具有改進的基因表達能力的表達載體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及具有改進的基因表達能力的表達載體、由所述表達載體轉化的細胞，以及通過使用所述細胞來大量生產靶蛋白的方法。與典型的動物細胞表達載體相比，根據本發明的表達載體顯示出更優異的基因表達能力，因此，可以顯著提高異源基因的蛋白質表達。
【專利說明】
具有改進的基因表達能力的表達載體
技術領域
[0001] 本發明涉及用于改進基因表達的表達載體、由所述表達載體轉化的細胞以及通過 使用所述經轉化的細胞來大量生產靶蛋白的方法。
【背景技術】
[0002] 在大多數情況下，已經通過使用動物細胞進行了治療性重組蛋白和抗體的生產， 并且正在努力提高生產效率。
[0003] 例如，在無血清培養基中預適應的懸浮宿主細胞系已被用于快速選擇高生產細胞 系(producer cell line)。此外，已經不斷開發高表達載體和高生產細胞系以消除或縮短 基因擴增所需的時間。還在努力地開發一種通過在細胞系的初始選擇中使用自動化的細胞 選擇裝置的有效方法。
[0004] 高生產細胞系顯示出30至80pcd的表達水平(甚至是在沒有基因擴增時），并且高 生產細胞系可通過使用基于基質附著區(matrix attachment region，MAR)或類似于MAR的 普遍存在的染色質開放元件（ubiquitous chromatin opening element，UC0E)的高表達載 體而在4個月內制備。
[0005] 最近的研究表明，載體優化對于在六個月內實現3g/L至5g/L的抗體生產率是必需 的。最近，對MAR元件（例如雙-MAR、多-MAR、反式-MAR等）的優化暗示了生產率提高的可能 性，但是仍持續需要可通過引入5'UTR或內含子元件來獲得具有改善的生產效率的穩定載 體。
【發明內容】
[0006] 因此，本發明的一個目的是提供用于大量表達和生產靶蛋白的表達載體。
[0007] 本發明的另一個目的是提供由上述表達載體轉化的細胞。
[0008] 本發明的再一個目的是提供通過使用所述經轉化的細胞來大量生產靶蛋白的方 法。
[0009] 為了實現如上所述的本發明的一個目的，提供了包含可操作地連接的猿猴病毒40 (simian virus 40，SV40)啟動子、支架附著區（scaffold attachment region，SAR)或基質 附著區(MAR)元件以及嵌合內含子的表達載體。
[0010] 為了實現如上所述的本發明的另一個目的，提供了由上述表達載體轉化的細胞。
[0011] 為了實現如上所述的本發明的再一個目的，提供了通過培養所述經轉化的細胞來 大量生產靶蛋白的方法。
[0012] 與常規表達載體相比，根據本發明的表達載體顯示出優異的基因表達，因此，可以 顯著提高外源基因的蛋白質表達。
【附圖說明】
[0013] 通過本發明的以下描述結合所附附圖，本發明的上述目的和特征以及其他目的和 特征將變得明顯。
[0014]圖1示出了關于MAR候選元件的螢光素酶(luciferase)載體的示意圖。
[0015] 圖2示出了 MAR候選元件的螢光素酶表達結果。
[0016] 圖3示出了比較啟動子測試的螢光素酶表達結果。
[0017] 圖4示出了關于LCR(基因座控制區（locus control region))候選元件的螢光素 酶載體的示意圖。
[0018] 圖5示出了用于制備Alb E64X4LCR元件的PCR策略。
[0019 ]圖6和7示出了 LCR候選元件的螢光素酶表達結果。
[0020]圖8不出了dCFH(人補體因子H的缺失形式（deletion form of human complement factor H))的制備過程。
[0021] 圖9示出了 dCFH在CH0-S細胞中的表達水平。
[0022] 圖10示出了 dCFH在293-F細胞中的表達水平。
[0023] 圖11示出了 dCFH在CH0-DG44穩定細胞中的表達水平。
[0024]圖12和13分別示出了 FIX表達載體組1的示意圖及其表達結果。
[0025]圖14和15分別示出了 FIX表達載體組2的示意圖及其表達結果。
[0026]圖16示出了嘌呤霉素 (Puromy c in)表達系統的限制性酶圖譜。
[0027] 圖17示出了一對新載體pMS-P-MCS和pMS-D-MC的結構。
[0028]圖18A和18B分別示出了用于ER2抗體表達的第一對新載體（"新載體對I"）（pMS-P-ER2LC 和 pMS-D-ER2HC)以及一對 MAR 載體(pMSGne〇-ER2LC 和 pMSGne〇-ER2HC)的結構。
[0029]圖19示出了用于ER2抗體表達的第二對新載體（"新載體對II"）（pMSI-P-ER2LC和 PMSI-D-ER2HC)的結構。
[0030] 圖20A和20B分別示出了一對啟動子載體(pS)(pS-P-ER2LC和PS-D-ER2HC)以及一 對內含子載體(P SI-P-ER2LC和p SI-D-ER2HC)的結構。
[0031] 圖21A和21B分別示出了在CH0貼壁細胞CH0-K1和DG44中ER2抗體的表達水平。
【具體實施方式】
[0032] 在本發明中，為了制備用于在CH0(中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary))細胞 等中表達外源基因之具有改進生產效率的穩定表達載體，在多種MAR元件、支架附著區 (scaffold attachment region，SAR)元件、基因座控制區（locus control region，LCR)和 內含子元件中鑒定出可提高基因表達水平的元件。
[0033]因此，本發明提供了包含可操作地連接的SV40(猿猴病毒40(simian virus 40)) 啟動子、支架附著區（SAR)或基質附著區(MAR)元件以及嵌合內含子的表達載體。
[0034]如本文所使用的術語"啟動子"是指編碼區上游(upstream)的非翻譯核酸序列，其 包含聚合酶結合位點并且對于下游基因具有mRNA轉錄起始活性。具體地，"啟動子"包含通 過RNA聚合酶來起始轉錄的TATA盒或TATA樣區域;但并不限于圍繞其的區域;并且可包含對 于與除RNA聚合酶之外的蛋白質締合以調控表達而言必需的區域。
[0035] 在本發明中，啟動子可包括SV40啟動子或其變體，優選由SEQ ID N0:12表示的 SV40啟動子。啟動子變體是指這樣的變體，其中啟動子序列的某一部分通過添加、缺失或替 換而被修飾以提尚基因表達。
[0036] 根據本發明的一個實施方案，與CMV啟動子相比，本發明的使用SV40啟動子的表達 載體顯示出約4倍的表達提高(參見實施例1-1)。
[0037] 此外，這樣的啟動子與為外源基因的靶基因可操作地連接;如本文所使用的"可操 作地連接(operably linked)"意指調控革巴基因表達的核酸序列和編碼革巴蛋白的核酸序列 功能性連接以使得他們可執行一般功能。可使用本領域中已知的重組DNA技術來實現與重 組載體的可操作地連接;并且可使用本領域通常已知的酶進行位點特異性DNA切割和連接。 [0038] 在本發明中，可包括用于提高基因表達的元件的SAR或MAR元件。可包括SAR或MAR 元件來構成表達載體以使得這樣的元件可存在于啟動子的5'端、3'端或者5'和3'端二者。 [0039]如本文所使用的"MAR元件"是指暫時將轉錄活性DNA環狀結構域附著至核基質 (Nuclear matrix)的DNA序列（Pienta 等，（1991)Crit.Rev.Eukaryotic Genne Expres.，l: 355-385)，MAR序列的實例在本領域中是已知的。
[0040]在本發明中，為了選擇提高基因表達的元件，針對人珠蛋白MAR(Yu，J .，Bock， J.H.，Slightom，J. L?和Villeponteau，B.，Gene 139(2)，139-145(1994)，基因庫 No.L22754)和人CSP-B基因側翼（flanking)SAR(Hanson，R.D?和Ley，T.J.，Blood，79(3)， 610-618(1992)，基因庫No.M62716)使用螢光素酶測定（luciferase assay)進行了雙重(5， 和5'+3'）和順式+反式相關測試(cis+trans related test);結果是篩選出某些合乎期望 的元件(參見實施例1-1)。
