培養多能干細胞的制作方法

培養多能干細胞的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于培養和維持處于未分化狀態的多能干細胞的方法。所述方法包括將所述多能干細胞培養在包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、AMPK和/或BMP信號轉導的雙重抑制劑以及LIF的培養基中。還提供了一種通過所述方法產生的細胞、用于執行所述的方法的細胞培養基和試劑盒。
【專利說明】
培養多能干細胞
技術領域
[0001] 本發明涉及干細胞。具體來說，本發明涉及一種用于培養和維持處于未分化狀態 的多能干細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 胚胎干細胞(ESC)源自于胚泡的內細胞團（ICM) ASC能夠分化成三個胚層并且潛 在地分化成成人身體的所有細胞。
[0003] 這種多能特征使得它們在再生醫學領域中是所合乎需要的并且為剖析早期胚胎 發育提供了一種寶貴的工具。盡管ESC與內細胞團的多能外胚層細胞共有這種特性，但是已 經觀測到差異。
[0004] 雖然具有非常類似于體內發育的人類胚胎干細胞(hESC)狀態將大有益處，但是尚 不清楚的是，hESC的體外培養條件在模擬其中多能性僅短暫存在的胚泡的環境方面受限到 什么程度。
[0005] 在小鼠中，已經報道了多種細胞類型滿足多能性的要求并且這些不同的細胞匹配 不同的胚胎發育階段。
[0006] 不同多能狀態由因子所介導的分離也已經被成功地應用于人類細胞，這證實了在 原則上在多種多能細胞類型之間相互轉化的可行性。
[0007] 為了獲得更類似于天然多能外胚層的hESC，無轉基因的方法將是有利的。
[0008] 因此，本發明的目的在于提供和維持如下的多能干細胞狀態，所述多能干細胞狀 態修正了現有技術的缺點并且更有效地分化。

【發明內容】

[0009] 在第一個方面，提供了一種用于培養和維持處于未分化狀態的多能干細胞的方 法，所述方法包括將所述多能干細胞培養在包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、AMPK和/或BMP信 號轉導的雙重抑制劑以及LIF的培養基中。
[0010] 在第二個方面，提供了一種多能干細胞，所述多能干細胞是通過如本文所述的方 法而產生的。
[0011] 在第三個方面，提供了一種用于由多能干細胞產生譜系特異性細胞的方法，所述 方法包括:a)根據本文所述的方法培養處于未分化狀態的多能干細胞;b)分離未分化的所 述多能干細胞；以及c)將所述分離的未分化的多能干細胞培養在適合于使所述分離的多能 干細胞分化成譜系特異性細胞的培養基中。
[0012] 在第四個方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒在用于如本文所述的方法中時用 于培養和維持處于未分化狀態的多能干細胞，所述試劑盒包括如所述的培養基和使用說明 書。
[0013] 定義
[0014] 如本文所用的短語"培養基"指的是用于支持干細胞和細胞譜系中的任一種生長 的液體物質。根據一些實施方案，由本發明所使用的培養基可以是基于水的培養基，所述培 養基可以包含諸如鹽、營養素、礦物質、維生素、氨基酸、核酸、蛋白質之類的物質的組合，所 述蛋白質諸如細胞因子、生長因子以及激素。
[0015] 如本文所用的術語"飼養細胞"指的是在將干細胞在飼養細胞上共培養時或在將 多能干細胞在由飼養細胞產生的條件培養基存在下培養在基質（例如細胞外基質、合成基 質）上時維持所述干細胞處于增殖狀態的飼養細胞(例如成纖維細胞）。所述飼養細胞的支 持取決于在處于培養中時飼養細胞的結構(例如通過將飼養細胞培養在組織培養板中所形 成的三維基質）、飼養細胞的功能(例如飼養細胞分泌的生長因子、營養素以及激素、飼養細 胞的生長速率、飼養細胞在衰老之前的擴增能力)和/或干細胞對一個或多個飼養細胞層的 附著。
[0016] 如本文所用的術語"層粘連蛋白"指的是通常參與細胞外基質的形成和維持的糖 蛋白家族中的任一種。層粘連蛋白是由a鏈、M連、以及Y鏈形成的異三聚體。在本公開的一 些方面，可以使用各種層粘連蛋白的片段、衍生物或類似物，如具有與層粘連蛋白al鏈至少 基本上同源的至少一部分的層粘連蛋白。
[0017] 如本文所用，如本文所用的術語"膠原"被理解為意指所有膠原類型和任何形式的 膠原，無論是天然與否、去端肽膠原、不溶性膠原、膠原纖維、可溶性膠原、以及酸溶性膠原。
[0018] 如本文所用的術語"纖維連接蛋白"指的是二硫化物連接的二聚體糖蛋白（它以可 溶性形式存在于血漿和其它體液中，并且以纖維狀形式沉積作為疏松結締組織的細胞外基 質的主要成分）。它由被稱作I型、II型以及III型同源物的三種不同的結構基序構成，從而 產生纖維連接蛋白分子的模塊化組織，其中它的多種生物學活性可以各自歸因于特定的結 構域。
[0019]如本文所用的術語"蛋白多糖"意指"人類分泌型蛋白多糖"，它可能含有或可能不 含與蛋白多糖的核心蛋白共價結合的糖胺聚糖鏈。所述術語還意圖包括人類分泌型蛋白多 糖的肽片段，其中肽核心蛋白含有少于天然存在數目的氨基酸，如蛋白多糖的保留了生物 學(功能或結構)活性的部分片段。
[0020] 如本文所用的術語"功能的"是以與天然非重組蛋白質相同的方式誘導特定生物 學反應的能力。結構活性的實例是結合也識別天然非重組蛋白質的抗體的能力。所述術語 還用于包括任何肽，所述肽包含天然存在的蛋白質或其類似物連同一個或多個側接氨基酸 的序列，它們顯示出生物學(功能或結構)活性。
[0021] "功能衍生物"指的是與非重組蛋白質或其它生物分子的生物學活性基本上類似 的生物學(功能的或結構的)活性。功能衍生物可能含有或可能不含翻譯后修飾。術語"功能 衍生物"意圖包括分子的"片段"、"變體"、"類似物"或"化學衍生物"。
[0022] 如本文所用的術語"片段"意圖指的是分子的任何變體，如肽核心或肽核心的可能 具有或可能不具功能性的變體。
[0023] 如本文所用的術語"變體"意圖指的是在結構和生物學活性上與整個分子或其片 段基本上類似的分子。因此，假如兩個分子具有相似的活性，那么即使所述分子中的一個的 組成或二級結構、三級結構或四級結構與另一個中所存在的并不相同或即使氨基酸殘基的 序列并不相同，它們仍被認為是變體，如該術語在本文中所使用的那樣。
[0024] 如本文所用，分子的"類似物"意圖指的是在功能上與整個分子或其片段基本上類 似的分子。如本文所用，當分子含有通常不是所述分子的一部分的另外的化學部分時，它被 認為是另一分子的"化學衍生物"。這些部分可以提高分子的溶解性、吸收性、生物半衰期 等。所述部分可以可選地減小分子的毒性、消除或減弱分子的任何不希望有的副作用等。能 夠介導這樣的作用的部分公開于Remington's Pharmaceutical Sciences(《雷明頓藥物科 學》）（1980)中。用于使這樣的部分與分子偶聯的程序是本領域公知的。
[0025] 如本文所用的術語"巢蛋白"還意圖指的是巢蛋白-l(NID-l)。巢蛋白是基底膜除 了諸如IV型膠原、蛋白多糖(硫酸乙酰肝素和糖胺聚糖）、層粘連蛋白以及纖維連接蛋白之 類的其它組分以外的一種組分。
[0026] 如本文所用的"硫酸乙酰肝素"是碳水化合物的糖胺聚糖家族的成員并且在結構 上與肝素非常密切相關。這兩者均由可變硫酸化的重復二糖單元組成。
[0027] 如本文所用的術語"生物聚合物"指的是單一生物聚合物或兩種或更多種生物聚 合物的混合物。"生物聚合物"用于表示天然聚合物，包括但不限于多糖(纖維素、淀粉等）； 由天然產品和副產品合成的聚合物。
[0028]如本文所用的RNA測序指的是用于確定RNA分子的序列和/或對樣品中的RNA分子 的量進行定量的技術。RNA分子包括但不限于總RNA、信使RNA(mRNA)、核糖體RNA(rRNA)、轉 運RNA(tRNA)、小干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或RNA片段。
[0029] 如本文所用的實時PCR指的是聚合酶鏈反應(PCR)技術，所述技術用于監測在反應 期間由PCR測定所發出的信號作為在每一個PCR擴增循環期間（8卩"實時"）擴增子產生的指 標，這與常規的PCR方法相反，在所述常規的PCR方法中，在PCR反應的終點時檢測測定信號。
[0030] 如本文所用的"MEK抑制劑"是抑制有絲分裂原激活的蛋白激酶MEK1和/或MEK2的 化學品或藥物。
[0031]如本文所用的GSK3抑制劑是抑制糖原合酶激酶3的化學品或藥物。
[0032]如本文所用的AMPK抑制劑是抑制5'腺苷一磷酸激活的蛋白激酶的化學品或藥物。 [0033]如本文所用的BMP信號轉導抑制劑是抑制骨形態發生蛋白（BMP)信號轉導的化學 品或藥物。
[0034] 如本文所用的"LIF"指的是白血病抑制因子。
[0035] 如本文所用的術語"譜系特異性細胞"可以是體細胞或細胞器。在另一個實施方案 中，所述譜系特異性細胞可以是內胚層譜系細胞。在另一個實施方案中，所述體細胞可以是 能夠自我更新或分化成一個或幾個體細胞譜系的定向祖細胞，或完全成熟的體細胞分化的 細胞。
[0036] 本文說明性描述的發明可以在不存在本文沒有具體公開的任何一個或多個要素、 一個或多個限制條件的情況下被適當地實施。因此，舉例來說，術語"包含"、"包括"、"含有" 等應當被寬泛地并且不加限制地解讀。此外，本文所用的術語和表達已經被用作描述性術 語而非限制性術語，并且并不意圖在使用這些術語和表達時排除所示的以及所述的特征或 其部分的任何等同方案，但應當認識到的是，各種改動方案在要求保護的本發明的范圍內 是可能的。因此，應當了解的是，盡管已經通過優選的實施方案和任選的特征明確地公開了 本發明，但是本文所公開的發明中所體現的改動方案和變化方案可以由本領域技術人員所 采取，并且這些改動方案和變化方案被認為落入本發明的范圍內。
