.8,2.0Hz,lH).
[0171 ] 步驟3:6-漠氣乙氧基乙烯基)卩奎琳
[0172] 將6-溴-4-氯-3-碘喹啉（921mg，2.5mmol)，三丁基（1-乙氧基乙烯基）錫（948mg， 2.625mmol，I · 05eq)和三苯基神（153mg，0 · 5mm ο I，0 · 2eq)于 DMF( IOmL)中的混合物脫氣，然 后加入Pd2(dba)3(57mg，0.0625mmol，0.025eq)。將產生的反應混合物脫氣并回充氬氣(三個 循環），然后在60 °C下氬氣氣氛中攪拌6小時。將反應混合物冷卻至室溫，用水(IOOmL)稀釋， 用乙酸乙酯萃取(50mLX3)。用水(50mLX2)和飽和食鹽水(50mL)洗滌合并的有機層，用無 水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留物經快速柱色譜(硅膠，石油醚/乙酸乙酯=140:1~100:1) 純化得到產物為黃色固體(461mg，產率為59 % )。
[0173] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)58.89(s,lH),8.43(d,J=1.8Hz,lH),8.06(d,J = 8.8Hz, lH),8.03(dd ,J = 8.8,1.8Hz,lH),4.75(d ,J = 2.8Hz,lH),4.57(d ,J = 2.8Hz,lH),3.98(q J = 7.0Hz,2H),1.34(t ,J = 7.0Hz,3H).
[0174] 步驟4: ^6-溴-4-氯喹啉-3-基）乙酮
[0175] 將6-溴-4-氯-3-(1-乙氧基乙烯基）喹啉（461mg，1.47mmol)和2N HCl水溶液 (2. OmL)于THF( IOmL)中的混合物在室溫下攪拌3小時。將適量硅膠加到反應混合物中，真空 中除去揮發物。殘留物經快速柱色譜(硅膠，石油醚/乙酸乙酯=10:1)純化得到產物為黃色 固體(30〇11^，產率為71.5%)。
[0176] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.11(s,lH),8.50(d,J=1.6Hz,lH),8.13-8.07(m,2H), 2.76(s,3H).
[0177] 步驟5:6-溴-4-氯-3-( I，1-二氟甲基)喹啉
[0178] 在0 °C 下向 1_(6-溴-4-氯喹啉-3-基）乙酮（350mg，1.23mmol)和乙醇（14.3yL， 0.246_31，0.269)于二氯甲燒(71111^)中的溶液中加入二乙胺基三氟化硫(79311^，4.92_31， 4eq)。將產生的反應混合物在0°C下攪拌0.5小時，在室溫下攪拌過夜。將反應混合物倒入冰 水中（30mL)，用飽和碳酸氫鈉水溶液調節pH至7，用二氯甲燒(20mL X 3)萃取。用水(30mL)和 食鹽水(30mL)洗滌合并的有機層，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留物經快速柱色譜(硅 膠，石油醚/乙酸乙酯=20:1)純化得到產物為黃色固體(156mg，產率為41.3% )。
[0179] 1H NMR(400MHz，DMSO-Cl6)δ9 ·07(s，1H)，8 · 50(d，J = 2 ·OHz，1H)，8 · 14-8 · 08(m，2H)， 2.18(t ,J = 19.2Hz,3H).
[0180] 步驟6:4-(6-溴-3-(1,1-二氟乙基)喹啉-4-基）嗎啉
[0?81 ] 將6-溴-4-氯-3-( 1,1-二氟甲基)喹啉（137mg，0 · 45mmo 1)于嗎啉(5mL)中的混合物 在100 °C下攪拌2小時。用水（30mL)稀釋反應混合物，用乙酸乙酯（20mL X 3)萃取。用水 (30mL)和食鹽水(30mL)洗滌合并的有機層，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留物經快速 柱色譜（硅膠，石油醚/乙酸乙酯=20 :1~10 :1)純化得到產物為黃色固體（48mg，產率為 30%)。回收原料72mg。
[0182] 1H NMR(400MHz,DMS0-d6)59.01(s,lH),8.43(d,J = 2.0Hz,lH),8.06(d,J = 8.8Hz, 1H) ,7.99(dd,J = 8.8,2.0Hz,lH) ,3.81(t,J = 4.4Hz,4H) ,3.26(br s,4H) ,2.19(t,J = 19.2Hz,3H).