[0041 ] 上述1^1?或3六1?元件可以是由3￡〇10勵:39表示的人03?-8 3六1?;從人陽求蛋白]\^1? 分離的由3￡〇10勵:40表示的]\^1?2.2或由5￡〇10勵:41表示的]\^1?3.0。可包括5六1?或1^1?元 件以使所述元件可存在于啟動子的5'端、3'端或者5'和3'端二者。
[0042]根據本發明的一個實施方案，所述元件可以是被命名為5 ' MAR2.2、5 'MAR3.0、3 ' 麻尺2.2、3'麻1?3.0、5'3'麻1?2.2或5'3'麻1?3.0的一個元件。
[0043] 根據本發明的表達載體可包含嵌合內含子(Chimeric intron)以提高基因表達。
[0044] 這樣的嵌合內含子可以由SEQ ID N0:25表示（Backliwal，G.，Hildinger，M.， Chenuet,S.,ffulhfard,S.,De Jesus,M.,ffurm,F.M.,Nucleic Acids Res.,36(15),e96 (2008)，基因庫No. JQ795930)，但本發明不限于此。在本發明中，通過螢光素酶測定來確認 基因表達提高的效果(參見實施例1-3)。
[0045] 根據本發明，包含MAR元件和嵌合內含子元件二者的表達載體顯示出生產率的協 同效應，從而導致基因表達水平提高(參見實施例3-3和表9)。
[0046] 根據本發明的一個實施方案，與常規啟動子載體、常規內含子載體以及不含嵌合 內含子的新載體對I (PMS-P-D-ER2LC和pMS-ER2HC)相比，包含MAR元件、SV啟動子和嵌合內 含子的新載體對II(pMSI-P-ER2LC和pMSI-D-ER2HC)表現出優異的基因表達提高效果。
[0047] 根據本發明的表達載體還可包含LCR元件。
[0048]在本發明中，為了鑒定提高基因表達的元件，針對AAT108(a-1-抗胰蛋白酶前體， 120bp，SEQ ID N0:13)和Alb E6(血清白蛋白前原蛋白，81bp，SEQ ID N0:14)(其先前顯示 出提高因子IX表達的效果，如在國際公布No.W0 2009/102085中公開的）使用螢光素酶測定 進行了多聚體（XI和X4)和雙重(5'、3'和5'+3'）相關測試，結果是篩選出優選的^^元件 (參見實施例1-2)。
[0049] 在本發明中優選的LCR元件可以是由SEQ ID勵:15表示的441108\4，其可以這樣 的方式被包含:使其僅存在于載體的3'端(3'AAT 108X4);或5'和3'端二者(5'3'AAT 108 X4)。另外，LCR元件可以是由SEQ ID NO:16表示的Alb E6X4。
[0050] 此外，表達受啟動子調控的靶基因可被插入到本發明的表達載體中。
[0051] 靶基因是編碼待表達的外源產物的基因，且可以是編碼可被表達為重組蛋白的任 何類型蛋白質的基因。這樣的革巴基因包括"多克隆位點(multiple cloning site，MCS)"（其 是具有限制性酶切位點的核酸序列）以便被插入到載體中。
[0052] 上述靶基因可以是血液凝固相關基因和多種抗體基因中的一種；且可以選自，例 如：因子￥11(&(^(^￥11，卩￥11)基因、因子￥111(&(^(^￥111，卩￥111)基因、因子1父(^1(^(^ IX，FIX)基因、表皮生長因子受體家族抗體基因 （epidermal growth factor receptor family)、胰島素基因、白細胞介素基因、腫瘤壞死因子基因、干擾素基因、集落刺激因子基 因、趨化因子基因、促紅細胞生成素基因、甲胎蛋白基因、葡糖苷酶基因、al_抗胰蛋白酶 基因、抗凝血酶基因、脂蛋白基因、血漿銅藍蛋白（celluloplasmin)基因、纖維蛋白原基因、 葡糖腦苷脂酶基因、觸珠蛋白基因、纖維蛋白溶酶原基因、凝血酶原基因和轉鐵蛋白基因， 但不限于此。根據本發明的一個實施方案，靶基因可以是FIX(因子IX(factor IX))基因或 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor)ER2抗體基因。
[0053]根據本發明的表達載體可包含任何常規已知的轉錄終止子。優選地，它可以連接 至polyA。例如，它可包含SV40晚期聚腺苷酸化信號(polyA)。
[0054]根據本發明的一個實施方案，本發明的表達載體具有圖19所示的pMSI-P-ER2LC或 pMSI -D-ER2HC的酶切圖譜。圖19示意性地示出了包含提高基因表達的元件(例如MAR元件、 嵌合內含子元件、SV40啟動子、po lyA等)的表達載體。
[0055]同時，本發明提供了由上述表達載體轉化的細胞。
[0056]如本文中所使用的細胞可以是通常已知的動物細胞，并且可以優選地選自：CH0-K1 細胞、CH0-DG44細胞、CH0-S細胞、CH0 DUKX-B11 細胞、C0S3細胞、C0S7細胞、COS 1 細胞、NS0 細胞、HeLa細胞、Vero細胞、PER-C6細胞、HepG2細胞和BHK細胞，但不限于此。
[0057]另外，本發明提供了使用上述表達載體生產靶蛋白的方法。更具體地，本發明提供 了用于大量生產靶蛋白的方法，其包括:培養由上述表達載體所轉化的細胞以表達靶蛋白， 然后回收所述靶蛋白。
[0058]這樣的方法可包括以下步驟：
[0059] (1)將表達受啟動子調控的靶基因插入到表達載體中；
[0060] (2)用其中插入了靶基因的表達載體轉化細胞；以及
[0061 ] (3)培養由所述表達載體所轉化的細胞以表達靶蛋白，然后回收所述靶蛋白。
[0062] 用于插入靶基因、轉化細胞和培養細胞以表達靶蛋白以及回收所述靶蛋白的方法 可通過使用本領域中已知的技術來實施。
[0063] 用以下的實施例更詳細地說明本發明。以下實施例旨在進一步說明本發明而不限 制其范圍。
[0064]實施例1:元件的選擇
[0065] 1-1:MAR元件的選擇
[0066] 為了改進載體，選擇人珠蛋白的MAR(P-globin MAR、3kb，2.2kb)和人CSP-B基因 側翼SAR(1.2kb)作為候選物。另外，為允許間接評價蛋白表達而進行報告基因測定 (reporter gene assay)，考慮檢查的方便性，選擇螢光素酶測定。
[0067] 計劃通過比較待分析載體與不含MAR元件的對照載體之間的螢光值的差異來評價 待分析載體的效果，相應地制備待分析載體。為了評價在穩定情況下的效果，選擇pGL4.20 [luc2/Puro]螢火蟲(Firefly)螢光素酶載體(Promega Inc.)，其含有噪呤霉素抗性基因， 一種快速且強效的細胞選擇標志物。
[0068] 首先，使用pcDNA3.1( + )載體（Invitrogen，V790-20)作為模板，SEQ ID N0:1 和2的 引物組以及DNA聚合酶(Ex_Taq，Takara)進行PCR以獲得包含CMV啟動子的DNA片段。然后，使 模板在94°C下變性5分鐘以使DNA鏈分離，并通過在94°C變性30秒，在56°C退火30秒和在72 °C延伸1分鐘的過程重復30個循環，隨后在72°C再延伸5分鐘來擴增DNA分子。將通過PCR擴 增的DNA片段通過凝膠提取純化，并插入到pCR2 ? 1-T0P0質粒載體（Invitrogen，K4500-01) 中。通過使用限制性酶的酶切圖譜和堿基序列分析驗證由SEQ ID NO: 11表示的CMV啟動子 的存在，并將CMV啟動子插入到pGL4.20[luc2/Puro]載體的多克隆位點中的Nhel/Xhol位點 中。將所得載體命名為PGL4.2-CMV并用作對照載體。
[0069] 接著，使用3六以3￡〇10勵：3和4)的引物組，]\^1?2.2(3￡〇10勵 :5和6)的引物組和 MAR3.0(SEQ ID N0:7和8)的引物組通過如上所述的相同方法分別將SAR、MAR2.2和MAR3.0 插入到pCR2.1-T0P0質粒載體中。將制備的載體命名為pCR2. l-SAR、pCR2.1-MAR2.2和 pCR2.1-MAR3.0〇
[0070] 將pMSG和5'B1-P1載體（參見韓國專利如.408844)分別用作]\^1?和541?的？0財莫板。 通過使用限制性酶的酶切圖譜和堿基序列分析驗證分別由SEQ ID No : 39、40和41表示的 SAR、MAR2.2和MAR3.0的存在。隨后的克隆過程中，所有的插入物在用限制性酶切割，并通過 凝膠提取純化后使用;載體在用限制性酶切割，并用蝦堿性磷酸酶處理后使用。