[0037]本發明已經在本文中被寬泛地并且一般性地描述。落入一般性公開內的較縮小內 容和亞類分組中的每一個也形成本發明的一部分。這包括以從所述類中去除任何主題的附 帶條件或負面限制條件來一般性地說明本發明，不論所排除的內容是否在本文被具體地敘 述。
[0038] 其它實施方案落入以下權利要求書和非限制性實施例的范圍內。此外，在本發明 的特征或方面以馬庫什組(Markush group)來描述的情況下，本領域技術人員將認識到的 是，本發明因此同樣以馬庫什組的任何單個成員或成員的亞組來描述。
【附圖說明】
[0039] 在結合非限制性實施例和附圖考慮時，參考詳細說明將更好地理解本發明，在附 圖中：
[0040]圖1:對于支持人類多能細胞狀態的新型培養條件進行的小分子篩選。
[0041] A)用于鑒定支持新型多能細胞狀態的培養條件的小分子的列表。示出了化學品的 名稱和它們所靶向的對應通路。
[0042] B)經過單個化學品處理的hESC針對多能性標志物NAN0G、0CT4以及TRA-1 -60的染 色。將hESC以1:12的比率接種并且在接種后的48小時之時用單個化學品處理4天。與經過 DMS0處理的對照細胞相比，多能性標志物的水平基本上保持不變。比例尺代表200mi。
[0043] C)在經過單個化學品處理的hESC中多能性標志物的基因表達水平。經過TGFI3抑制 劑R印S0X和A83-01以及GSK30抑制劑BI0處理的hESC顯示出NAN0G和P0U5F1的下調。
[0044] D)用于這一研究中的小分子化合物的24種組合。
[0045] E)在用小分子的24種組合處理后hESC集落的形態。比例尺代表200mi。
[0046] F)將細胞用組合22(PD03/BI0/D0R)的單個化學品處理，在飼養細胞上傳代培養， 并且在4天后收集以檢查多能性標志物表達。經過PD03或D0R處理的細胞的NAN0G和P0U5F1 的表達保持在相當的范圍內。在經過B10處理的細胞中NAN0G和P0U5F1下調。還分析了譜系 標志物的表達水平。在經過H)03處理的細胞中PAX6轉錄物增加，并且經過BI0處理的細胞顯 示出T和GATA6的更強上調。所有值均是3次獨立實驗的平均值土s.d。
[0047] G)在轉化期間從3iL hESC培養條件中去除單個小分子或LIF。將hESC用3iL hESC 條件處理，但是沒有用3種小分子中的1種或沒有用LIF處理。在hESC集落不再能夠被維持 時，收集細胞以用于表達分析。將在不存在H)03或LIF的情況下培養的細胞在2次傳代后收 集，而將在不存在BI0或D0R的情況下培養的細胞在4次傳代后收集。小分子和LIF的去除使 得多能性基因表達降低。經由相對于對照3iL hESC歸一化來獲得相對表達水平。所有值均 是3次獨立實驗的平均值±s.d。
[0048] 圖2:用小分子處理hESC誘導了新型LIF依賴性hESC狀態。
[0049] A)在接種后的48小時之時用小分子的24種不同的組合處理4天的hESC的多能性標 志物NAN0G (頂部）和P0U5F1 (底部）的表達水平。經由相對于經過DMS0處理的對照樣品歸一 化來獲得相對表達。所有值均是3次獨立實驗的平均值±s.d。
[0050] B)在小鼠成纖維細胞飼養細胞上經過化學品組合21至24處理的hESC的繁殖。只有 經過組合22處理的hESC形成了小的致密的集落。比例尺代表200mi。
[0051 ] C)經過組合22處理的細胞僅在人類LIF存在下增殖。將經過組合22處理的細胞在 存在或不存在LIF的情況下連續傳代培養。對于每一代(P1-P3)，將細胞在匯合時固定并且 用hESC特異性表面標志物TRA-1-60染色。比例尺代表200mi。
[0052] D)示出了在3i中在存在或不存在LIF的情況下培養的hESC(Pl-3)的TRA-1-60陽性 集落的數目。所有值均是3次獨立實驗的平均值±s.d。
[0053] E)3iL hESC和hESC的形態。比例尺代表200wii。
[0054] F)3iL hESC可以單細胞形式被傳代培養。將3iL hESC和hESC以單細胞形式以克隆 密度傳代培養到96孔培養皿中。經過和沒有經過ROCK抑制劑（lyM噻唑維恩(Thiazovivin)) 處理的hESC用作對照。將細胞維持5天，固定并且針對0CT4進行染色。所有值均是3次獨立實 驗的平均值土s.d。
[0055]圖3:3iL hESC的自我更新依賴于LIF信號轉導。
[0056] A)將3iL hESC用0.6yM的Jak抑制劑（inh)處理。將對照細胞用DMS0處理。將細胞在 處理10天后固定并且針對多能性標志物NAN0G、0CT4以及TRA-1-60進行染色。
[0057] B)在3iL hESC中在存在和不存在Jak抑制劑的情況下TRA-1-60陽性集落的數目。 所有值均是3次獨立實驗的平均值± s. d。
[0058] C)在hESC中在存在和不存在Jak抑制劑的情況下多能性基因和LIF信號轉導響應 性基因的表達。所有值均是3次獨立實驗的平均值±s.d。
[0059] D)在hESC中LIF信號轉導組分的表達。示出了 STAT3、LIFR、GP130以及看家基因 GATOH的平均Ct值。高Ct值表明GP130在hESC中低表達。所有值均是3次獨立實驗的平均值土 s ? d〇
[0060] E)在用3 i處理hESC時對GP130表達的誘導。經由相對于經過DMS0處理的對照樣品 歸一化來獲得相對表達水平。所有值均是3次獨立實驗的平均值±s.d。
[0061 ] F)在3iL hESC和hESC中GP130的相對表達水平。所有值均是3次獨立實驗的平均值 土 s ? d 〇
[0062] G)與hESC相比，在3iL hESC中GP130蛋白質的上調。使用針對GP130具有特異性的 抗體來檢測3iL hESC和hESC的全細胞提取物中GP130的存在。
[0063] H)與經過LIF處理的hESC相比，3iL hESC顯示出更高水平的磷酸化STAT3。使用 hESC、在10ng/ml LIF存在下培養的hESC以及3iL hESC的全細胞提取物來確定在各個培養 條件中STAT3磷酸化的水平。GAPDH蛋白質水平用作上樣對照。與3iL培養條件相比，LIF的添 加微弱地激活了 STAT3磷酸化。
[0064] I)在用3i、3iL、或LIF處理4天后在hESC中STAT3響應性基因 S0CS3和KLF4的激活。 所有值均是3次獨立實驗的平均值± s. d。
[0065]圖4:對于3iL培養條件來說重要的信號轉導通路。
[0066] A)在經過3i處理的hESC中NAN0G表達水平對LIF信號轉導有響應。將hESC在存在和 不存在3i的情況下培養，并且用遞增量的人類重組LIF處理。在處理5天后，將細胞收集用于 表達分析。與經過DMS0處理的對照hESC相比，多能性基因 NAN0G的水平在3i小分子存在下以 劑量依賴性方式對LIF信號轉導有響應。
[0067] B)抑制關鍵的hESC信號轉導通路引起3iL hESC分化。將3iL hESC用抑制TG邱信號 轉導通路（A83-01)、FGF信號轉導通路（PD173074)、PI3K通路（LY294002)以及EGF通路 (PD15035)的化學品處理。將3iL hESC處理10天并且針對多能性標志物進行染色。與3iL hESC對照相比，在3iL hESC中抑制TGFWI路、FGF通路以及PI3K通路使得多能性標志物 NANOG、0CT4以及TRA-1 -60喪失。比例尺代表200wii。
[0068] C)在經過信號轉導通路抑制劑處理的3iL hESC中多能性基因的下調。所有值均是 3次獨立實驗的平均值土s.d。
[0069]圖5:3iL hESC是多能的。
[0070] A)3iL hESC和hESC針對多能性標志物NAN0G和0CT4、以及hESC特異性細胞表面標 志物TRA-1 -60和TRA-1 -81的染色。比例尺:200wii。
[0071] B)在hESC和3iL hESC中多能性相關基因和外胚層基因的相對表達。所有值均是3 次獨立實驗的平均值土s.d。
[0072] C)hESC和3iL hESC中NAN0G和0CT4的蛋白質水平的蛋白質印跡分析。對應于NAN0G 基因表達水平的提高，與hESC相比，3iL hESC中的NAN0G蛋白質水平更高。
[0073] D)對3iL hESC和hESC中的多能性標志物進行的FACS分析表明3iL hESC表達更高 水平的 NAN0G、TRA-1-60 以及 TRA-1-81。
[0074] E)3iL hESC在懸浮培養中形成類胚體(EB)并且在體外分化成3個胚層和滋養外胚 層。示出了在懸浮液中培養20天的3iL hESC衍生的EB(頂部左圖）以及被接種到明膠板上的 類胚體的粘附和擴增（頂部右圖）。311 hESC可以分化成外胚層（PAX6)、定形內胚層 (S0X17)、中胚層(GATA4)以及滋養外胚層(p57Kip2)。比例尺:200_。
[0075] F)3iL hESC在被注射到SCID小鼠體內時形成畸胎瘤。示出了含有代表了所有三個 胚胎胚層的組織的畸胎瘤切片。比例尺:50mi。
[0076] G)3iL hESC比hESC更有效地形成畸胎瘤。由3iL hESC形成的畸胎瘤的體積(左圖） 以及形成畸胎瘤所花費的平均時間（右圖）。示出了對于每一種條件進行的6次重復實驗。 [0077] H)在培養2個月后，3iL hESC表現出正常的核型。
[0078]圖6:3iL培養條件支持其它hESC細胞系和iPSC的穩定培養。
[0079] A)hES3hESC和hES3衍生的3iL hESC的形態。比例尺代表200wii。
[0080] B)hES3hESC和hES3衍生的3iL hESC針對多能性標志物NAN0G和0CT4、以及細胞表 面標志物TRA-1-60和TRA-1-81的染色。比例尺代表200wii。
[0081 ] C)與hES3hESC相比，hES3衍生的3iL hESC表達更高水平的NAN0G。所有值均是3次 獨立實驗的平均值土s.d。