[0183] 步驟7:N-(5-(3-(l，l-二氟乙基)-4-嗎啉基喹啉-6-基)-2-甲氧基吡啶-3-基）甲 磺酰胺
[0184] 將4-(6-溴-3-(1，1-二氟乙基)喹啉-4-基）嗎啉(4511^，0.126_〇1)，^(2-甲氧基-5-(4,4,5,5-四甲基-1，3,2-二氧雜環戊硼烷-2-基）吡啶-3-基）甲磺酰胺（5〇11^， 0.15Immol，1.2eq)和2N碳酸鐘水溶液(0.189mL，0.378mmol，3eq)于二氧六環(4mL)中的混 合物脫氣，然后加入PdCl 2(dppf) (6 · 5mg，0 · 0088mmol，0 · 07eq)。將產生的反應混合物脫氣 并回充氬氣(三個循環），然后在l〇〇°C下氬氣氣氛中攪拌5小時。將反應混合物冷卻至室溫， 用水(30mL)稀釋，用乙酸乙酯萃取(30mL X 3)。用飽和食鹽水(30mL)洗滌合并的有機層，用 無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮。殘留物經快速柱色譜(硅膠，DCM/CH 30H= 110:1)純化得到產 物為黃色固體(36mg，產率為59.7 % )。
[0185] 1H NMR(400MHz，DMS0-d6)S9.47(s，lH)，8.98(s，lH)，8.50(d，J = 2.4Hz，lH)，8.44 (d J= 1.3Hz, 1H) ,8.20(d,J = 8.8Hz,lH),8.16(dd,J = 8.8,1.6Hz,lH),8.07(d,J = 2.4Hz, lH),4.01(s,3H),3.84(t ,J = 4.0Hz,4H) ,3.33(br s,4H) ,3.13(s,3H) ,2.21(t ,J = 19.2Hz, 3H).
[0186] 試驗部分
[0187] PI103指:3-[4-(4-嗎啉基吡啶并[3'，2'，4,5]呋喃并[3,2_d]嘧啶-2-基）]苯酚。
[0188] 試驗1化合物對激酶ΡΙ3Κα的抑制活性
[0189] 一、試驗方法
[0190] 1.制備IX激酶緩沖液
[0191] 50mM HEPES，pH 7.5
[0192] 3mM MgCl2
[0193] ImM EGTA
[0194] IOOmM NaCl
[0195] 0.03 % CHAPS
[0196] 2mM DTT
[0197] 2.待測化合物DMSO溶液的制備及稀釋
[0198] 1)將化合物用100 % DMSO溶解，所配濃度為測試中所需最高抑制濃度的100 X。轉 移IOOyL該溶液至96孔板的一個孔內。例如，如果所需最高抑制劑濃度是ΙμΜ，則這一步需制 備1 ΟΟμΜ的化合物DMSO溶液。
[0199] 2)對于所有的化合物，將管內的化合物轉移至96孔儲備板的一個孔內，再轉移30μ L至含有60yL 100%DMS0的下一個孔內，以此方式對化合物進行稀釋。
[0200] 3)在同一張96孔板上，分別加入IOOyL 100%DMS0至2個空白孔內作為無化合物對 照和無酶對照，這張板記為源板。
[0201] 3.制備中介板
[0202] 1)從源板轉移4yL化合物至一張新的96孔板，以此作為中介板。
[0203] 2)中介板每孔內加入96yL IX激酶緩沖液。
[0204] 3)在振蕩器上將中介板內的化合物混合IOmin。
[0205] 4.制備測試板
[0206]從中介板的每孔中轉移2.5yL的液體至一張384孔板，并設立復孔。例如，96孔板的 Al轉移到384孔板的Al和A2孔。96孔板的A2轉移到384孔板的A3和A4,以此類推。
[0207] 5.ΡΙ3Κα 激酶反應 [0208]制備4 X激酶溶液
[0209] 1)在I X激酶緩沖液中制備ΡΙ3Κα溶液，每種試劑的濃度為測試時最終濃度的4倍。
[0210]最終濃度:ΡΙ3Κα為 1·65ηΜ。
[0211] 2)測試板每孔加2.5yL激酶溶液，不含酶的對照孔除外（加2.5yL I X激酶緩沖液 代替）。