[0071] 將用BamHI切害UpCR2.1_SAR載體制備的插入物插入到用相同限制性酶切割制備的 pGL4.2-CMV載體中。通過使用限制性酶的酶切圖譜，驗證所需的SAR DNA片段以正向存在， 并將所得載體命名為PGL4.2-CMV-3 ' SAR。接著，將用Kpnl和Nhel切割pCR2.1-SAR載體制備 的插入物分別插入到用相同限制酶切割的pGL4.2-CMV-3' SAR載體和pGL4.2-CMV載體中。通 過使用限制性酶的酶切圖譜驗證在每個質粒中存在靶DNA片段，將所得質粒分別命名為 pGL4?2-CMV-5 ' 3 ' SAR和pGL4?2-CMV-5 ' SAR。
[0072] 為了制備包含MAR2.2和MAR3.0的載體，將分別用Kpnl和Nhel切割pCR2.1-MAR2.2 和pCR2.1-MAR3.0制備的插入物插入到用相同的限制酶切割制備的pGL4.2-CMV載體中，從 而首先制備pGL4.2-CMV-5 'MAR2.2和pGL4.2-CMV-5 'MAR3.0載體；并且，將用BamHI切割 pCR2.1 -MAR2.2和pCR2 . 1-MAR3.0制備的插入物分別插入到用相同限制酶切割制備的 pGL4 ? 2-CMv-5 ' MAR2 ? 2和pGL4 ? 2-CMV-5 ' MAR3 ? 0載體中以制備pGL4 ? 2-CMV-5 ' 3 'MAR2 ? 2和 pGL4.2-CMV-5 ' 3 'MAR3.0載體。MAR元件以相反方向插入。所制備的螢光素酶載體的示意圖 示于圖1中。
[0073] 使用貼壁細胞系CH0-K1測量具有MAR候選元件的載體的螢光素酶表達水平。通過 為如上制備的載體額外提供同樣用于轉染的4倍摩爾的SAR或MAR元件來制備用于評價順式 +反式效應的載體組。
[0074] 使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，11668027)將CH0-K1 細胞系（ATCC，CCL-61)轉染l.Oyg的上述螢火蟲螢光素酶載體，48小時后，在含有嘌呤霉素(50yg/mL)的DMEM培 養基(Lonza，112-604F)中傳代培養。通過約2至4周的選擇期建立穩定細胞。以總計3組進行 測試，并通過〇ne-glo螢光素酶分析系統(？1'〇1116〖3，￡6110)進行螢火蟲螢光素酶分析，其中 相對細胞數目值進行校正。
[0075]螢火蟲螢光素酶分析方法如下。首先，將其中培養細胞的孔除去培養基，各自通過 lmL的1 X PBS洗滌。向經轉染的細胞添加100yL/孔胰蛋白酶-EDTA，并使其在37 °C下反應1分 鐘以便從底部分離細胞。每個孔中添加 lmL的培養基。在對細胞計數后，經轉化的細胞在用 培養基稀釋至1.0 X105個細胞/mL(基于活細胞計數(viable cell))后分別分裝到1.5mL的 管中。對于每個測試的DNA，向96孔白色板中以100yL/孔放置細胞。將預先制備的One-glo螢 光素酶分析試劑以1〇〇此/孔添加至孔中，并使其在室溫下反應3分鐘。使用光度計（EG&G Berthold，微孔板光度計(Microplate luminometer)LB 96V)測量螢火蟲RLU(相對光單位 (Relative light units))。關于測試載體與pGL4.2-CMV相比的的測量結果示于圖2和表1 中。
[0076]結果是，5 'MAR元件顯示出最好的效果，與pGL4.2-CMV對照載體相比，其表現出效 果(平均值)提高1.6至5.3倍。此外，沒有發現單、雙MAR之間或順式(Cis)和順式+反式(Cis+ Trans)MAR之間有效果差異。因此，候選元件的測試結果值表明它們之間沒有顯著差異，但 顯示出大的變異(￥3^3^〇11)，因此，主要選擇兩個元件5'嫩1?2.2和5'嫩1?3.0。
[0077]表 1
[0078]
[0079] MAR元件的效果并不如預期的好，因此針對CMV和SV40啟動子評價了MAR的效果。具 體地，使用PGL4.20載體作為模板并且使用SEQ ID Nos: 9和10的引物組進行PCR以獲得含有 SV40啟動子的DNA片段。通過PCR擴增的DNA片段通過凝膠提取進行純化并插入到pCR2.1-T0P0質粒載體中。通過使用限制性酶的酶切圖譜和DNA序列分析驗證由SEQ ID N0:12表示 的 SV40 啟動子的存在。然后用 Nhel 和 Xhol 處理 口614.2-01^4614.2-01^-5']\^1?2.2和 pGL4.2-CMV-5 ' MAR3.0載體以除去CMV啟動子，并將用相同的限制性酶處理的SV40啟動子插 入其中以制備PGL4 ? 2-SV40、pGL4 ? 2-SV40-5 ' MAR2 ? 2 和pGL4 ? 2-SV40-5 ' MAR3 ? 0 載體。
[0080]用與在MAR候選元件測試相同的方法測量在貼壁細胞系CH0-K1中螢光素酶的表達 水平。通過約2周的選擇期建立穩定細胞。以總計2組進行測試，并以如上所述的相同的方式 測量螢火蟲螢光值。
[0081 ] 如圖3中所示，與CMV啟動子相比，SV40顯示出效果提高約4倍。其中4614.2-3￥40- 5'MAR3.0載體顯示出最好的結果，與CMV對照組和SV40對照組相比，其表現出分別為9倍和 2.2倍的基因表達提高效果。
[0082] 1-2:LCR元件的選擇
[0083] 在國際專利公開號W02009/102085中公開的LCR元件中，選擇顯示出體內提高因子 1父表達效果的厶厶1'108(<1-1抗胰蛋白酶前體，12(^口，3￡〇10勵：13)和厶1匕￡6(血清白蛋白 前原蛋白，8訃？，3￡0 10^):14)來評價體外（111￥1杜〇)效果。將441'108或41匕￡6添加到 SV40晚期poly(A)信號的5'區、3'區以及pGL4.2-CMV對照載體的5'區和3'區二者以獲得用 于測試的多種載體(參見圖4)。
[0084] 此外，由于LCR元件長度很短，制備了每個位點多重插入有4份元件拷貝的載體以 評價多重插入元件對表達的影響。
[0085] 使用在國際專利公開號w0 2009-102085中公開的載體（pCR-AAT108LCR，PCR-已61^1〇，通過進行一次性?0?獲得各元件的單體(1]1〇11〇11161') ;通過進行4次重組?0?制備八]^ E6X4多聚體。
[0086] 首先，為了獲得各元件的單體，針對Alb E6X1和AAT108X1分別使用SEQ ID No: 17和18的引物組和SEQ ID No: 19和20的引物組。然后，使模板在94°C下變性2分鐘以使DNA 鏈分離，并將在94 °C變性15秒，55 °C退火15秒和在72 °C延伸1分鐘的過程重復30個循環，隨 后在72°C再延伸5分鐘來擴增DNA分子。將通過PCR擴增的DNA片段通過凝膠提取進行純化， 并插入到pCR2.1-T0P0質粒載體中。通過使用限制性酶的酶切圖譜和DNA序列分析驗證分別 由SEQ ID吣：13和14表示的厶厶1108和八讓￡6基因的存在。
[0087] 另一方面，通過進行4次重組PCR制備Alb E6X4多聚體，如圖5所示。通過如上所述 的相同方法進行PCR，不同之處在于退火時間延長至30秒。通過DNA序列分析驗證由SEQ ID 如：16表示的41&￡6\4基因的存在。在66118(^1口以11(3合成441'108\4多聚體（5￡〇10勵 ： 15)〇
[0088] 為了將LCR元件插入至ljpGL4.2-CMV載體啟動子的5'區域，用Kpnl和Nhel切割載體 和PCR產物，隨后進行連接(ligation)。用相同的限制性酶處理克隆的產物，驗證在DNA凝膠 上是否存在具有所需尺寸的條帶。通過上述方法得到5'AAT 108X1、5'AAT 108X4、5'Alb E6X1 以及5'Alb E6X4載體。
[0089] 為了將LCR元件插入到pGL4.2_CMV載體中SV40晚期poly(A)(SV401ate poly(A)) 信號的3'區，用BamHI限制性酶切割pGL4.2-CMV載體和Alb E6元件并用Bglll限制性酶切割 AAT 108元件。使用相容末端(compatible end)將產物插入到pGL4.2-CMV載體中。通過上述 方法得到3'AAT 108X1、3，AAT 108X4、3，Alb E6X1 和3，Alb E6X4載體。
[0090] 為了將LCR插入到PGL4.2-CMV載體中啟動子的5'區域和SV40晚期poly(A)信號的 3'區，用限制性酶Kpnl和Nhel切割在SV40晚期poly(A)信號的3'區含有LCR元件的載體和上 述制備的PCR產物，隨后進行連接。通過上述方法得到5，3，AAT 108 X 1、5，3，AAT 108 X 4、5， 3，Alb E6X1 以及5'3'Alb E6X4載體。