[0082] D)hES3衍生的3iL hESC在被注射到SCID小鼠體內時形成畸胎瘤。示出了含有代表 了所有三個胚胎胚層的組織的畸胎瘤切片。比例尺代表50mi。
[0083] E)在培養2個月后，hES3衍生的3iL hESC表現出正常的核型。
[0084] F)在hES3衍生的3iL hESC中外胚層特異性基因（Yan等，2013)的表達。與hESC相 比，在3iL hESC中外胚層特異性基因上調。所有值均是3次獨立實驗的平均值土s.d。
[0085] G)hES2hESC和hES2衍生的3iL hESC的形態。比例尺代表200wii。
[0086] H)hES2hESC和hES2衍生的3iL hESC針對多能性標志物NAN0G和0CT4、以及細胞表 面標志物TRA-1-60和TRA-1-81的染色。比例尺代表200wii。
[0087] I)與hES2hESC相比，hES2衍生的3iL hESC表達更高水平的NAN0G。所有值均是3次 獨立實驗的平均值土s.d。
[0088] J)hES2衍生的3iL hESC在被注射到SCID小鼠體內時形成畸胎瘤。示出了含有代表 了所有三個胚胎胚層的組織的畸胎瘤切片。比例尺代表50mi。
[0089] K)在培養2個月后，hES2衍生的3iL hESC表現出正常的核型。
[0090] L)在hES2衍生的3iL hESC中外胚層特異性基因的表達。與hESC相比，在3iL hESC 中外胚層特異性基因上調。所有值均是3次獨立實驗的平均值±s.d。
[0091 ] M)將人類MRC5成纖維細胞用四種Yamanaka重編程因子(reprogramming factor) (0CT4、S0X2、KLF4以及MYC)和pMX-GFP進行逆轉錄病毒轉導。在3周后，將細胞用標準培養基 或3i+LIF培養基處理。在處理1周后，對TRA-1-60集落的數目進行計數。
[0092] N)3iL處理(參見M)產生更高數目的TRA-1-60陽性集落，這些集落還呈GFP陰性，這 表明在3iL處理后獲得了更多的高質量iPSC集落。
[0093] 0)定量PCR數據，所述數據顯示在3iL條件中培養的iPSC中病毒轉基因更大程度下 調。所有值均是3次獨立實驗的平均值土 s. d。
[0094] P)在3iL培養條件中6次傳代后先前表征的人類iPSC的形態。比例尺代表200mi。 [0095] Q)人類iPSC以及在3iL條件中培養6代的相同細胞針對多能性標志物NAN0G和0CT4 以及細胞表面標志物TRA-1-60和TRA-1-81的染色。比例尺代表200_。
[0096] R)3iL hiPSC中外胚層特異性基因的表達。與iPSC相比，在3iL hiPSC中外胚層特 異性基因上調。所有值均是3次獨立實驗的平均值±s.d。
[0097]圖7:3iL hESC的轉錄組類似于體內植入前外胚層。
[0098] A)hESC和3iL hESC中熟勵6、1(1^4、18父3、0??厶3以及6厶?011的經過歸一化的尺祖-569 讀段計數。黑線示出了三次重復實驗的平均值，單獨的重復實驗分別是以灰色陰影示出的 (重疊）。通過每一次重復實驗的定位讀段的數目對讀段計數進行歸一化。坐標是關于人類 基因組版本hgl9。
[0099] B) 3 i L特異性基因的表達與植入前胚胎中hESC特異性基因的表達的比較。示出了 來自非配對t檢驗的檢驗統計量，正值表明3iL特異性基因顯示出比hESC特異性基因高的表 達，而對于負值來說則相反。顯著性差異(多重檢驗調整的P值〈0.05)用*標出。在檢驗前將 每個樣品和基因的數據歸一化。
[0100] C)熱圖，所述熱圖顯示來自植入前胚泡和hESC的在3iL hESC與hESC之間差異性表 達的基因的單細胞基因表達。使用分層聚類對這組基因進行聚類。基因是按照胚泡與hESC 之間平均表達的倍數變化來排序的（黑色到白色的比例尺）。差異性表達的基因（3iL hESC 對比hESC)由黑線標出。
[0101] D)基因集富集分析(GSEA)。基因是根據3iL hESC與hESC之間表達的倍數變化來排 序的。示出了在hESC和人類外胚層中差異性表達的基因的富集。在3iL hESC中顯示出增加 的表達的基因被富集在外胚層特異性基因的集合中（虛線，魏氏秩和檢驗(Wilcoxon rank-sum test)p值=1.03e-48)，而在常規的hESC中顯示出增加的表達的基因被富集在與在人 類外胚層中相比在hESC中顯示出更高表達的基因的集合中（實線，p值= 1.61e-20)。
[0102] E)在3iL hESC、hESC、人類植入前外胚層（來自單細胞數據的平均值）、第0代hESC (來自單細胞數據的平均值）、第1 〇代hESC (來自單細胞數據的平均值）中hESC特異性基因和 3iL hESC特異性基因的經過歸一化的表達。使用配對t檢驗計算p值。基因的數目對應于在 3iL hESC和hESC中差異性表達并且其中表達先前已被提供的基因。
[0103] F)對與在hESC中相比在3iL hESC中上調的外胚層特異性基因的實時qPCR驗證。所 有值均是3次獨立實驗的平均值土 s. d。
[0104] 圖8:在3iL培養的hESC中天然外胚層標志物和GATA6的表達。
[0105] A)與在hESC中相比在3iL hESC中顯示出增加的表達的基因與和在hESC中相比在 外胚層細胞中顯示出增加的表達的基因的重疊。使用費雪精確檢驗（Fisher's exact test)確定顯著性分數。
[0106] B)與在hESC中相比在3iL hESC中顯示出減少的表達的基因與和在hESC中相比在 外胚層細胞中顯示出增加的表達的基因的重疊。使用費雪精確檢驗確定顯著性分數。
[0107] C)與在hESC中相比在3iL hESC中顯示出減少的表達的基因與和在hESC中相比在 外胚層細胞中顯示出減少的表達的基因的重疊。使用費雪精確檢驗確定顯著性分數。
[0108] D)與在hESC中相比在3iL hESC中顯示出增加的表達的基因與和在hESC中相比在 外胚層細胞中顯示出減少的表達的基因的重疊。使用費雪精確檢驗確定顯著性分數。
[0109] E)對hESC和3iL hESC進行的單細胞基因表達分析。在hESC與3iL hESC之間P0U5F1 表達水平是相當的。在3iL hESC中包括NAN0G在內的外胚層基因的表達增加，并且所述數據 揭示了這些基因在3iL hESC中共表達。分化基因在hESC和3iL hESC這兩者中以低的并且相 當的水平表達。
[0110] F)GATA6的基因組基因座，示出了在hESC和3iL hESC中經過歸一化的RNA-Seq讀段 計數。黑線示出了三次生物學重復實驗的平均值，單獨的重復實驗是以灰色陰影示出的（重 疊）。通過每一次重復實驗的定位讀段的數目對讀段計數進行歸一化，坐標是關于人類基因 組版本hgl9。
[0111] G)在3iL hESC和hESC中hESC特異性基因的對數轉換FPKM值。使用配對魏氏檢驗來 確定顯著性。
[0112] H)對與外胚層、內胚層以及中胚層相關的基因進行的定量PCR驗證。所有值均是3 次獨立實驗的平均值土s.d。
[0113] I)對3iL hESC中GATA6的表達進行的定量PCR驗證。所有值均是3次獨立實驗的平 均值土s.d。
[0114] J)3iL hESC和hESC中GATA6的蛋白質水平。肌動蛋白用作上樣對照。
[0115] K)GATA6和NAN0G的免疫熒光共染色證實這2種蛋白質在3iL hESC中共表達。比例 尺代表200wii。
[0116] L)對3iL hESC和hESC中NAN0G和GATA6的共表達進行的FACS分析。僅用二抗對同種 型對照進行染色。
[0117] M)對3iL hESC和hESC中0CT4和GATA6的共表達進行的FACS分析。僅用二抗對同種 型對照進行染色。
[0118] N)對3iL hESC和hESC中TRA-1-60和GATA6的共表達進行的FACS分析。僅用二抗對 同種型對照進行染色。
[0119] 0)3iL hESC和hESC中0CT4和NAN0G的結合譜。通過定位讀段的總數對讀段計數進 行歸一化。
[0120] 圖9: 3iL hESC的表觀基因組全貌(epigenomic landscape)。
[0121] A)GSEA曲線圖，示出了與在hESC中相比在3iL hESC中在啟動子處顯示出H3K4me3、 H3K27ac以及H3K27me3的增加(虛線）或減少(實線）的基因的富集。將基因按照cuffdiff檢 驗統計量排序。在3iL hESC中顯示出增加的表達的基因被富集在顯示出增加的H3K27ac(魏 氏秩和檢驗P值= 8.83e-263)、增加的H3K4me3(p值= 2.4e-69)以及減少的H3K27me3(p值= 4.90e-92)的基因的集合中。在3iL hESC中顯示出減少的表達的基因被富集在顯示出減少 的 H3K27ac(p 值〈1.0e-300)、減少的 H3K4me3(p值= 3.38e-193)以及增加的 H3K27me3(p值= 1.44e-12)的基因的集合中。
[0122] B)使用DESeq2估計的差異性表達的基因在啟動子處的組蛋白修飾的經過歸一化 的讀段計數的倍數變化。將基因按照cuffdiff檢驗統計量排序并且將每個基因歸一化。
[0123] C)第0代hESC特異性基因和外胚層特異性基因在啟動子(轉錄起始位點，TSS)處的 組蛋白修飾的經過歸一化的讀段計數的倍數變化。使用魏氏秩和檢驗來估計顯著性。
[0124] D)在3iL hESC和hESC中H3K4me3、H3K27ac以及H3K27me3的ChIP-Seq譜。突出顯示 的區域代表了所觀測到的組蛋白甲基化譜中的變化。對于TBX3、ZNF600、KLF5以及H0XB簇， 突出顯示的區域標出了3iL hESC中具有增加的H3K27ac和/或減少的H3K27me3的基因座。對 于C19orf66和0LFM2,突出顯示的區域標出了3iL hESC中具有減少的H3K27ac和/或增加的 H3K27me3的基因座。通過定位讀段的總數對讀段計數進行歸一化。