[0212] 3)振蕩測試板。
[0213] 制備2 X底物溶液
[0214] 1)在IX激酶反應緩沖液中制備含PIP2底物和ATP的底物溶液，每種試劑的濃度均 為測試時最終濃度的2倍。
[0215] 最終濃度:PIP2 為 50μΜ，ΑΤΡ 為 25μΜ。
[0216] 2)測試板每孔加入5yL底物溶液開始反應。
[0217] 3)振蕩測試板
[0218]激酶反應
[0219] 1)測試板加蓋于室溫孵育1小時。
[0220] 6激酶檢測
[0221] 1)將Kinase-Glo試劑平衡至室溫。
[0222] 2)測試板每孔加入IOyL的Kinase-Glo試劑終止反應。
[0223] 3)離心短暫混合，在用讀板器測量發光強度之前于振蕩器上緩慢振搖15min。
[0224] 7 讀板
[0225]在Synergy上收集數據
[0226] 8.曲線擬合
[0227] 1)從Synergy程序中拷貝RLU(相對光單位)值。
[0228] 2)將RLU值轉換成百分抑制率。
[0229] 百分抑制率= 100-(最高RLU-樣本RLU)/(最高RLU-最低RLU)*100
[0230] "最高RLU"指無酶對照孔的RLU值，"最低RLU"指DMSO對照孔的RLU值。
[0231]二、結果：
[0233]同樣的試驗方法測得下述化合物的IC50:
[0235] 三、結論：
[0236] 實施例化合物都顯示了對激酶ΡΙ3Κα的抑制活性，尤其是化合物1~6具有很高的 活性:對激酶PI 3Κα的I C5q都在IOnM左右甚至以下。
[0237] 試驗2化合物對激酶PI3K γ的抑制活性
[0238] -、試驗方法
[0239] 1.制備IX激酶緩沖液
[0240] 50mM HEPES，pH 7.5
[0241] 3mM MgCl2
[0242] ImM EGTA
[0243] IOOmM NaCl
[0244] 0.03 % CHAPS
[0245] 2mM DTT
[0246] 2.制備4X激酶溶液
[0247] 1)在I X激酶緩沖液中制備PI3K γ溶液，每種試劑的濃度為測試時最終濃度的4 倍。
[0248] 終濃度:ΡΙ3Κγ 為7·6ηΜ。
[0249] 2)測試板每孔加2.5yL激酶溶液，不含酶的對照孔除外（加2.5yL I X激酶緩沖液 代替）。
[0250] 3)振蕩測試板。
[0251] 3.制備2 X底物溶液
[0252] 1)在I X激酶反應緩沖液中制備含PIP2底物和ATP的底物溶液，每種試劑的濃度均 為測試時最終濃度的2倍。
[0253] 終濃度：PIP2 為 50μΜ，ΑΤΡ 為 25μΜ。
[0254] 2)測試板每孔加入5yL底物溶液開始反應。
[0255] 3)振蕩測試板
[0256] 4.激酶反應
[0257] 測試板加蓋于室溫孵育1小時。
[0258] 5.激酶檢測
[0259] 1)將ADP-Glo試劑平衡至室溫。
[0260] 2)從384孔板轉移5yL反應混合物至一張新的384孔板。
[0261] 3)新測試板每孔加入5yL ADP-Glo試劑終止反應。
[0262] 4)離心短暫混合，于振蕩器上緩慢振搖，平衡40min。
[0263] 5)每孔加入IOyL激酶檢測試劑，振搖lmin，在用讀板器測量發光強度之前平衡 60min〇
[0264] 6.讀板
[0265]在Synergy上收集數據。
[0266] 7.曲線擬合
[0267] 1)從Synergy程序中拷貝RLU值。
[0268] 2)將RLU值轉換成百分抑制率。
[0269] 3)數據存于MS Excel，用Graphpad 5.0擬合曲線。
[0270] 百分抑制率= 100-(最高RLU-樣本RLU)/(最高RLU-最低RLU)*100
[0271] "最高RLU"指無酶對照孔的RLU值，"最低RLU"指DMSO對照孔的RLU值。