[0091] 為了評價LCR元件的效果，將CH0-K1貼壁細胞系進行轉染。轉染前24小時，將在 DMEM (L0NZA，12-604F) (w/v 10 % FBS)培養基中傳代培養的500yL的各CH0-K1細胞培養物以 0.5 X 105個細胞/孔分配到24孔平板中。在1.5mL管中將800ng的測試DNA(分別為口614.2-CMV、5，AAT 108X1、5，AAT 108X4、5，Alb E6Xl、5，Alb E6X4、5,3，AAT 108X1、5,3，AAT 108X4、5'3'Alb E6X1以及5'3'Alb E6X4)與0pti-MEM(Gibco,31985-088)混合以達到50 yL的總體積(基于1個孔）。在另一些1.5mL管中，將2yL的脂質體（Invitrogen，11668027)與 Opti-MEM混合以達到50此的總體積，并使其在室溫下反應5分鐘。將上述制備的兩種溶液混 合，并使其在室溫下反應20分鐘。將所得物以100此/孔分配到孔中。24小時后，將各孔中的 培養基更新并向孔中添加50yg/mL嘌呤霉素(Gibco，A11138-03)用于細胞選擇。
[0092] 針對7組，通過約2至4周的選擇期建立穩定細胞。使用建立的穩定細胞，通過One- glo螢光素酶分析系統(？1'〇111683，￡6110)用與獻1?候選元件分析相同的方法進行螢光素酶分 析。在7組的結果中，選擇顯示出最相似結果的3個組的結果，并對各元件的效果進行了比 較。測量每個元件的螢火蟲螢光值并相對細胞數目進行校正，與PGL4.2-CMV載體相比，其表 現出0.54至3.94倍的提高(參照圖6)。
[0093]如圖6中所述，顯示出最好的結果的元件是通常使用的5'MAR 3.Okb元件，其顯示 出0.24至9.02(3.94+4.55)倍提高效果。接著，5'3'AAT 108X4元件顯示出1.79至4.67 (3.38+1.46)倍提高效果提。
[0094] 為了評價pGL4.2-CMV-3'AIb E6、pGL4.2-CMV-3'AIb E6X4、pGL4.2-CMV-3'AAT 108\1和口614.2-01^-31六1'108\4載體在穩定表達中的效果，進行如上所述的相同測試。 進行2周的嘌呤霉素選擇，并進行1組測試。結果示于圖7中。
[0095] 如圖7所示，與pGL4 ? 2-CMV載體相比，pGL4 ? 2-CMV-3 ' AAT 108 X 4載體顯示為約2倍 的提高。認為這個結果或許可解釋(盡管是間接地)pGL4.2-CMV-5'AAT 108X4載體顯示出 不超過1.15倍的平均提高，但pGL4.2-CMV-5 ' 3 ' AAT 108 X 4載體顯示出3.38倍的平均提高 (見圖6)。
[0096] 從穩定條件下螢光素酶分析測試的結果鑒定出兩種類型的有效LCR元件，但與常 規使用的5'MAR 3.Okb相比，其未顯示出顯著改進。此外，考慮到螢光測量試驗中大的變異， 選擇在本測試中驗證了其效果的載體，g卩PGL4.2-CMV-3 ' AAT 108 X 4載體和pGL4.2-CMV-5 ' 3 ' AAT 108 X 4載體并計劃直接評價其重組蛋白質的表達水平。 _7] 1-3:內含子元件的選擇
[0098] 為了通過人補體因子H的缺失形式（Deletion form of the human complement factor H，dCFH)的表達來評價嵌合內含子的效果，首先制備dCFH基因。
[0099] 通過 2 步 PCR，將 SCR#1 ~4(調控區（Regulatory region))與 SCR#18 ~20(結合區 (Binding region))連接來制備具有總共7個短共有重復（short consensus repeat，SCR) 的dCFH，所述SCR選自CFH中的20個SCR，不包括13個中間SCR。在如下將要進行的測試中， Phusion高保真DNA聚合酶(Therme/F-530S)用作聚合酶;將模板在98°C下變性30秒以使DNA 鏈分離，并將在98 °C變性10秒，在55 °C退火30秒，在72 °C延伸30秒的過程重復30個循環，隨 后在72 °C下再延伸5分鐘來擴增DNA分子。
[0100] SCR 1F引物（SEQ ID N0:21)含有限制性酶Notl位點，SCR 20B引物（SEQ ID N0: 24)含有xhol位點，所以他們可用于將來的克隆。
[0101] 在PCR的第一步中，使用pMSGnee-hCra作為模板并且使用含有SCR#5的后(3'）區和 SCR#18的前（5'）區的SCR 1F引物（SEQ ID N0:21)和SCR 5(18)B引物（SEQ ID N0:22)獲得 SCR#1~5。另外，使用pMSGneo-hCra作為模板并且使用含有SCR#5的后(3'）區和SCR#18的前 (5'）區的SCR 18(5)F引物（SEQ ID N0:23)和SCR 20B引物（SEQ ID N0:24)獲得SCR片段#18 ~20。將所制備的2種片段用Wizatx!#SV凝膠和PCR凈化系統(Promega)進行純化和回收。 [0102] 上述pMSGneo hCFH的制備方法如下。
[0103] 首先，使用 pCMV-SP0RT6-hCFH 載體（Imagene，#IRATp970B10140D)作為模板并且使 用引物對(SEQ ID No: 47和48)進行PCR。如下所述進行PCR反應:通過以下步驟制備總計50y L的PCR反應混合物：混合5ng的pCMV-SP0RT6-hCFH、lyL的每種引物（10nmol/mL)、lyL的PCR 預混合物（AtTuPowei^ProFi Taq PCR預混合物，Bioneer)和46yL的蒸餾水；然后將混 合物進行94°C下30秒，65 °C下60秒，65 °C下3分鐘20秒的反應過程，進行30個循環。將PCR產 物在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳后，通過凝膠洗脫(gel elution)獲得編碼hCFH的基因片 段。
[0104] 然后，分別用Notl和Xhol處理編碼hCFH的基因片段和pMSGneo載體（Mogam 1118七^此6，1(〇代&)(一種骨架載體）；然后，使用14連接酶（118 &86)將其連接以獲得1^?加勺 表達載體；由此制備的表達載體命名為"pMSGneo-hCFH"。
[0105]使用在PCR的第一步中獲得的2種片段作為模板并且使用SCR1F引物（SEQ ID N0: 21)和SCR 20B引物（SEQ ID N0:24)進行PCR的第二步驟。使用Phusion高保真DNA聚合酶 (Thermo/F-530S)，將模板在98°C下變性30秒以使DNA鏈分離，并通過在98°C變性10秒，在55 。(:退火30秒以及在72°C延伸45秒的過程重復30個循環，隨后在72°C再延伸5分鐘來擴增DNA 分子以獲得dCFH基因 （SEQ ID N0:46)(圖8)。
[0106] 接著，制備表達載體pcDNA-dCFH。
[0107] 用Notl和Xhol限制性酶將pMSGneo-dCFH載體和pcDNA3.1( + )載體在37°C下酶切約 3小時。將經切割的載體在瓊脂糖凝膠上進行電泳并從所述膠上切下在經切割的pMSGneo-dCFH基因中的dCFH基因和在經切割的pcDNA3.1 (+)基因中具有載體尺寸的基因。將切下的 基因用WteaixfSv凝膠和PCR凈化系統進行純化和回收。使用DNA連接試劑盒2.1版使經 切割的基因在16 °C下反應約6小時以制備pcDNA-dCFH表達載體。
[0108] 然后，制備pcDS-dCFH表達載體。用NheI(NEB/R0131S)和Notl限制性酶切割 pcDNA3.1( + )載體和 Y11LC pclw 載體（參見：Nucleic Acids Res.，2008年 9 月；36(15): e96)。將經切割的基因在瓊脂糖凝膠上進行電泳并從所述膠中切下在經切割的Y11LC pcIW 載體基因中的嵌合內含子基因 （SEQ ID N0:25)和經切割的pcDNA3.1( + )載體基因。將切下 的基因用Wizard K'Sv凝膠和PCR凈化系統進行純化和回收。使用DNA連接試劑盒2.1版將經 切割基因在16°C下反應約6小時以制備pcDS-MCS載體。另外，使用如上制備的pcDS-MCS載體 和pcDNA-dCFH載體通過如上所述的方法制備pcDS-dDFH載體，其中dCFH基因被插入到pcDS-MCS載體的Nhel/Notl切割位點。