[0125]圖10:胚泡細胞和hESC中所選擇的天然外胚層標志物的表達。
[0126] A)在3iL hESC中顯示出增加的H3K27ac的基因（TBX3、KLF5、ZNF600)以及在3iL hESC中顯示出增加的H3K27me3的基因（C19orf66和0LFM2)在胚泡、hESC P0以及hESC P10中 的平均FPKM值。
[0127] 圖ll:3iL hESC中新型的NAN0G和0CT4結合位點。
[0128] A)與保持不變的NAN0G結合事件相比，3iL特異性NAN0G結合事件距最接近的基因 顯著更遠。使用魏氏秩和檢驗來估計顯著性。P值=1.19eT 166。
[0129] B)3iL hESC和hESC中0CT4、NAN0G以及STAT3的結合譜。突出顯示的區域標出了3iL hESC中具有增加的NAN0G結合的基因座。通過定位讀段的總數對讀段計數進行歸一化。 [0130] 圖12:3iL hESC中多能性轉錄網絡的重塑。
[0131] A)GSEA曲線圖，示出了顯示出附近的NAN0G結合、0CT4結合或p300結合的增加(虛 線)或減少(實線）的基因的富集。將基因按照cuffdiff檢驗統計量排序。在3iL hESC中顯示 出增加的表達的基因被富集在顯示出增加的NAN0G結合(魏氏秩和檢驗p值= 3.97e-38)、 0CT4結合(p值= 4.43e-ll)以及p300結合(p值= 8.81e-24)的基因的集合中。在3iL hESC中 顯示出減少的表達的基因被富集在顯示出減少的NAN0G結合（p值=7.16e-06)和減少的 0CT4結合(p值=5.5e-08)的基因的集合中。
[0132] B)3iL hESC和hESC中0CT4、NAN0G以及STAT3的結合譜。突出顯示的區域標出了3iL hESC中具有增加的0CT4和/或NAN0G的基因座。通過定位讀段的總數對讀段計數進行歸一 化。
[0133] C)3iL hESC中的重新連線的轉錄回路。3iL誘導的回路包括在3iL hESC中上調并 且在天然外胚層中表達的基因，特別是TBX3、DPPA3、KLF5。由諸如P0U5F1和S0X2的基因組成 的核心多能性回路網絡仍是新網絡的一部分，從而強調了所述3iL網絡是被重新連線，而不 是被替代。STAT3也與所述網絡的基因結合(箭頭指示了具有顯著性分數>150的峰值），這表 明外部信號轉導網絡潛在地與所述轉錄網絡配合以誘導3iL hESC中的天然外胚層標記。
[0134] D)3iL支持了更類似于天然植入前外胚層狀態的LIF依賴性hESC狀態。每一個小圓 代表了轉錄因子或細胞類型特異性因子。圓圈之間的實線或虛線表示在調節不同的多能狀 態中這些因子之間的相互作用。從淺到深的灰色梯度代表了3iL hESC和hESC與人類胚泡的 多能外胚層細胞的接近度。
[0135] 圖13:誘導3iL hESC中的發育基因增強了3iL hESC分化。
[0136] A)3iL hESC中胚胎外譜系基因的上調。與hESC相比，在3iL hESC中早期滋養母細 胞標志物⑶X2和BMP4以及內胚層標志物GATA4和GATA6的表達上調。所有值均是3次獨立實 驗的平均值土s.d(n = 3)。
[0137] B)3iL hESC中的中內胚層基因的上調。與hESC相比，在3iL hESC中，中內胚層標志 物T、MIXL1以及E0MES的表達上調。所有值均是3次獨立實驗的平均值±s.d(n = 3)。
[0138] C)3iL hESC在使用激活素 A和IDE-1處理的情況下有效地沿著內胚層譜系分化。將 3iL hESC和hESC以相似的密度接種在基質膠包被的培養皿上并且用激活素 A和IDE-1處理 以朝向內胚層譜系分化。在處理第5天時將細胞固定并且針對定形內胚層標志物S0X17和 F0XA2進行染色。在3iL hESC樣品中檢測到S0X17和F0XA2陽性細胞的集群，而在hESC樣品中 有很少的細胞針對這些標志物染色呈陽性。
[0139] D)與經過激活素 A和IDE-1處理的hESC樣品相比，在3iL hESC樣品中內胚層標志物 被更強誘導。與hESC樣品相比，在3iL hESC樣品中，內胚層標志物S0X17、F0XA2、HNF4A以及 CXCR4的基因表達非常高地上調。所有值均是3次獨立實驗的平均值土s.d(n = 3)。
[0140] E)3iL hESC和hESC在使用激活素 A/FGF2/BMP4處理的情況下有效地沿著內胚層譜 系分化。將3iL hESC和hESC以相似的密度接種在基質膠包被的培養皿上并且用激活素 A/ FGF2/BMP4處理以朝向內胚層譜系分化。在處理第5天時將細胞固定并且針對定形內胚層標 志物S0X17和F0XA2進行染色。與hESC樣品中的細胞相比，3iL hESC樣品中有更多的細胞表 達更高水平的F0XA2。
[0141] F)與經過激活素 A/FGF2/BMP4處理的hESC樣品相比，在3iL hESC樣品中內胚層標 志物被更強誘導。與hESC樣品相比，在3iL hESC樣品中，內胚層標志物F0XA2、HNF4A以及 CXCR4的基因表達非常高地上調。所有值均是3次獨立實驗的平均值土s.d(n = 3)。
【具體實施方式】
[0142] 在第一個方面，本發明涉及一種用于培養和維持處于未分化狀態的多能干細胞的 方法，所述方法包括將所述多能干細胞培養在包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、AMPK和/或BMP 信號轉導的雙重抑制劑以及LIF的培養基中。
[0143] 在一個實施方案中，所述多能干細胞是誘導性多能干細胞。
[0144] 在另一個實施方案中，所述培養基可以是條件培養基。
[0145] 在另一個實施方案中，所述培養基可以包含飼養細胞。在另一個實施方案中，所述 培養基可以不含飼養細胞。
[0146] 可以將所述多能干細胞培養在基質上。所述基質可以是基底膜基質。在一個實施 方案中，所述基質可以是包含以下各項中的一種或多種的細胞外基質：層粘連蛋白、膠原、 明膠、纖維連接蛋白、玻連蛋白、蛋白多糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素、合成生物聚合物或合成 肽。
[0147] 所述多能干細胞可以是胚胎干細胞。所述胚胎干細胞優選地是人類的。然而，將了 解的是，來自其它物種的干細胞可以是合適的。舉例來說，鼠類胚胎干細胞或靈長類動物胚 胎干細胞也可以是合適的。
[0148]如本文所述的方法可以包括將處于未分化狀態的多能干細胞進一步傳代的步驟。 [0149] 所述MEK抑制劑可以選自由以下各項組成的組：曲美替尼（Trame t in ib ) (GSK1120212)、司美替尼（Selumetinib)、比尼替尼（Binimetinib)或 MEK162、PD-0325901、 卡比替尼（Cobimetinib)或 乂1518、(：1-1040、？098059、？0184352、1]0126或來自這些現有化合 物的任何衍生物。
[0150] 所述MEK抑制劑可以處在以下濃度：約0. lyM-5yM、約0.2yM-4yM、約0.3yM-3yM、約 0.4yM-2yM以及約0.5yM- lyM。在一個實施方案中，所述MEK抑制劑可以處在約0.5yM-1 yM的 濃度。
[0151] 所述GSK3 抑制劑可以選自 6-溴靛玉紅-3'-E(BI0)、CHIR-99021、SB216763、CHIR-98014、TWS119、頂-12、1-氮雜坎帕羅酮、AR-A014418、SB415286、AZD1080、AZD2858、-S&、 以及這些化合物的任何衍生物。
[0152] 所述GSK3抑制劑可以處在以下濃度:約0.5yM-5yM、約0.75yM-4yM、約0.8yM-3yM、 約0.85yM-2yM、約0.9yM-2yM、約0.95yM-2yM、約 lyM-2yM以及約 1.5yM-2yM。在一個實施方案 中，所述GSK3抑制劑可以處在約lyM-2yM的濃度。
[0153] 所述BMP4信號轉導和AMPK抑制劑可以選自6-[4-(2_哌啶-1-基乙氧基）苯基]-3-吡啶-4-基吡唑并[1，5-a]嘧啶（多索摩芬（Dorsomorphin))、LDN-193189、LDN212854、 K02288、A-769662、阿卡地新（Acadesine)、苯乙雙胍(Phenformin)以及來自這些化合物的 任何衍生物。
[0154] 所述BMP4信號轉導和AMPK抑制劑可以處在以下濃度：約0.5yM、約1 yM、約1.2 5yM、 約1.5yM、約1.75yM以及約2yM。在一個實施方案中，所述AMPK抑制劑可以處在約2yM的濃度。
[0155] 所述LIF可以處在以下濃度：約 lng/ml_20ng/ml、約2ng/ml_20ng/ml、約2ng/ml_ 18ng/ml、約3ng/ml_16ng/ml、約4ng/ml_14ng/ml、約5ng/ml_12ng/ml、約6ng/ml_10ng/ml、 約7ng/ml-10ng/ml、約8ng/ml-10ng/ml。在一個實施方案中，所述LIF可以處在約8ng/ml_ 10ng/ml的濃度。
[0156] 包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、AMPK和/或BMP信號轉導的雙重抑制劑以及LIF的培 養基可以進一步包含表觀遺傳修飾劑，例如表觀遺傳抑制劑。表觀遺傳抑制劑包括但不限 于DNA甲基轉移酶抑制劑和組蛋白脫乙酰基酶(HDAC)抑制劑，例如1^108、81乂、0似￡?、丙戊 酸、丁酸鈉以及5-氮雜-2 脫氧胞苷。
[0157] 在另一個方面，提供了一種多能干細胞，所述多能干細胞是通過如本文所述的方 法而產生的。通過如本文所述的方法所產生的多能干細胞可以表達選自由以下各項組成的 組的至少一種多能性標志物：NAN0G、TRA-1-60、0CT4、TRA-1-81、S0X2、LIN28、PRDM14&& ZFP42。在另一個實施方案中，本文所述的多能干細胞可以表達選自由以下各項組成的組的 至少一種外胚層樣基因表達標志物：DPPA3、KLF4、KLF5、TBX3、DM1T3L、AHNAK、ARRB1、 CLEC4D、GGT5、IL6R、UMCH1、MFAP3L、SLC25A16、SMYD2、S0AT1 以及ZNF600。