[0272] 二、結果： LUZ/4」 二、铦論：
[0275] 實施例化合物1、4、6都顯示了很高的對激酶PI3K γ的抑制活性，其IC5q都在IOnM以 下。
[0276] 試驗3:化合物在MCF-7細胞上對Akt的Serine 473磷酸化的抑制
[0277] 細胞株 L0279」一、買驗萬法
[0280]第1天細胞鋪板
[0281] a.在顯微鏡下觀察細胞株生長狀態，在細胞株生長狀態良好時開始實驗。
[0282] b.將細胞培養瓶從培養箱中取出，核對瓶上標記的細胞名稱，培養基類型及細胞 代數。
[0283] c.棄去培養基，用胰酶消化，消化完后，用含血清的培養基中和，吹打細胞，使細胞 脫落。
[0284] d.用移液管將細胞懸液移入離心管中，1000 rpm的轉速離心5分鐘。
[0285] e.吸棄離心管中的細胞上清液。
[0286] f.向離心管中加入適當體積的培養基，輕柔吹打使細胞重懸均勻。
[0287] g.使用Vi-Ce 11 XR細胞計數儀計數。
[0288] h.將細胞懸液調至合適濃度。
[0289] i .將細胞懸液加入384孔細胞培養板中，36μ!7孔。標記細胞名稱，種板密度，日期 等詳細信息，將培養板放置于CO2培養箱中孵育過夜。
[0290]實驗條件：
[0292] 第2天加化合物
[0293] 」.吸棄24以1^細胞上清，加24以1^新鮮01^1+10%?83培養基，37°(：，5%0)2孵育211。
[0294] k.用DMSO將待測化合物配制成8mM溶液，然后3倍梯度稀釋成9個濃度。
[0295] 1.將梯度稀釋的化合物用完全培養基(DMEM+10 %FBS)配成4 X溶液，每孔加12yL 化合物到384孔細胞培養板(3701)(化合物的排布和最終濃度如下），37°C，5%CO2孵育2h。
[0297] 注:Torin 1作為內參化合物;DMSO的最終濃度是0.5%。
[0298] m.吸棄上清38yL，加 IOyL 2X裂解緩沖液，室溫振30min后-80°C過夜。
[0299] 第3天AlphaScreen 檢測
[0300] η·室溫解凍細胞裂解液，轉移IOyL裂解液到檢測板(Optiplate-384)。
[0301] 〇 ·加5yL Acceptor beads到檢測板，室溫孵育2小時。
[0302] p ·加5yL Donor beads到檢測板，室溫孵育2小時。
[0303] q.用EnSpire Multimode讀板器檢測，讀取結果。
[0304] r ·在Exce 1中用XL-fi t軟件計算化合物抑制的IC50值。
[0305] 二、結果：
[0307] 三、結論：
[0308]該實驗為細胞水平的活性測試，體現了化合物在活細胞上對PI3K的抑制活性。化 合物6相較于對比例1化合物，分子結構中僅增加了一個氰基，但是其細胞活性卻顯著高于 后者，IC5q值相差4倍多。可見，化合物6中氰基的引入，具有出乎預料的、非顯而易見的提升 細胞活性的效果。
[0309] 試驗4:化合物在MCF-7細胞上對Akt的Serine 473磷酸化的抑制
[0310] -、試驗方法:與試驗3相同。
[0311] 二、結果：
[0313] 三、結論：
[0314] 該細胞水平的活性測試，顯示了化合物1~4在活細胞上對PI3K的抑制活性均顯著 優于對比例1化合物，IC5q值相差3到5倍。與對比例1化合物相比，本發明化合物1~4均在稠 環上相同取代位置引入一個氰基，這些結果進一步表明，化合物1~4中氰基的引入，具有顯 著的提升細胞活性的效果。
[0315] 試驗5心111^6廣61〇((^)法測試化合物在1]87]\^細胞株的細胞增殖實驗
[0316] -、實驗設計
[0317] 在U87MG細胞中測定化合物對細胞增殖的抑制活性，并每株細胞設定一個陽性對 照、一個空白對照和一個溶媒對照。
[0318] 二、實驗材料
[0319] 細胞系
[0321] 置于37 °C、5 % CO2、95 %濕度條件下培養。