[0109] 為了確保獲得1?1?基因（5￡0 10勵:26)，使用￥11^^(3頂載體作為模板進行?〇?。 在如下將要進行的測試中，將Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo/F-530S)作為聚合酶;將模 板在98 °C下變性30秒以使DNA鏈分離，并通過將在98 °C變性10秒，55 °C退火30秒以及在72 °C 延伸30秒的過程重復30個循環，隨后在72°C再延伸5分鐘來擴增DNA分子。本文所使用的 wPRE F引物（SEQ ID N0:27)含有限制性酶Xhol位點，wPRE B引物（SEQ ID N0:28)含有Xbal 位點，所以它們可用于將來的克隆。將所得到的pcr產物用凝膠和PCR凈化系統 進行純化和回收。
[0110] 用Xhol和XbaI(NEB/R0145S)限制性酶將通過上述PCR獲得的wPRE基因和pcDS-dCFH載體在37 °C下酶切約1小時。將經切割的基因用'Wiza rxTSv凝膠和PCR凈化系統進行 純化和回收。使用DNA連接試劑盒2.1版使經切割基因在16°C下反應約3小時以制備pcDSW-dCFH載體，其中WPRE基因被插入到p cDS-dCFH載體的Xho I /Xba I切割位點。
[0111] 為了驗證嵌合內含子提高瞬時表達水平的效果，制備了 CH0-S細胞(Invitrogen，# R800-07)。將細胞解凍;使用錐形瓶規模(Erlenmeyer scale)將細胞以3X105個/mL接種到 30mL的Freestyle CH0表達培養基（Invitrogen，#12651-014)中；并保持2至3代以使他們在 2至3天內能長到1 .2 X 106至2.0 X 106個細胞/mL。然后，使用Freestyle? Max試劑 (Invitrogen，#16447-100)用以上制備的pcDNA-dCFH 載體、pcDS-dCFH 載體和pcDSw-dCFH 載 體轉染細胞。轉染后，從第3天到第7天每天一次收集lmL的培養液。使用所收集的培養液測 量細胞的數目和生存力；使用人補體因子H ELISA試劑盒(Hycult bi〇tech，#HK342)驗證 dCFH表達水平（圖9)。
[0112] 轉染有pcDNA-dCFH載體的CH0-S細胞顯示出約13.025yg/mL的最高表達水平，而轉 染有pcDS-dCFH載體和pcDSw-dCFH載體的CH0-S細胞分別顯示出約30 ? 757yg/mL和48 ? 208y g/mL的最高表達水平。每種載體比pcDNA-dCra顯示出高約2.4至3.7倍的表達水平。
[0113]其次，為了驗證嵌合內含子的效果，將制備的dCFH表達載體轉染到Freestyle? 293-F細胞（Invitrogen/R790-07)中。在Freestyle 293表達培養基（Gibco/12338-018)中 培養Freestyle? 293-F細胞。轉染前24小時，將細胞以7X 105個細胞/mL進行傳代。
[0114] 在轉染的當天，在125mL的錐形瓶(erlenmeyer flasks)中用培養基將細胞稀釋至 總體積30mL，7X106個細胞/mL。在1.5mL管中，將30yg用于轉染的質粒(pcDNA-dCFH、pcDS-dCra和pcDSW-dCFH)和OptiPRO? SFM(Gibco/12309-019)混合至總體積600yL。在新的 1.5mL 管中，將90yL的PEI MAX(Polyscience/24765-2)(1μg/μL)和510yL的OptiPRO? SFM混合。將 含有質粒的溶液和含有PEI MAX的溶液混合并在室溫下反應10分鐘。當含有293-F細胞的錐 形瓶緩慢轉向時，將混合的溶液添加至其中。將細胞在5%C0 2懸浮培養箱中于37°C下以 130rpm培養7天。從第3天將培養基收集在1.5mL管中，持續7天，并在5000rpm下離心3分鐘以 使細胞沉淀。然后，取出上清液并使用人補體因子H ELISA試劑盒(Hycult biotech/HK342) 測量dCFH表達水平（圖10)。
[0115] 如圖10中所示，轉染有pcDNA-dCFH、pcDS-dCFH和pcDSw-dCFH的細胞分別顯示出約 138.9yg/mL、638.8yg/mL和896.7yg/mL的最大表達水平。與pcDNA-dCFH表達載體相比，轉染 有含嵌合內含子的載體的細胞顯示出約4.6倍的提高，轉染有含嵌合內含子和wPRE二者的 載體的細胞顯示出約6.5倍的提高。
[0116] 最后，為了驗證嵌合內含子對穩定表達的影響，制備了CH0-DG44細胞（DR L. Chas in，Co lumb ia Uni vers i ty)。將細胞解凍;將其以 3 X 106細胞/T75瓶接種到MEMaw/HT (0訃(：〇，12571-063) + 10%0卩85(81(^6(*11化8代86&代11，7103)培養基中；并保持2至3代以 使他們在2至3天內能長到9〇 %的匯合(c〇nf luency)。然后，使用lip〇fecta:mine'Si):2〇oo轉 化試劑（Invitrogen，#11668-027)將制備的 pcDNA-dCFH 載體、pcDS-dCFH 載體和 pcDSW-dCFH 載體轉染到細胞中，5 X 106個細胞/瓶。轉染后48小時，用補充有500yg/mL的G418的培養基 替換該培養基以用于細胞選擇。同時監測細胞生長約一周，在80%至90%匯合時進行第一 次傳代。在第一次傳代后，如果細胞在2至3天內顯示出80%至90%的匯合，則再傳代兩次， 并且以相同的方式將細胞以5 X106個細胞/瓶接種到T75瓶中，然后從第3天至第7天每天一 次收集lmL的培養液。在7天的最后一天，在用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invirtogen，#25200- 056)處理細胞后對細胞數目和生存力進行計數;使用人補體因子H ELISA試劑盒(Hycult biotech，#HK342)測量dCFH表達水平（圖 11)。
[0117] 如圖11所示，轉染有pcDNA-dCFH載體的CH0-DG44細胞顯示出約0.054yg/mL的最高 表達水平，而轉染有pcDS-dCFH和pcDSw-dCFH載體的CH0-DG44細胞分別顯示出約0.934yg/ mL和0.924yg/mL的最高表達水平。每種載體比pcDNA-dCFH顯示出高約17.3至17.1倍的表達 水平。
[0118] 1_4:額外元件的選擇
[0119]通過比較使用四個元件（其為在初始選擇MAR和LCR元件時所選擇的）的FIX(因子 IX)蛋白質表達水平進行額外選擇。計劃通過從上述制備的螢光素酶載體中除去螢光素酶 基因并將FIX基因插入到其中來制備載體。對于在新載體制備物中的使用，制備引物組(SEQ ID勵:29和30)以使引物在？1乂基因的前面包括乂11〇1、？ &(31和4口&1限制性酶位點并且在卩1父 基因的后面包括Apal和Fsel位點。
[0120] 然后，使用pMSG-FIX載體作為模板以及引物組(SEQ ID N0:29和30)進行PCR。
[0121 ] pMSG-FIX載體的制備方法如下。首先，使用寡聚-dT柱（Invitrogen，USA)WAR (liver)細胞中提取mRNA以分離FIX基因。在制備引物組(SEQ ID No:49和50)后，使用Titan one tube RT-PCR系統(Roche)進行RT-PCR以合成具有約1，383bp(461個氨基酸）大小的FIX cDNA，然后將其克隆到pGEM-T載體(Promega)中，所述引物組基于在基因庫中登記的FIX基 因序列(Ref. ;Genbank登錄號1至2775堿基對)與FIX基因特異性的5'端和3'側翼區結合。