[0158] 在另一個實施方案中，如本文所述的多能干細胞可以表達選自由以下各項組成的 組的至少一種胚胎外標志物:CDX2、BMP4、GATA4以及GATA6。
[0159] 在另一個實施方案中，本文所述的多能干細胞可以表達選自T、E0MES或MIXL1的至 少一種中內胚層標志物。
[0160]如本文所述的多能干細胞可以包含相對于沒有根據本文所述的方法培養的細胞 增加的表達水平的至少一種標志物。
[0161 ] 可以通過RNA測序或實時PCR來確定所述至少一種標志物的表達水平。
[0162] 在一個實施方案中，所述至少一種標志物的表達水平相對于沒有根據如本文所述 的方法培養的細胞可以增加至少1.5倍至5倍。
[0163] 在一個實施方案中，所述至少一種標志物是NAN0G并且相對于沒有根據如本文所 述的方法培養的細胞，所述表達水平可以增加1.5倍至2倍。
[0164] 在一個實施方案中，相對于沒有根據如本文所述的方法培養的細胞的分化，如本 文所述的多能干細胞向內胚層細胞、神經元細胞或中胚層細胞的分化增強。
[0165] 在另一個方面，還提供了一種用于培養和維持處于未分化狀態的多能干細胞的培 養基，其中所述培養基包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、AMPK抑制劑以及LIF。
[0166] 在另一個方面，還提供了一種用于由多能干細胞產生譜系特異性細胞的方法，所 述方法包括:a)根據如本文所述的方法培養處于未分化狀態的多能干細胞;b)分離所述未 分化的多能干細胞；以及c)將所述分離的未分化的多能干細胞培養在適合于使所述分離的 多能干細胞分化成譜系特異性細胞的培養基中。
[0167] 在一個實施方案中，所述譜系特異性細胞可以是體細胞或細胞器。在另一個實施 方案中，所述譜系特異性細胞可以是內胚層譜系細胞。
[0168] 在另一個實施方案中，所述體細胞可以是能夠自我更新或分化成一個或幾個體細 胞譜系的定向祖細胞，或完全成熟的體細胞分化的細胞。
[0169] 在另一個方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒在用于如本文所述的方法中時用 于培養和維持處于未分化狀態的多能干細胞，所述試劑盒包括如本文所述的培養基和使用 說明書。
[0170] 實驗部分
[0171] 材料和方法 [0172]細胞培養
[0173] 將hESC細胞系HI (WA-01，第28代）用于這一研究。對于hESC在TeSRl (干細胞技術公 司（Stem cell technologies))中的常規培養，將細胞在無飼養細胞的情況下培養在基質 膠(碧迪公司（BD))上。每天更換細胞培養基。每5天-7天將hESC用lmg/ml分散酶(干細胞技 術公司）傳代培養。3iL hESC培養基在TeSRl中含有lyM的H)0325901 (西格瑪公司（Sigma))、 2iiM的BIO(西格瑪公司）、2iiM的多索摩芬（西格瑪公司）以及10ng/ml的人類LIF(密理博公司 (Millipore))。將3iL培養基新鮮制備并且在4°C儲存不超過2周。對于用3iL條件進行處理， 在接種后的48小時之時將培養在TeSRl中的hESC用3iL處理。隨后將細胞在絲裂霉素 C滅活 的小鼠成纖維細胞上傳代培養。使用TrypLE(生命科技公司（Life Technologies))將細胞 游離成單細胞。每天補充3iL培養基并且將細胞在匯合時傳代培養。以liiM的最終濃度添加 ROCK抑制劑噻唑維恩以提高前幾次傳代的細胞存活率。已經將用于所有實驗中的3iL hESC 培養了至少10代以充分適應于新的培養條件。
[0174] 小分子化合物處理
[0175] 在接種后的48小時之時將hESC用分散酶游離并且開始處理。對于單一化學品和組 合化學品處理，以如下最終濃度使用小分子:0.5yM A83-01 (Stemgent公司）、2yM BI0(西格 瑪公司）、3yM (：1111?99021(3丨611^61^公司）、2_多索摩芬（西格瑪公司）、8_佛司可林 (Forskolin) (Stemgent公司）、2yM IDE-1 (Stemgent公司）、0 ? 5yM PD153035(西格瑪公司）、 1福PD173074(西格瑪公司）、1虛ro〇325901(西格瑪公司）、5虛皮斐松-a(Pifithrin-a) (西格瑪公司）以及lyM RepSox(西格瑪公司）。將所有小分子在DMS0中復水。對于PI3K通路 抑制，以10yM的最終濃度使用LY294002(西格瑪公司）。
[0176] RNA提取、逆轉錄、定量實時PCR以及RNA測序(RNA-Seq)準備
[0177] 對于表達分析，使用TRIzol試劑（英杰公司（Invitrogen))以氯仿提取總RNA并且 用異丙醇使其沉淀。在4 °C將沉淀的RNA以13000rpm離心10分鐘。將RNA沉淀物用70 %乙醇洗 滌并且隨后用DEPC處理過的水(AMBI0N公司）復水。在37°C將DNA污染物用DNA酶KAmbion公 司）消化30分鐘。在70°C使DNA酶I熱失活10分鐘。用NanoDrop 2000(賽默科技公司（Thermo Scientific))測定RNA濃度。使用500ng RNA來使用Superscript II試劑盒(英杰公司）進行 每一次逆轉錄反應以產生用于后續定量測定的cDNA。用SYBR綠色主混合物(KAPA公司），使 用ABI PRISM 7900序列檢測系統進行定量實時PCR(qPCR)分析。對于RNA-Seq文庫制備，將 總RNA通過柱(Pure 1 ink RNA小型試劑盒，Ambi on公司）進一步純化。根據制造商的說明書 (TruSeq RNA樣品制備試劑盒v2，Illumina公司）使用4yg的總RNA制備RNA-Seq文庫。簡單地 說，利用以聚T寡核苷酸附接的磁珠進行兩輪純化來獲得mRNA。然后將mRNA片段化并且進行 第一鏈和第二鏈cDNA合成，然后進行末端修復、腺苷酸化、適體連接并且最終進行15個循環 的PCR。將樣品多重化并且測序(單一讀段76bp) (HiSeq 2000，Illumina公司）。
[0178]染色質免疫沉淀
[0179] 如先前所述進行染色質免疫沉淀(〇11?)(1^^3〇1^-如18；[118等，2013)。簡單地說， 在室溫將細胞用1%甲醛固定10分鐘，并且通過添加甘氨酸達到0.2M的最終濃度以使甲醛 失活。將細胞裂解物超聲處理并且在4°C使用蛋白G Dynal磁珠使染色質提取物進行免疫沉 淀過夜，所述磁珠已經與針對以下各項的抗體偶聯:0(^4(艾博抗公司（&1303111)31319857)、 Nanog(R&D公司AF1997)、STAT3(細胞信號轉導公司（Cell Signaling)9145)、p300(圣克魯 斯公司（Santa cruz)sc585)、H3K4me3(密理博公司04-745)、H3K27ac(艾博抗公司ab4729) 或H3K27me3(密理博公司07-449)。使用NEBNext⑧ChIP-Seq文庫試劑盒(NEB Biolabs公 司）根據制造商的說明書來制備染色質免疫沉淀測序(ChIP-Seq)文庫并且用HiSeq 2000系 統（11 lumina公司）對其進行測序。
[0180] 單細胞基因表達分析
[0181] 在Biomark系統高級開發方案（Biomark System Advanced Development Protocol)41上在單細胞基因表達后使用具有低R0X的SsoFast EvaGreen超混合液收集單 細胞基因表達數據。簡單地說，直接將hESC和用3iL培養的hESC用BD FACSAria 11(碧迪生 物科技公司）分選到加有逆轉錄特異性靶標擴增溶液(生命科技公司）的96孔PCR板中。進行 逆轉錄、20個循環的預擴增以及核酸外切酶1(NEB公司）處理，之后將預擴增的產物進行7倍 稀釋。在Biomark系統（Fluidigm公司）上使用48 X 48動態陣列以具有低R0X的2 X SsoFast EvaGreen超混合液（伯樂公司（Bio-Rad))和各個qPCR引物分析擴增的單細胞樣品。使用 BioMark實時PCR分析軟件(Fluidigm公司）計算閾值交叉(Ct)值。
[0182] 體外分化
[0183] 對于經由類胚體形成進行的自發分化，將3iL hESC通過TrypLE游離并且懸浮培養 在低吸附10cm培養皿中。在2周-3周后，將類胚體轉移到明膠包被的板中并且再培養6天。對 于生長因子誘導的分化，將細胞接種到基質膠上并且用對應的培養基處理以沿著不同的譜 系分化:對于定形內胚層分化，是于含有2%FBS(GIBCO公司）的高級RPMI培養基(GIBCO公 司）中的100ng/ml激活素 A;對于中胚層分化，是于含有20%KSR(GIBC0公司）的F12DMEM (GIB⑶公司）中的100ng/ml BMP4和4ng/ml bFGF;對于滋養外胚層分化，是于含有20%KSR (GIBC0公司）的F12 DMEM(GIBCO公司）中的100ng/ml BMP4和1處PD0325901;以及對于神經 外胚層分化，是于補充有0.5 X N2和B27補充劑的神經基礎培養基中的10yM SB431542和2yM 多索摩芬。
[0184] 畸胎瘤形成
[0185] 將在標準培養基中培養的hESC或3iL hESC用TryplE游離并且以1X107個細胞/毫 升的濃度重懸在30%基質膠/F12DMEM(GIBC0公司）中。將Rock抑制劑噻唑維恩(Stemgent公 司）以0.5yM的最終濃度添加到標準培養基中的hESC培養物中。將200yl的細胞懸浮液注射 到用阿佛丁(Avertin)麻醉的SCID小鼠的背側側腹中。在6周至8周后形成畸胎瘤并且將它 們通過手術解剖，固定在布安溶液(Bouin's solution)中并且包埋于石錯中。將它們切片 并且用馬洛里四色染色(Mallory's Tetrachrome staining)分析。