[0322] 試劑和耗材
[0323] 胎牛血清FBS(GBICO)，CdiTiter-Gloi.Luminescent Cell Viability Assay (Promega)，96孔透明平底黑壁板(Corning)。
[0324]待測藥
[0326] 母液凍存于-20 °C。
[0327] 陽性藥
[0329] 三、實驗儀器
[0330] EnVis ion 多標記微孔板檢測儀，PerkinElmer，2104_0010A;
[0331] CO2培養箱，Thermo Scientific，Model 3100Series;
[0332] 生物安全柜，Thermo Scientific，Model 1300Series A2;
[0333] 倒置顯微鏡，Olympus，CKX41 SF;
[0334] 電子天平，METTLER-TOLEDO，AL-104;
[0335] 冰箱，SIEMENS，ΚΚ25Ε76ΤΙ。
[0336] 四、對細胞增殖的抑制活性測定
[0337] 細胞培養和接種：
[0338] 收獲處于對數生長期的細胞并采用血小板計數器進行細胞計數。用臺盼藍排斥法 檢測細胞活力，確保各細胞系活力在96%以上。
[0339] 用培養液稀釋調整細胞濃度，添加90yL細胞懸液至的96孔板中使細胞密度達到指 定的濃度。
[0340] 96孔板中的細胞置于37 °C、5 % C〇2、95 %濕度條件下培養過夜。
[0341] 加藥：
[0342] 藥物稀釋。用相應溶劑溶解被測化合物形成儲存液并進行梯度稀釋，得到10倍溶 液;同樣制備陽性藥的10倍溶液。
[0343] 加藥。在已接種細胞的96孔板中每孔加入IOyL藥物溶液，每個細胞濃度設置三個 復孔。被測化合物的最高濃度為50μΜ，9個濃度，3.16倍稀釋。
[0344]培養。將已加藥的96孔板中的細胞置于37°C、5%⑶2、95%濕度條件下繼續培養96 小時，分別進行CTG分析。
[0345] 終點讀板：
[0346] 融化CTG試劑并平衡細胞板至室溫30分鐘。
[0347] 每孔加入等體積的CTG溶液。
[0348] 在定軌搖床上振動2分鐘使細胞裂解。
[0349] 將細胞板放置于室溫10分鐘以穩定冷光信號。
[0350] 用EnVision讀取冷光值。
[0351] 數據處理
[0352]使用GraphPad Prism 5.0軟件分析數據，利用非線性S曲線回歸來擬合數據得出 劑量-效應曲線，并由此計算IC5Q值。
[0353 ]細胞存活率（％) = ( Lu_sr-L_舖卿,?) / (Lu_j_rLum賴|_照）X 100 %
[0354] Lum是指:冷光值。
[0355] 五、結果：
[0357] 為另一次以相同方法獨立進行的實驗結果。
[0358]六、結論：
[0359]該實驗為細胞水平的增殖抑制測試，體現了化合物對細胞增殖的抑制活性。與化 合物6相比，對比例1化合物稠環上沒有氰基，對比例2化合物和對比例3化合物在相同取代 位置用其他基團替代氰基。試驗結果表明，化合物6對U87MG細胞的增殖抑制活性顯著高于 所有對比例化合物，IC 5q值均相差在3倍以上。可見，化合物6中氰基的引入，具有出乎預料 的、非顯而易見的提升細胞活性的效果。
[0360]試驗eCellTiter-Glo法測試化合物對5株人腫瘤細胞株增殖活性抑制的研究 [0361 ] -、實驗方法:與試驗5相同。
[0363]二、結果：
[0365] 三、結論：
[0366] 該實驗比較了化合物6與對比例1化合物對不同腫瘤細胞株的增殖抑制活性。化合 物6相較于對比例1化合物，分子結構中僅增加了一個氰基，但是其細胞增殖抑制活性卻顯 著高于后者，二者在了470、1^^7^2780、％1-!11975^549等多種細胞株上的1(： 5()值均相差約3 ~6倍。可見，化合物6中氰基的引入，具有出乎預料的、非顯而易見的提升細胞活性的效果。