[0122] 使用包括Nhel和Bglll的引物組（SEQ ID N0:51和52)通過PCR擴增分離的FIX基 因，并將其克隆到pMSG載體(Mogam Biotechnology institute，Korea)中，pMSG載體是動物 細胞表達載體。使用Nhel和Bgl II限制性酶(New England Bio Labs，USA)對從PCR得到的 FIX基因進行切割，然后進行1.2 %瓊脂糖凝膠電泳以分離1.4kb大小的基因。將分離的FIX 基因與預先用Nhel和Bglll限制性酶處理的pMSG載體連接以制備FIX表達載體。使用氯化鈣 沉淀法用其中已完成連接反應的DNA混合物轉化大腸桿菌DH5a。將經轉化的大腸桿菌涂布 在含有50yg/mL氨芐青霉素的LB平板上并在37°C下培養過夜。將在培養平板上形成的克隆 進行培養后，使用QIA過濾型小型質粒試劑盒（f i Iter mini-Plasmid Kit;Qiagen， Germany)分離質粒。通過用Nhel/Bglll限制性酶處理來確認分離的質粒DNA含有FIX DNA片 段。由此制備的表達載體命名為"pMSG-FIX"。
[0123] 將通過PCR擴增的DNA片段通過凝膠提取進行純化并插入到pCR2.1-T0P0質粒載體 中。通過使用限制性酶的酶切圖譜和DNA序列分析驗證由SEQ ID N0:31表示的FIX基因的存 在。使用相同的限制性酶將FIX基因插入到其中用Xhol和Fsel限制性酶除去螢光素酶基因 的載體中。由此制備的FIX表達載體組1的示意圖示于圖12。
[0124] 用與螢光素酶表達測試相同的方法測量在貼壁細胞系CH0-K1中的FIX表達。在與 上述相同的方式中，通過約2周的選擇期建立穩定細胞。在總計4組中進行測試，通過ELISA 法測量FIX的表達水平并相對細胞數目進行校正。
[0125] FIX ELISA方法如下。將孔中的培養基收集至lj 1.5mL管中。各孔用lmL的1 X PBS洗 滌。將100此/孔的胰蛋白酶-EDTA添加至孔中，然后將其在37°C下在細胞培養箱中反應1分 鐘以從底部分離經轉染的細胞。每個孔中添加 lmL培養基以收集細胞，并對細胞的數目進行 計數。在連續培養的情況下，使用12孔板將細胞以0.5 X 105至1.0 X 105細胞/mL傳代培養并 使用嘌呤霉素(50yg/mL)進行細胞選擇。
[0126] 使用包被緩沖液(50mM碳酸鹽緩沖液;在添加1.59g的Na2C03和2.93g的NaHC0 3至1L 的三級蒸餾水后將pH調至9.6)將由用于人因子IX抗原（human Factor IX antigen) (Affinity Biological，FIX_EIA)ELISA的配對抗體組(Matched-Pair Antibody set)提供 的捕獲抗體(Capture antibody)稀釋至1/100。將經稀釋的捕捉抗體以lOOyL/孔分配到96 孔ELISA板中，并使其在室溫下反應2小時。將孔用PBS-吐溫緩沖液洗滌3次。然后使用稀釋 緩沖液通過1/2逐級稀釋從50ng/mL至0.781ng/mL制備因子FIX(Benefix，250iig/mLMtS# 準物（Standard)。使用稀釋緩沖液（1%BSA 1 XPBS)將首先收集的培養基稀釋至1/10、1/ 100和1/1000,然后以100yL/孔添加至孔中，并使其在室溫下反應1小時30分鐘。將孔用ros-吐溫緩沖液洗滌3次。每孔添加100iiL的TMB微孔過氧化物酶底物(mi crowe 11 peroxidase substrate)，并使其在室溫下反應10分鐘。然后每孔添加100yL的2.5M H2S〇4以終止反應，并 用微板讀數器在450nm讀取吸光度。
[0127] 如圖13和下表2所示，總體趨勢類似于先前螢光素酶的結果。與CMV啟動子相比， SV40啟動子顯示出高約3.4倍的提高效果。最有效的是pGL4.2-SV40-5 'MAR3.0載體，與CMV 對照組和SV40對照組相比，其分別顯示出7倍和2.1倍表達水平提高的效果。
[0128] 表2
[0130] 為了檢查在SV40啟動子的控制下LCR元件的效果，使載體進行克隆過程以替換啟 動子。使用Nhel和Xhol限制性酶從上述制備的具有CMV啟動子的載體中除去CMV啟動子，并 使用相同的限制性酶插入SV40啟動子。另外，制備具有5'MAR和3'AAT 108X4組合的載體和 5'3'MAR3.0載體并在測試中使用。制備的FIX表達載體組2的示意圖示于圖14中。
[0131] 通過與FIX表達載體組1相同的方法測量在貼壁細胞系CH0-K1中FIX的表達。通過 約2周的選擇期建立穩定細胞。在總計3個組中進行測試，通過ELISA法測量FIX的表達水平 并相對細胞數目進行校正。
[0132] 如圖15和下表3中所示，沒有示例顯示出與SV40對照組相比表達水平提高;在具有 替換的SV40啟動子的LCR候補組中，與pSV40-5'MAR3.0相比，沒有載體顯示出較高的表達水 平。因此，通過比較FIX表達水平選擇SV40啟動子和5 ' MAR3.0元件。
[0133] 表3
[0135] 實施例2:新載體的制備
[0136] 使用實施例1中選擇的元件制備新載體。
[0137] 將在FIX表達比較測試中使用的口3￥40-5'1^1?3.04以載體用4口&1限制性酶處理以 除去FIX基因，并使其自連接以獲得pSV40-5 'MAR3.0-MCS載體。MCS包括4種類型的限制性酶 位點：XhoI、PacI、ApaI和Fsel 〇
[0138] 將在pSV40-5 ' MAR3.0-MCS載體中的嘌呤選擇區用DHFR表達區替換以額外制備具 有DHFR基因的載體。在檢查用于替換的限制性酶位點后，發現存在兩個SapI位點(在前面和 后面）；并通過用Sail和Afllll處理除去在后面的SapI位點并使用klenow酶制備平末端 (blunt end)，然后自連接。嘌呤霉素表達系統(pMS-P-MCS)的限制性酶圖譜的示意圖示于 圖16中。
[0139] 至于所需的DHFR表達系統，使用已在本研究機構常規使用的pDCHIP載體。在包括 倉鼠 DHFR基因的約2.5kb中，基于參考文獻(Proc Natl Acad Sci.，1991，第88卷.第8572 頁；和Mol.Cell.Biol .，1984，第4卷，第38頁）確認5'側翼和3'側翼、啟動子和polyA部分并 設計用于將尺寸減小至約1.5kb的PCR引物(SEQ ID No:32和33)。
[0140]使用pDCHIP載體作為模板進行PCR獲得DNA片段，然后將其插入到pCR2.1-T0P0載 體中并測序（SEQ ID N0:34)。將已經驗證了基因序列的DHFR表達區插入到pSV40-5'MAR 3.0-MCS載體中。載體和插入物各自用SapI和Sal I限制性酶切割并再次連接。用相同的限制 性酶處理克隆的產物，并驗證DNA凝膠上是否存在所需尺寸的條帶。通過上述過程，制備新 載體對 I (pMS-P-MCS和pMS-D-MCS)(圖 17)。
[0141] 為了比較制備的新載體對與常規載體的基因表達能力，將ER2抗體(EGFR抗體;參 見韓國專利No ? 1108642)基因克隆到每對新載體和pMSGneo載體(Mogam Biotechnology Institute，Korea)(其是常規的MAR載體）中。為了克隆到兩種載體中，將ER2抗體的輕鏈和 重鏈二者在5'區添加 Xhol和Nhel位點并且在3'區添加 PacI和Xhol位點，然后進行PCR。對于 PCR，pOptiVEC-ER2HC和pcDNA3 ? 3-ER2LC載體分別用作模板，且HC(SEQ ID N0:35和36)組和 LC(SEQ ID N0s:37和38)組分別用作重鏈和輕鏈的引物。將PCR產物插入到pCR2.1-T0P0載 體中并確認DNA序列（SEQ ID N0:42和43)。
[0142] 使用Nhel和Xhol限制性酶將其序列已被驗證的ER2抗體的輕鏈和重鏈基因克隆到 pMSGneo載體中，并且還使用Xhol和PacI限制性酶將其分別克隆到新載體對(pMS-P-MCS和 pMS-D-MCS)中。
[0143] 用相同的限制性酶處理克隆的產物，并驗證DNA凝膠上是否存在具有所需尺寸的 條帶。因此，制備了 4種載體，其包括用于ER2抗體表達的新載體對I (pMS-P-ER2LC和pMS-D-ER2HC)和MAR載體對(pMSGne〇-ER2LC和pMSGne〇-ER2HC)(圖 18A和 18B)。
[0144] 另一方面，額外制備載體以驗證向以上制備的新載體對I添加嵌合內含子的效果。 使用pcDS-dCFH載體作為模板并且使用引物組SEQ ID如：44和45進行？〇?以獲得0嫩片段， 并將?0?產物插入到口0?2.1-1^0載體中，并驗證嵌合內含子的0嫩序列（5￡〇10勵 :25)。用 XhoI切割用于ER2抗體表達的新的載體對I (pMS-P-ER2LC載體和pMS-D-ER2HC載體），并將用 相同的限制性酶處理的嵌合內含子分別插入其中。通過上述過程，制備了用于ER2抗體表達 的新載體對II(pMSI-P-ER2LC和pMSI-D-ER2HC ER2)(圖 19)。