[0186] 蛋白質印跡分析
[0187] 將hESC用補充有蛋白酶抑制劑混合液（默克公司（Merck))的裂解緩沖液（50mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、10yM ZnCl、0.5%諾乃（Nonidet)P-40、5%甘油）裂解。使 用Bradford測定試劑盒(伯樂公司）測量蛋白質濃度。使50yg的細胞裂解物在10%SDS-聚丙 烯酰胺凝膠上分離并且轉移到聚偏二氟乙烯膜(密理博公司）上。將膜用溶解在含有0.1% !^?^1120的?83(0.1%?831')中的5%脫脂奶封閉。在封閉后，分別將印跡與抗0(^4(艾博抗公 司）、抗NAN0G(R&D公司）、GP130 (圣克魯斯公司）、抗STAT3 (細胞信號轉導公司）、抗磷酸化 Tyr705STAT3(細胞信號轉導公司）或抗GAPDH(圣克魯斯公司）一抗孵育過夜，用0.1%roST 洗滌并且與辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗兔IgG(圣克魯斯公司）或HRP綴合的抗山羊IgG (圣克魯斯公司）一起孵育。在用PBST洗滌后，使用蛋白質印跡魯米諾(Luminol)試劑(圣克 魯斯公司)檢測信號。
[0188] 免疫熒光染色
[0189] 將hESC或分化培養物用在roS中的4%多聚甲醛固定。在l%Triton X-100/PBS中 透化30分鐘后，使用以下一抗進行免疫染色：NAN0G(R&D系統公司）、0CT4(艾博抗公司）、 TRA-1-60(圣克魯斯公司）、TRA-1-81 (圣克魯斯公司）、PAX6(科文斯公司（Covance))、GATA4 (圣克魯斯公司）、S0X17(艾博抗公司）、p57kip2(Neomarkers公司）。所使用的二抗是Alexa Fluor 488/546抗小鼠 IgM、Alexa Fluor 488/546抗山羊IgG以及Alexa Fluor488/546抗小 鼠或抗兔IgG(英杰公司）。使用DAPI或赫斯特(Hoechst)(英杰公司）對核進行染色。
[0190] 對免疫染色的細胞進行的流式細胞術分析
[0191]將在3iL培養基或標準培養基中培養的細胞收集并且在80%乙醇中固定過夜。將 細胞在冰上在200yl的0.5%1>1切1^-100?83溶液中裂解10分鐘。在那之后，將細胞在1% BSA中封閉并且在冰上用針對TRA-1-60(圣克魯斯公司）、TRA-1-81 (圣克魯斯公司）、NAN0G (R&D公司）或0CT4(艾博抗公司）的抗體染色2小時。在二抗染色之前和之后，將細胞洗滌三 次。使用單獨的二抗染色作為同種型對照。在BD LSR II流式細胞儀系統上分析細胞。通過 Flowjo vx分析所收集的數據。
[0192] 核型分析
[0193] 將細胞用秋水仙酰胺處理以使得有絲分裂阻滯并且通過標準低滲處理和甲醇：乙 酸(3:1)固定來收集。通過標準空氣干燥法制備載片并且進行G帶核型分析。
[0194] 生物信息學分析
[0195] 使用TopHat2 2.0.9版以參數吒2-非常靈敏將1?熟-5叫讀段定位到人類基因組集 合hgl9,我們還使用來自Ensembl的具有轉錄組注釋的-GTF選項（GRCh37.69)。使用 cuffdiff 2.1.1版估計差異表達。使用cuffdiff檢驗統計量將基因排序以進行基因集富集 分析。使用cuff links 2.1 ? 1版以選項-b、一多讀段_正確、_g、repeatMasker注釋來估計單 個樣品的表達數據，這些選項用于屏蔽rRNA、tRNA、snRNA以及srpRNA基因。將來自植入前人 類胚胎的單細胞RNA-Seq表達數據下載，與3iL和Tesr RNA-Seq數據合并，然后進行分位數 歸一化。將每一個樣品中每一個基因的表達值進一步除以基因表達的總和。使用mul ttest (多重檢驗)包計算圖4B的平均表達的差異，檢驗統計量來自t檢驗，p值是經過多重檢驗校 正的。將圖4C中的基因進一步在基因和樣品的子集上歸一化。為了使特定基因組基因座處 的RNA-Seq數據可視化，通過定位讀段的數目對讀段進行歸一化。
[0196] 使用Bowtie(0.12.5)將ChIP-Seq讀段相對于hgl9參考基因組定位，用MACS (1.4.0)進行峰尋找(peak calling)。峰與最接近的TSS有關。在當前注釋的所有編碼基因 的轉錄起始位點周圍在4kb窗中對讀段進行計數(Ensembl 69版，總數：19，978)。在多個TSS 的情況下，僅選擇具有PolII ChIP-Seq讀段的最大數目的TSS，假定這代表了hESC中對應基 因的主要TSS。使用DESeq2計算組蛋白修飾和轉錄因子占據的對數倍數變化。使用在3iL hESC與hESC之間具有最強倍數變化的前1000個基因座形成ChIP-Seq數據的GSEA曲線圖。在 R中使用標準設置生成箱線圖。使用R3.0版和Bioconductor 2.12版進行所有的生物學信息 分析。
[0197] 登錄號
[0198] RNA-Seq和ChlP-Seq數據可在ArrayExpress數據庫（www .ebi.ac.uk/ arrayexpress)中以登錄號E-MTAB-2031 (RNA-Seq)、E-MTAB-2041(組蛋白修飾）、MTAB-2042 (STAT3)以及E-MTAB-2044 (0CT4、NAN0G、p300、輸入控制）獲得。
[0199] 實施例
[0200] 實施例1
[0201]小分子的組合誘導獨特的hESC狀態
[0202]為了誘導潛在地更接近體內植入前外胚層狀態的替代性hESC狀態，使用靶向8個 信號轉導通路的11種小分子針對提高NAN0G表達的條件進行篩選(圖lAhNANOG在多能外胚 層從植入前胚胎的內細胞團中的內胚層分離中用作確定性標志物。小鼠胚泡中Nanog的水 平在植入期間降低，這表明Nanog水平反映了多能性的不同狀態。與hESC相比，在人類天然 植入前外胚層中，NAN0G的表達也是富集的。首先單獨地研究這些抑制劑的影響。盡管經過 大部分的小分子處理的細胞針對hESC標志物染色呈陽性，但是它們在它們的形態上沒有表 現出變化或沒有誘導NAN0G轉錄物的上調（圖1B-C)。因此，然后使用這些分子的組合（圖 1D)。與使用單獨的分子相反，使用若干種組合進行的處理引起了hESC形態變化和NAN0G的 上調（圖2A、圖1E)。具體來說，組合21、22、23以及24誘導NAN0G轉錄物增加1.5倍-2.0倍。在 這些組合中P0U5F1水平基本上保持不變(圖2A)，這表明這些細胞仍是多能的。
[0203] 隨后，對化學品組合21至24進行研究以確定它們是否可以穩定地維持hESC自我更 新。然而，對于這些條件中的3種觀測到增殖方面的強烈受損，因此在第一次傳代之后有很 少的集落存活。只有經過組合22(PD03/BI0/D0R，在本文被稱為3i)處理的hESC能夠在小鼠 成纖維細胞飼養細胞上形成小的致密的集落（圖2B)。然而，集落數目在每一次后續傳代中 減少，這表明自我更新被破壞（圖2C-D)。由于這些細胞的形態類似于小鼠胚胎干細胞 (mESC)，因此研究促進mESC的自我更新的信號轉導通路的激活是否可以提高細胞存活率。 LIF信號轉導在維持mESC、ICM、以及小鼠多能狀態之間的轉換方面是一個關鍵性的信號轉 導通路。驚人的是，添加 LIF可以解救3i hESC的受損的自我更新并且使得這些細胞能夠穩 定地繁殖多于30代（圖2C-D)。與在TeSRl培養基中培養的hESC(在本文被稱為hESC)相比，這 些經過3i+LIF處理的hESC(在本文被稱為3iL hESC)形成更小并且更致密的集落（圖2E)。與 hESC相反，3iL hESC可以在沒有添加 ROCK抑制劑的情況下以單細胞形式在傳代后繼續存活 (圖2F)。〗種抑制劑的組合使用對于維持3iL hESC狀態來說是重要的，這是因為在從培養基 中去除單個化學品時所述細胞不能被維持（圖1G)。綜上所述，施用3種抑制劑和LIF使與常 規的hESC不同的hESC能夠有效繁殖。
[0204] 實施例2
[0205] 3iL hESC中的活性LIF信號轉導
[0206]與不依賴于LIF信號轉導的常規hESC相反，LIF對于3iL hESC的自我更新來說似乎 是必要的。為了進一步研究LIF在3iL hESC中的作用，使用靶向LIF信號轉導通路的Jak抑制 劑（inh)。用Jak抑制劑處理3iL hESC誘導多能性標志物表達減少以及集落數目強烈減少 (圖3A-BKNAN0G以及LIF信號轉導響應性基因 KLF4和S0CS的基因表達減少（圖3C)。這些結 果進一步表明LIF信號轉導是為維持hESC所需的。
[0207] 在hESC中LIF信號轉導可以被誘導。然而，與3iL hESC相反，LIF對于hESC自我更新 來說不是必要的。為了研究LIF需求上差異的原因，比較這兩種細胞狀態中的LIF信號轉導 活性。在hESC中，與LIF信號轉導通路的其它組分相比，作為對于LIF活性來說必要的共受體 的GP130的轉錄物低表達（圖3D)。將hESC用3i短暫處理以及將hESC在3iL中穩定培養均引起 GP130轉錄物（圖3E-F)和蛋白質水平（圖3G)的上調，這表明這些細胞已經變得對LIF信號轉 導更敏感。相應地，與單獨用LIF培養的hESC相比，在3iL hESC中磷酸化STAT3的水平也顯著 更高（圖3H)，這表明LIF信號轉導在3iL hESC中更具活性。與單獨LIF相比，在經過3i+LIF處 理的hESC中，已知的STAT3靶標S0CS3和KLF4的表達水平也提高（圖31)。有趣的是，NAN0G表 達水平在添加 LIF的情況下在3i處理下以劑量依賴性方式提高，這表明NAN0G可能是LIF信 號轉導的直接靶標（圖4A)。這些結果表明雖然3i處理不能維持hESC自我更新，但是它誘導 了對LIF信號轉導高度響應的hESC狀態。升高的LIF信號轉導對于在3i培養條件下維持多能 細胞狀態來說變得必要。