[0367] 試驗7CellTiter-Glo法測試化合物對5株人腫瘤細胞株增殖活性抑制的研究
[0368] 一、實驗方法:與試驗5相同。
LUJ/Ζ」 二、珀化：該頭版測訊」億甘徹個丨η」^熘瑚胭休的項甩仰明沾怔，珀米衣明，億 合物6在^'20、8了474、31(-0￥-3、％1-!1460、％1-!11650等多種腫瘤細胞株上都表現出了很好 的增殖抑制活性，IC5Q值均在ΙμΜ以下。
【主權項】
1. 一種由以下通式(I)表示的化合物或其藥學上可接受的鹽：其中，X表示0、S、NR、S〇2 或NH2C1，R選自 Η、Ci-6 的烷基，Ri、R2、R3、R4、R5、R6、R7、Rs獨立地選 自Η、&-6的烷基、或具有OH取代基的6的烷基。2. 如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，RSCh的烷基，R^R^Rs、 R4、Rs、R6、R7、Rs為獨立地選自Η、&-4的烷基、或具有OH取代基的4的烷基。3. 如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，R為甲基或乙基， R4、R5、R6、R7、R8為甲基或乙基。4. 如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽，其中，所述化合物選自以下化合 物或其藥學上可接受的鹽：5. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含如權利要求1-4中任一項所述的化合物或其 藥學上可接受的鹽。6. 如權利要求1-4中任一項所述的化合物或其藥學上可接受的鹽、或如權利要求5所述 的藥物組合物在制備用于抑制磷脂酰肌醇3-激酶的藥物中的應用。7. 如權利要求6所述的應用，其中所述的藥物為抗腫瘤藥物。8. 如權利要求7所述的應用，其中，所述的腫瘤選自：腦癌、頭頸癌、食管癌、肺癌、肝癌、 胃癌、腎癌、胰腺癌、前列腺癌、結直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、皮膚癌、白血病、骨髓 異常增生綜合癥、肉瘤、骨肉瘤或橫紋肌瘤。9. 如權利要求6所述的應用，其中所述的藥物為抗炎藥物或治療自身免疫性疾病的藥 物。10. 如權利要求9所述的應用，其中所述的抗炎藥物是用于治療慢性阻塞性肺病或哮喘 的藥物。11. 如權利要求9所述的應用，其中自身免疫性疾病選自風濕性關節炎、銀肩病或系統 性紅斑狼瘡。12. -種如權利要求1-4任一項所述的式（I)的化合物的制備方法，所述方法包括使式 (IIΓ )的化合物與式(IV)的化合物反應，得到式(I)的化合物的步驟：其中乂、1?1、1?2、1?3、1?4、1^、1?6、1?7和1?8如權利要求1-4中任一項所定義。13. 如權利要求12所述的方法，其中，所述方法包括使式（II)的化合物與式（III)的化 合物反應得到式(IIΓ )的化合物的步驟，14. 一種如權利要求1-4任一項所述的式（I)的化合物的制備方法，所述方法包括使式 (IV '）的化合物與式(III)的化合物反應，得到式(I)的化合物的步驟：其中乂、1?1、1?2、1?3、1?4、1^、1?6、1?7和1?8如權利要求1-4中任一項所定義。15. 如權利要求14所述的方法，其中，所述方法包括使式(II)的化合物與式（IV)的化合 物反應得到式(IV'）的化合物的步驟，16. -種式(IIΓ )的化合物或式(IV'）的化合物，其中乂、1?1、1?2、1?3、1?4、1^、1?6、1?7和1?8如權利要求1-4中任一項所定義。
【文檔編號】A61P17/06GK105859684SQ201610235304
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月15日
【發明人】龍凱, 廖立東, 王萬
【申請人】四川賽諾唯新生物技術有限公司