[0M5]額外制備ER2抗體表達載體以驗證新載體對II的元件性質。
[0146] 至于僅具有SV40啟動子的載體，用如上所述相同的方法通過從pGL4.2-SV40-FIX 載體中除去FIX基因制備pS-P-MCS載體，并通過進一步用DHFR基因替換嘌呤霉素基因來制 備pS-D-MCS載體。然后，使用Xho I和Pac I將ER2的輕鏈和重鏈基因插入其中以制備用于ER2 抗體表達的具有SV40啟動子的載體對(pS-P-ER2LC和pS-D-ER2HC)(圖20A)。使用Xhol限制 性酶將嵌合內含子插入到制備的載體中以制備包含嵌合內含子的載體對(PSI-P-ER2LC和 PSI-D-ER2HC)(圖 20B)。
[0147] 實施例3:載體的基因表達能力的評價
[0148] 如下驗證了上述制備的新載體的基因表達能力。
[0149] 3-1:貼壁細胞系中用于ER2抗體表達的新載體對I和新載體對II的評價
[0150] 首先，在CH0-K1和CH0-DG44貼壁細胞系中進行使用新載體對I和新載體對II的ER2 抗體表達。將表達水平與表4中所示的商業化的雙載體對和MAR載體對進行比較。
[0151] 表4
[0153] 轉染前24小時，將在DMEM(w/10%FBS)培養基中培養的CH0-K1細胞以0.8X10 5個 細胞/孔，每孔500此的量分配到12孔板的孔中。將在MEM-aw/HT(Gibco，12571-063)培養基 中培養的CH0-DG44細胞以1.5 X 105個細胞/孔，每孔500yL的量分配到孔中。分配后24小時， 將Opti-MEM和測試載體在1.5mL管中混合以達到50yL的總體積（基于1個孔）。將47此的 Opt i-MEM和3yL的脂質體2000在一個新的1.5mL管中混合，并使其在室溫下反應5分鐘(基于 1個孔）。反應完成后，將以上制備的兩種溶液混合并使其在室溫下反應20分鐘。24小時后， 從各孔除去轉染的培養基并用PBS洗滌。將胰蛋白酶-EDTA(IX)以lOOyL/孔分配到其中并 使其在37°C下反應1分鐘以分離細胞。將培養基以lOOOyL/孔分配到其中并對細胞數目進行 計數。
[0154] 將CH0-K1細胞以1.0 X 105個細胞/孔分配到12孔板的孔中以達到lmL的總體積;對 于每種載體，向其中適當地添加 l〇〇〇yg/mL的G418(PAA，P11-012)或50yg/mL的嘌呤霉素;并 進行細胞選擇。將DG44細胞以1.5 X105個細胞/孔分配到12孔板的孔中以達到lmL的總體 積;對于每種載體，向其中適當地添加 750yg/mL的G418或20yg/mL的噪呤霉素;并進行細胞 選擇。在總計2個組中進行轉染，在整個3周內以總計每組3次獲得樣品，并進行了ELISA試 驗。
[0155] ER2ELSIA方法如下。將山羊抗-人IgG(Fab-特異性（Fab-specif ic)) (Sigma， 15260)用包被緩沖液稀釋至5yg/mL。將稀釋的捕捉抗體以100yL/孔分配到96孔ELISA板中， 并使其在室溫下反應2小時或更長時間。將其用300yL的roS-0.1%Tween 20緩沖液洗滌3 次。以300yL/孔向其中添加 roS-l%BSA，并在室溫下封閉2小時。將所得物用300yL的PBS-0.1%Tween 20緩沖液洗滌3次。使用PBS-1%BSA以280ng/mL、140ng/mL、70ng/mL、35ng/mL、 17 ? 5ng/mL、8 ? 75ng/mL和 4 ? 375ng/mL的濃度制備 HBIG基因（2 ? 8mg/mL)作為標準。使用 roS-1%BSA稀釋培養液。將標準的和經稀釋的培養溶液以lOOiiL/孔的重復分配到包被有捕獲抗 體的96孔板中，并使其室溫下反應1小時。用300yL的PBS-0.1 % Tween 20緩沖液將各孔洗滌 3次。使用?85-83八將山羊抗-人186$(3特異性)-冊？(31811^40170)稀釋至1/100,000。將經 稀釋的溶液以1〇〇此/孔分配到平板中，并使其在室溫下反應1小時。將所得物用300yL的 PBS-0.1 % Tween 20緩沖液洗滌3次。將TMB微孔過氧化物酶底物以lOOyL/孔進行分配，并使 其在室溫下反應30分鐘。將2.5M H2S04以100此/孔進行分配以停止反應，并使用微板讀數器 在450nm下測量吸光度。用4-參數擬合（parameter fitting)制成標準曲線（standard curve)并用測量的培養液的吸光度替代參數來計算濃度。
[0156] 如表5和圖21A和21B所示，無法驗證在CH0-K1中ER2Ab在商業化的雙載體對中的表 達水平。常規MAR載體對、新載體對I和新載體對II顯示平均表達水平分別為約9.7ng/mL、約 14. Ong/mL和約1473.2ng/mL。新載體對I和新載體對II分別比MAR載體對顯示出高約1.4倍、 約151.3倍的表達水平。此外，新載體對II比新載體對I顯示出高約105.4倍的表達水平，這 顯示嵌合內含子的效果是優異的。
[0157] CHO DG44細胞中商業化的雙載體對、MAR載體對、新載體對I和新載體對II的ER2抗 體的平均表達水平分別為13.11^/1111^、3.81^/1111^、27.51^/1111^和653.〇1^/111匕商業化的雙載體 對比MAR載體對顯示出高約3.5倍的表達水平。新載體對I和新載體對II分別比MAR載體對顯 示出高約7.3倍和173.7倍的表達水平。此外，新載體對II顯示出比新載體對I高約23.8倍的 表達水平。
[0158] 表5
[0160] 3-2:在懸浮的細胞系中新載體對II的評價
[0161] 在CH0-S和⑶DG44-S懸浮細胞系中對新載體對II進行了評價。
[0162] 轉染前24小時，在⑶FortiCHO培養基中以5X105至6X105個細胞/mL將CH0-S細胞 系(Gibco，A13696-01)進行傳代以達到所需量。在轉染的當天，測量細胞的數目和生存力 (viability)(必需為95%或更高）。使用CD FortiCHO培養基(Gibco，A11483-01)將細胞以1 X 106個細胞/mL分配至lj 125mL瓶中。將90yg的質粒DNA與OptiPro?SFM混合以達至lj 1.5mL的總 體積。270yL的MAX(1μg/μL)和1230yL的OptiPro ? SFM混合，絕對不要進行渦旋 (vortexing)。將含有PEI MAX的OptiPro? SFM置于含有質粒DNA的OptiPro? SFM中，然后 將其輕輕混合。然后，使所得物在室溫下反應5分鐘。將3mL所產生的DNA:PEI復合物逐滴添 加至預先制備的125mL瓶中的CH0-S細胞中。將細胞在C〇2振蕩培養箱(shaking incubator) 中于37 °C在130rpm至150rpm攪拌下進行培養，48小時后進行細胞選擇。
[0163] 另一方面，通過以下方法制備⑶DG44-S細胞系。首先，使用125mL旋轉瓶以2至3天 的間隔將CHO DG44貼壁細胞系（在a-MEM(w/) + 10%cFBS培養基中培養的）在50mL培養基中 進行傳代，使用無血清培養基（HyQ SFM4CH0(Thermo Scientific，Hyclone)+lx HT補充物 (Supplement))，從而使細胞適應懸浮培養。使用Ex CELL? CD CH0(Sigma，14361C)/4mM L-谷氨酰胺/IX HT補充培養基的替換培養基將適應好的細胞以2至3天的間隔進行傳代培養， 從而使細胞適應培養基。如果該細胞的生長穩定且生存力保持在90%或更高，并且所述細 胞的濃度達到1 X 106至2 X 106個細胞/mL，將CHO DG44-S宿主細胞系存庫(banking)，從而確 保細胞系。
[0164] 轉染前24小時，將細胞在Ex-CELL? CD CH0(Sigma，14361C)以5X105至7X105個 細胞/mL傳代至所需量。使用Freestyle CH0培養基將細胞以2 X 106個細胞/mL，15mL的量分 配至ljl25mL瓶中。30yg的質粒DNA與150mM NaCl混合以達到0.75mL的總體積。將90yL的PEI MAx(1μg/μL)和150mM NaCr混合，絕對不要進行渦旋。將含有PEI MAx的150mM Na Cl置于含 有質粒DNA的150mM NaCl中并輕輕混合。使所得物在室溫下反應5分鐘。將1.5mL所產生的 DNA:PEI復合物逐滴添加至預先制備的125mL瓶中的⑶DG44-S細胞中。將細胞在C02振蕩培 養箱中在37 °C培養以130rpm培養5小時，并在48小時后進行細胞選擇。