[0208]隨后，研究在hESC中重要的其它信號轉導通路在3iL hESC中是否也起作用。FGF、 PI3K以及激活素信號轉導通路已經被報道在維持hESC中起重要作用。將3iL hESC用這三個 信號轉導通路以及沒有被報道在hESC中起作用的作為陰性對照的EGF信號轉導的對應的小 分子抑制劑處理。抑制FGF、PI3K以及激活素信號轉導通路在處理10天后使得多能性標志物 喪失（圖4B-C)。這一結果表明仍需要其它信號轉導通路與LIF信號轉導通路結合起作用以 支持獨特的3iL hESC狀態。
[0209] 實施例3
[0210] 3iL hESC表現出多能性的標志
[0211]以下進行表征以確定這些3iL hESC是否確實是多能的。所述細胞針對多能性標志 物0CT4、NAN0G、TRA-1 -60以及TRA-1 -81染色呈陽性（圖5A)。多能性標志物的轉錄水平在3iL hESC與未處理的hESC之間仍是相當的（圖58)。3讓hESC維持2倍較高水平的NAN0G表達（圖 5B)，這也反映在蛋白質水平上（圖5C)。有趣的是，在3iL hESC中觀測到包括DPPA3和TBX3在 內的外胚層特異性基因的上調（圖5B)。熒光激活細胞分選(FACS)分析揭示3iL hESC明確表 達0CT4,并且具有NAN0G、TRA-1-60以及TRA-1-80水平的顯著提高（圖叨）。
[0212]隨后，研究3iL hESC是否可以分化成所有生殖譜系。3iL hESC形成大的類胚體，所 述類胚體可以分化成胚胎外譜系和所有三個胚層的細胞（圖5E)。在體內，3iL hESC在被注 射到免疫缺陷小鼠體內時也產生了所有三個生殖譜系的組織（圖5F)。有趣的是，與hESC相 比，3iL hESC在更短的時間內產生了更大體積的畸胎瘤（圖5G)。重要的是，在3iL條件中培 養2個月后，3iL hESC維持正常的核型（圖5H)。這些結果證實3iL hESC確實是多能的。為了 確認3iL hESC狀態不是HlhESC特有的，在兩種其它人類hESC細胞系hES2和hES3上測試3i+ LIF小分子組合（圖6A-L)。觀測到形態、對標志物表達的誘導以及分化成畸胎瘤中的所有3 個胚層的能力方面的可再現的變化。隨后對3iL條件進行測試以確定它是否能夠維持誘導 性多能干細胞(iPSC)。將細胞在病毒誘導3周后用3iL條件處理。雖然沒有觀測到iPSC集落 總數的增加（圖6M)，但是觀測到這些iPSC集落中病毒沉默的顯著提高（圖6N-0)，這表明真 正的iPSC集落的數目增加。iPSC克隆也可以在3iL條件中被穩定地培養（圖6P-R)。這些數據 確認了 3iL對不同的細胞狀態的誘導是可以在不同的人類多能細胞當中實現的。
[0213] 實施例4
[0214] 3iL hESC的轉錄組類似于天然植入前外胚層
[0215] 上述結果表明3iL hESC不同于hESC。為了對這些差異進行表征，使用RNA-Seq比較 3iL hESC和hESC的轉錄組。首先鑒定出在3iL hESC與hESC之間在表達水平上顯示出顯著變 化的基因，這些基因進一步被稱為3iL hESC特異性基因（在3iL hESC中表達增加)和hESC特 異性基因（在3iL hESC中表達減少）。表1示出了3iL hESC特異性基因的列表。
[0216] 表l:3iL hESC特異性基因。

[0219] 3iL特異性基因中有NANOG、DPPA3、KLF4以及TBX3 (圖7A)，這確認了最初的觀測結 果。為了研究3iL hESC是否類似于體內多能細胞，將3iL hESC表達數據與來自人類植入前 胚胎和源自于胚泡的原代hESC在第0代和第10代時的單細胞RNA-Seq數據相比較。驚人的 是，發現與hESC特異性基因相比，3iL hESC特異性基因在植入前胚泡細胞中顯示出顯著更 高的表達（圖7B)。相比之下，在來自胚泡的原代hESC生長物中，與3iL hESC特異性基因相 比，hESC特異性基因顯示出更高的表達（圖7B)。重要的是，3iL hESC特異性基因和hESC特異 性基因的集合足以基于單細胞RNA-Seq數據將hESC與植入前胚泡細胞相區分（圖7C)。所表 征的胚泡的ICM由多能外胚層(EPI)的細胞和原始內胚層(PE)的細胞組成。由于胚泡的外胚 層細胞受到特別的關注，因此在3iL hESC中評估推定的EPI特異性基因的表達。與在hESC中 相比在EPI細胞中以更高的水平表達的基因（外胚層特異性基因）在3iL hESC中是顯著富集 的（圖7D-E、圖8A-D)。通過定量PCR進一步確認了在3iL hESC中這些外胚層特異性基因的表 達增加（圖7F)。單細胞PCR數據確認了多能性基因和外胚層基因確實是共表達的并且不是 異質細胞群體的結果（圖8E)。因此，3iL處理誘導了 hESC朝向更接近地類似于來自人類植入 前胚胎的多能細胞的細胞狀態轉化。
[0220] 實施例5
[0221] 3iL hESC中GATA6和NAN0G的共表達
[0222] 在胚泡和3iL hESC中表達但是在常規的hESC中不表達的基因之一是GATA6(圖 SFhGATAe已經被報道能夠在重編程期間替代0CT4并且在早期植入前胚胎中表達。由于 GATA6也牽涉到原始內胚層和中胚層分化，因此我們希望排除GATA6表達由自發分化所引起 的可能性。對多能性相關基因的表達進行的檢驗表明這些基因在3iL hESC和hESC中顯示出 相似的表達水平（圖8G)。通過定量PCR進行的驗證也確認了分化相關基因在3iL hESC中沒 有上調（圖8H)。用定量PCR進一步確認3iL hESC中GATA6的表達并且用蛋白質印跡分析進一 步確認蛋白質水平（圖81-JhGATAe和NAN0G的共免疫染色揭示了這2種蛋白質在3iL hESC 中共表達（圖8K)。為了進一步確認這一結果，進行流式細胞術分析并且發現顯著多于50% 的3iL hESC表達NAN0G和GATA6這兩者，相比之下，hESC中少于5 %表達這兩者（圖8L)。GATA6 也與0CT4和TRA-1-60共表達（圖8M-N)。這些結果表明GATA6的表達不是由分化或多能性的 喪失所引起的，而是反映了3iL hESC的特定特性。NAN0G和GATA6在多能外胚層從內胚層分 離之前在胚泡的ICM內的細胞中共表達。所述結果表明3iL hESC潛在地類似于這些共表達 NAN0G和GATA6的細胞。因而，3iL hESC可以提供模型來研究GATA6和其它早期胚胎發育基因 在多能性中的作用。
[0223] 實施例6
[0224] 在3iL hESC中植入前外胚層相關基因的去阻遏
[0225] 為了研究3iL hESC的基因表達譜是否由表觀遺傳全貌中隨之而來的變化而穩定 化，產生與活性染色質(H3K27ac、H3K4me3)和阻遏性染色質(H3K27me3)相關的組蛋白修飾 的全基因組譜。對于每一個基因，計算3iL hESC與hESC之間對應的組蛋白標記的經過歸一 化的倍數變化。實際上，發現基因表達的變化反映在啟動子處組蛋白修飾的整體變化（圖 9A-B)。在3iL hESC中顯示出增加的表達的基因被顯著富集在顯示出活性組蛋白修飾 H3K27ac (p值=8 ? 83e-263)和H3K4me3 (p值=2 ? 38e-69)的增加以及H3K27me3 (p值=4 ? 90e-92)的減少的基因的集合中，所述H3K27me3是通常與發育基因相關的阻遏性標記（圖9B)。驚 人的是，在研究在天然植入前外胚層和體外hESC中差異性表達的基因的啟動子時，發現在 外胚層特異性基因處出現H3K27me3的喪失（圖9C)。因此，在hESC從胚泡衍生期間沉默的基 因，如TBX3、KLF5、ZNF600以及HOXB簇（圖9D、圖10)在3iL hESC中顯示出重新激活。這些數據 共同表明3iL hESC以不同的狀態存在，所述不同的狀態提供了一種獨特的模型以研究植入 前胚胎發生的表觀遺傳學。
[0226] 實施例7
[0227] 3iL hESC中的重新連線的調節回路
[0228]控制多能性的基因調節網絡已經在ESC中被研究并且提供了對胚胎干細胞特征的 調節的基本了解。對基因表達和表觀遺傳修飾進行的這些分析表明3iL hESC代表了 一種與 常規的hESC不同的多能狀態。為了研究在這兩種細胞狀態之間轉錄調節網絡是否發生改 變，產生主多能性調節因子NAN0G和0CT4以及通用增強子結合蛋白P300的全基因組結合圖 譜。對于0CT4、NAN0G以及P300的每一個結合位點，計算3iL hESC與常規的hESC之間的差異 結合以鑒定3iL特異性結合事件和hESC特異性結合事件。驚人的是，發現在這兩種多能狀態 之間數千個結合事件發生變化，這表明調節網絡實際上是重新連線的（圖11A、圖12A、B以及 C)。在支持重新連線的網絡下，發現轉錄因子差異結合與它們的靶基因的差異表達顯著相 關(圖12A)。
[0229]由于3iL hESC顯示出在常規的hESC中沉默的外胚層特異性基因的表觀遺傳和轉 錄重新激活，因此研究3iL hESC是否可以用于鑒定在人類植入前發育中潛在地具有活性的 新型增強子。實際上，發現在遠端增強子處NAN0G占據的增加與外胚層特異性基因的上調顯 著相關（圖12B)(費雪檢驗p值= 5.46e-13,圖12B、C)。在天然植入前外胚層中表達并且在 3iL hESC中顯示出新的或增強的結合位點的基因包括NAN0G、KLF4、DPPA3、KLF5、DMMT3L、 TBX3、ZNF600以及LAMB1 (圖12B、C、圖11B)。有趣的是，在這些基因中的一些附近檢測到 STAT3結合（圖12B、C)，這表明LIF信號轉導潛在地與3iL細胞中的核心多能性網絡整合（圖 12B、C)。
[0230] 在這一研究中，證實用3種小分子進行的組合處理成功地誘導了不同的hESC狀態。 這些3iL hESC需要LIF以自我更新，并且與天然人類胚泡細胞的多能外胚層細胞共有表達 標記。對人類植入前胚胎和hESC進行的單細胞分析已經揭示這兩者之間的顯著性差異。這 一研究的新型3iL hESC狀態縮小了這些體內和體外多能狀態之間的差距（圖120)。3讓 hESC與天然植入前外胚層細胞之間的相似性在破解指定多能性的分子通路方面為未來的 研究提供了平臺。
[0231]已經在多種在化學上確定的條件中，使用包括LIF在內的各種外部信號轉導因子 維持hESC。先前的LIF依賴性hESC與mESC的未處理的狀態顯示出相似性。相比之下，也具LIF 依賴性的3iL hESC與天然植入前外胚層細胞的多能狀態顯示出相似性。在重新連線的回路 中觀測到STAT3結合位點，這表明LIF信號轉導潛在地與核心轉錄網絡配合以促成3iL hESC 表達標記。LIF信號轉導已經被報道增強了體外人類胚泡的形成。然而，LIF信號轉導如何在 胚泡的多能細胞中起作用仍是未知的。因此，剖析LIF在3iL hESC中的作用可以提供對LIF 信號轉導如何促進胚泡發育的更好的了解。
[0232] 3iL hESC的標志之一是在早期人類胚胎發生中表達的一組基因的上調，這些基因 中的一些被認為是用作譜系特異因子。這種因子的實例是GATA6,它在小鼠胚胎和人類胚胎 這兩者的早期I CM中表達。有趣的是，GATA3、GATA4以及GATA6能夠在重編程中替代0CT4，這 表明譜系特異因子在多能性中的作用。盡管GATA6基因座由0CT4、NAN0G以及STAT3結合，但 是GATA6在3iL hESC中的作用仍尚待研究。在3iL hESC中，GATA6可以經由與核心多能性相 關轉錄因子相互作用而成為多能性網絡的組分。可選地，GATA6可以標記將在譜系特異性分 化期間被誘導的基因。3iL hESC因此可能用作典范以了解多能性相關轉錄因子與譜系特異 因子之間的相互作用。
[0233] 盡管證實了 3iL誘導了 hESC中深遠的轉錄和表觀遺傳變化，但是這一轉化的機制 還沒有被完全了解。來自這一研究的數據證實3iL可以誘導GP130表達，這似乎是hESC中的 LIF信號轉導激活的限速因子之一。還可以設想的是，3iL經由調節細胞信號轉導可以通過 形成新的位點而改變多能性相關轉錄因子的結合。實際上，觀測到在3iL hESC中存在許多 新的結合位點，并且這些與表達的變化顯著相關（圖12A-C)。因此，調節網絡響應于用3i和 LIF進行的處理的重新連線似乎參與了細胞狀態轉化。
[0234]由于調芐基因組研究需要對于人類胚胎來說不可獲得的大量細胞，因此3iL hESC 可以用作研究胚泡中多能性的基因調節的系統。利用對染色質標記和轉錄因子結合位點的 ChIP-seq表征，鑒定出在人類胚泡中表達，但是在hESC中被阻遏的基因的許多先前未知的 增強子，從而證實了3iL hESC提供了對在這一研究之前一直難接近的功能的了解。除基因 調節之外，表觀遺傳特性在3iL hESC與hESC之間也不同。舉例來說，觀測到在來自人類植入 前胚胎的細胞中表達的基因的整體去阻遏并且發現諸如DNMT3L的若干種表觀遺傳調節因 子差異性地表達。DNMT3L調節DNA甲基化，所述DNA甲基化是早期胚胎發育期間的關鍵過程 之一。3iL hESC可以用作模型系統來研究這些表觀遺傳通路以及它們在調節多能性中的作 用。
[0235] 總之，發現用3iL處理hESC誘導了在表觀遺傳學上、在轉錄上以及在形態學上與常 規的hESC不同的多能狀態。證實了3iL hESC中重新連線的調節回路支持了天然植入前外胚 層樣表達標記。3iL hESC的更天然的狀態提供了新的機會。因此，對3iL hESC的研究增加了 修正和擴展我們對人類細胞的多能性的了解的許多可能性。
[0236] 實施例8
[0237] 誘導3iL hESC中的發育基因增強了3iL hESC分化
[0238] 在3iL hESC中觀測到胚胎外譜系特異因子CDX2、GATA4和GATA6以及中內胚層標志 物T和MIXL的強烈上調（圖13A和13B)。同時，多能性相關基因在3iL hESC和hESC中顯示出相 似的表達水平（圖8G)，這表明這不是由分化或多能性的喪失所引起，而是反映了3iL hESC 的特定特性。
[0239] 盡管發育基因的表達增加，但仍維持了多能狀態是驚人的。如下進行研究以確定 這些發育基因的表達是否可以在生物學上引發細胞分化。為了測試這一假設，使用兩種內 胚層分化方案將3iL hESC的內胚層分化效率與hESC相比較。在第一種方案中，使用小分子 抑制劑IDE-1和激活素 A使hESC分化。與從hESC分化的細胞相比，在使用3iL hESC時，觀測到 更多的針對內胚層標志物S0X17和F0XA2染色呈陽性的細胞（圖13C)。相應地，在從3iL hESC 分化的細胞中存在內胚層基因 S0X17、F0XA2、HNF4A以及CXCR4的更強上調（圖13D)。使用第 二種分化方案，在從3iL hESC和hESC分化的大部分的細胞中觀測到對內胚層祖細胞標志物 SOX 17表達的強烈誘導（圖13E)。然而，在使用3iL hESC時，更多的細胞針對內胚層祖細胞標 志物F0XA2染色呈陽性（圖13E)。在從3iL hESC分化的細胞中還存在內胚層基因 HNF4A和 CXCR4的更強上調（圖13F)。因此，3 iL hESC似乎更容易朝向內胚層譜系分化。
【主權項】
1. 一種用于培養和維持處于未分化狀態的多能干細胞的方法，所述方法包括將所述多 能干細胞培養在包含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、AMPK和/或BMP信號轉導的雙重抑制劑以及 LIF的培養基中。2. 如權利要求1所述的方法，其中所述培養基是條件培養基。3. 如權利要求1所述的方法，其中所述培養基包含飼養細胞。4. 如權利要求1所述的方法，其中所述培養基不含飼養細胞。5. 如權利要求1所述的方法，其中將所述多能干細胞培養在基質上。6. 如權利要求5所述的方法，其中所述基質是基底膜基質。7. 如權利要求5所述的方法，其中所述基質是包含以下各項中的一種或多種的細胞外 基質：層粘連蛋白、膠原、明膠、纖維連接蛋白、蛋白多糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素、或合成生 物聚合物。8. 如權利要求1所述的方法，其中所述多能干細胞是胚胎干細胞。9. 如權利要求8所述的方法，其中所述胚胎干細胞是人類的。10. 如權利要求1所述的方法，所述方法進一步包括將所述處于未分化狀態的多能干細 胞傳代。11. 如權利要求1至10中任一項所述的方法，其中所述MEK抑制劑處在0.5μΜ-1μΜ的濃 度。12. 如權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述GSK3抑制劑處在1μΜ-2μΜ的濃度。13. 如權利要求1至12中任一項所述的方法，其中所述ΑΜΡΚ和/或ΒΜΡ信號轉導的雙重抑 制劑處在2μΜ的濃度。14. 如權利要求1至13中任一項所述的方法，其中所述LIF處在8ng/ml-10ng/ml的濃度。15. -種多能干細胞，所述多能干細胞是通過權利要求1至14中任一項所述的方法產生 的。16. 如權利要求15所述的多能干細胞，其中所述細胞表達至少一種選自由以下各項組 成的組的多能性標志物:NANOG、TRA-1 -60、0CT4以及TRA-1 -81。17. 如權利要求15所述的多能干細胞，其中所述細胞表達至少一種選自由以下各項組 成的組的外胚層樣基因表達標志物:DPPA3、KLF4、KLF5、以及TBX3。18. 如權利要求15所述的多能干細胞，其中所述細胞表達至少一種選自由以下各項組 成的組的胚胎外標志物:CDX2、BMP4、GATA4以及GATA6。19. 如權利要求15所述的多能干細胞，其中所述細胞表達至少一種選自T或MIXL1的中 內胚層標志物。20. 如權利要求15至19中任一項所述的多能干細胞，其中相對于沒有根據權利要求1至 14中任一項所述的方法培養的細胞，至少一種標志物的表達水平增加。21. 如權利要求20所述的多能干細胞，其中所述至少一種標志物的表達水平是通過 RNA-seq或實時PCR確定的。22. 如權利要求20至21中任一項所述的多能干細胞，其中相對于沒有根據權利要求1至 14中任一項所述的方法培養的細胞，所述至少一種標志物的表達水平增加至少1.5倍至5 倍。23. 如權利要求20至22中任一項所述的多能干細胞，其中所述至少一種標志物是NANOG 并且相對于沒有根據權利要求1至14中任一項所述的方法培養的細胞，所述表達水平增加 1.5倍至2倍。24. 如權利要求15至19所述的多能干細胞，其中相對于沒有根據權利要求1至14中任一 項所述的方法培養的細胞的分化，所述細胞向內胚層細胞、神經元細胞或中胚層細胞的分 化增強。25. -種用于培養和維持處于未分化狀態的多能干細胞的培養基，其中所述培養基包 含MEK抑制劑、GSK3抑制劑、AMPK和/或BMP信號轉導的雙重抑制劑以及LIF。26. -種用于由多能干細胞產生譜系特異性細胞的方法，所述方法包括： a) 根據權利要求1至14中任一項所述的方法培養處于未分化狀態的多能干細胞； b) 分離所述未分化的多能干細胞；以及 c) 將分離的所述未分化的多能干細胞培養在適合于使所述分離的多能干細胞分化成 譜系特異性細胞的培養基中。27. 如權利要求26所述的方法，其中所述譜系特異性細胞是體細胞或細胞器。28. 如權利要求27所述的方法，其中所述譜系特異性細胞是內胚層譜系細胞。29. 如權利要求27所述的方法，其中所述體細胞是能夠自我更新或分化成一個或幾個 體細胞譜系的定向祖細胞，或完全成熟的體細胞分化的細胞。30. -種試劑盒，所述試劑盒在用于權利要求1至14中任一項所述的方法中時用于培養 和維持處于未分化狀態的多能干細胞，所述試劑盒包括根據權利要求24所述的培養基和使 用說明書。
【文檔編號】C12N5/0735GK105849252SQ201480070956
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年10月27日
【發明人】曾永昇, 黃學暉
【申請人】新加坡科技研究局