[0165] 在CH0-S的情況下，使用表6所示的選擇培養基進行細胞選擇。
[0166] 表6
[0168] 首先，將轉染的細胞數目進行計數。使用適于各種條件的選擇培養基，將細胞以5 X 105細胞/mL，50mL的量分配到T-175瓶中。如果細胞的數量不夠，則減少總體積。將細胞在 C02培養箱中在37°C下于靜態條件下培養。選擇后7天，將細胞的數目進行計數。如果生存力 超過30%，將測試繼續進行至下一步驟，但是如果沒有超過，則10至11天后對細胞的數目進 行計數。如果甚至是在11天后生存力仍小于30%，則用新的選擇培養基替換該選擇培養基， 并減小T-瓶的尺寸以使得濃度變為3X10 5個細胞/ml或更高。以3至4天的間隔將培養基完 全更換，并檢查恢復信號（如果有的話）。如果存在恢復信號且生存力在30%至50%的范圍 內，使用適合該條件的選擇培養基將細胞在125mL瓶中以3 X 105個細胞/mL進行傳代。將細 胞在C02培養箱中在37°C下以150rpm進行攪拌培養。以3至4天的間隔，使用適合該條件的選 擇培養基在125瓶中將細胞以3 X 10個細胞/mL，30mL的量進行傳代。如果稀釋倍數為2倍或 更高，不完全更新培養基。如果生存力為85 %或更高且活細胞密度為1 X 106個細胞/mL或更 尚時，認為選擇完成。
[0169] 另一方面，在CD DG44-S的情況下，使用表7中所示的選擇培養基進行細胞選擇。
[0170] 表7
[0172] 將經轉染的細胞的數目進行計數。使用適于各種載體的選擇培養基，將細胞以5 X 1〇5個細胞/mL，每瓶30mL的量分配到125mL瓶中。如果細胞的數量不夠，則降低總體積。將細 胞在C0 2培養箱中在37°C下以130rpm進行攪拌培養。以3至4天的間隔，使用選擇培養基在 125mL瓶中將細胞以3 X 105細胞/mL，30mL的量進行傳代。如果稀釋倍數為2倍或更高，則不 完全更新培養基。如果生存力為80%或更高且活細胞密度為1 X 106個細胞/mL或更高時，則 認為選擇完成。在總計2組中進行轉染，在整個3至4周內以每組總計3次獲得樣品，并進行 ELISA試驗。
[0173] 以對于貼壁細胞系所描述的相同方式進行ER2ELISA，其結果示于表8中。
[0174] 如下表8所示，關于在CH0-S細胞系中ER2抗體的3天生產率，商業化的雙載體對、 MAR載體對和新載體對II的表達水平分別為0.2yg/mL至0.3yg/mL、1. Oyg/mL至2. Oyg/mL以 及9.5yg/mL至17. Oyg/mL(平均）。關于批量生產率，商業化的雙載體對、MAR載體對和新載體 對II的最大生產量分別為〇. 7yg/mL、10.3yg/mL和35. Oyg/mL(平均）。因此，關于批量生產 率，與商業化的雙載體對和MAR載體對相比，本發明的新載體對II分別顯示出約50倍和約 3.4倍或更高的抗體表達提高效果。
[0175] 另外，在⑶DG44-S細胞系中，關于ER2抗體的3天生產率，商業化的雙載體對、MAR 載體對和新載體對II的表達水平分別為0.2yg/mL至0.3yg/mL、0.2yg/mL至0.25yg/mL和1.0 yg/mL至1.5yg/mL。關于批量生產率，商業化的雙載體對、MAR載體和新載體對II的最大生產 量分別為〇 ? 7yg/mL，0 ? 5yg/mL和 3 ? 6yg/mL (平均）。
[0176] 關于批量生產率，與商業化的雙載體和MAR載體對相比，新載體對II分別顯示約 5.1倍和約7.2倍或更高的抗體表達提高效果。
[0177] 表8
[0179] 3-3:新載體的組成元件的性質評價
[0180] 在CH0-S和⑶DG44-S細胞系中進行新載體的組成元件的性質評價。如下面的表9 所示，在測試中使用的載體對如下:pS(啟動子載體對）、pSI(內含子載體對）、pMS(新載體對 1)和 ?1^1(新載體對11)。
[0181] 表9
[0183] 如下所述使用與實施例3-2相同的評價方法。轉染每對載體，并且當通過選擇期完 成選擇后，比較ER2抗體表達水平。結果示于下表10。
[0184] 表 1〇
[0186] 如表10所示，在CH0-S細胞系中，關于新載體對I、新載體對II、啟動子載體對和內 含子載體對的細胞選擇是分別在約4周、約4.5周和約7周內完成。具有MAR元件的新載體對I 和新載體對II比內含子載體對顯示出約1.8倍更短的選擇期。選擇結果表明，與啟動子載體 對相比，內含子載體對、新載體對I和新載體對II的3天的生產率分別提高18.4倍、1.8倍和 20.6倍；內含子載體對、該新載體對I和新載體對II的PCD(皮克/細胞/日期（Picogram/ cel ls/date))分別提高13.3倍、1.0倍和 26.1倍。
[0187] 在CD DG44-S細胞系中，關于四個載體的細胞選擇都是在約三周內完成。與在CH0-S中不同，使所有載體在類似的時間段內完成了適應。此外，發現，與啟動子載體對相比，內 含子載體對、新載體對I和新載體對II的3天的生產率分別提高13.8倍、2.4倍、64.8倍；內含 子載體對、新載體對I和新載體對II的PCD分別提高14.7倍、3.8倍、86.4倍。
[0188] 總之，當MAR元件與內含子元件一起使用而不是單獨使用時，觀察到3天的生產率 和P⑶有約1.6至2.0倍的協同效應。
[0189]雖然本發明已經描述了關于上述具體的實施方案，但應認識到，本領域技術人員 可對本發明作出的多種修改和變化也落入由所附的權利要求所限定的本發明的范圍內。
【主權項】
1. 表達載體，其包含可操作地連接的猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)啟動子、支 架附著區（scaffold attachment region，SAR)或基質附著區（matrix attachment region，MAR)元件以及嵌合內含子（chimeric intron) 〇2. 根據權利要求1所述的表達載體，其中所述SV40啟動子由SEQ ID NO: 12表示。3. 根據權利要求1所述的表達載體，其中所述SAR元件由SEQ ID N0:39表示，并且所述 MAR元件由SEQ ID NO:40或41表示。4. 根據權利要求1所述的表達載體，其中所述嵌合內含子由SEQ ID N0:25表示。5. 根據權利要求1所述的表達載體，其還包含由SEQ ID NO: 15或16表示的基因座控制 區（locus control region，LCR)元件。6. 根據權利要求1所述的表達載體，其中表達受所述啟動子調控的靶基因被插入到所 述表達載體中。7. 權利要求6所述的表達載體，其中所述靶基因選自： 因子VII(factor VII，FVII)基因、因子VIII(factor VIII，FVIII)基因、因子IX (factor IX，FIX)基因、表皮生長因子受體家族（epidermal growth factor receptor family)抗體基因、胰島素基因、白細胞介素基因、腫瘤壞死因子基因、干擾素基因、集落刺 激因子基因、趨化因子基因、促紅細胞生成素基因、甲胎蛋白基因、葡糖苷酶基因、α?-抗 胰蛋白酶基因、抗凝血酶基因、脂蛋白基因、血漿銅藍蛋白基因、纖維蛋白原基因、葡糖腦苷 脂酶基因、觸珠蛋白基因、纖維蛋白溶酶原基因、凝血酶原基因以及轉鐵蛋白基因。8. 根據權利要求1所述的表達載體，其具有圖19中公開的pMSI-P-ER2LC或pMSI-D-ER2HC的酶切圖譜。9. 由權利要求1至8中任一項所述的表達載體轉化的細胞。10. 權利要求9所述的細胞，其中所述細胞選自：CH0-K1細胞、CH0-DG44細胞、CH0-S細 胞、CHO DUKX-B11 細胞、C0S7細胞、C0S3細胞、C0S1 細胞、NS0細胞、HeLa細胞、Vero細胞、PER-C6細胞、HepG2細胞以及BHK細胞。11. 用于生產靶蛋白的方法，其包括： 培養由權利要求6或7所述的表達載體轉化的細胞以表達所述靶蛋白；和 回收所述靶蛋白。
【文檔編號】C12N15/85GK105849268SQ201480071337
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年12月29日
【發明人】金正燮, 尹成泰, 郭曦天, 吳美淑, 李秀珉
【申請人】財團法人牧巖生命工學研究所