神經調節蛋白變構抗her3抗體的制作方法

神經調節蛋白變構抗her3抗體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及神經調節蛋白(NRG)?非競爭性變構抗人HER3抗體及其在診斷和治療方法中的用途。
【專利說明】
神經調節蛋白變構抗HER3抗體
技術領域
[00011本發明涉及神經調節蛋白（NRG)-非競爭性變構抗人HER3抗體及其在診斷和治療 方法中的用途。
[0002] 發明背景
[0003] 受體酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生長因子受體ErbB/HER家族包括四個成員：EGFR (ErbB 1 /HER 1)、HER2 (c-Neu，HER2)、HER3 (HER3)和HER4 (HER4)。HER受體包含由四個結構域 (標記為1至4)組成的胞外糖基化結構域、隨后是跨膜結構域和用于偶聯至信號轉導途徑的 含有激酶結構域的胞內C-末端部分。除了 HER3,該胞內區域含有酪氨酸激酶活性。信號轉導 通過通過配體誘導的受體二聚化和隨后的導致細胞質信號轉導途徑活化的磷酸化介導。 HER2沒有特異性配體，因為它天然處于"活性"構象。其它HER受體作為無活性單體存在，其 中分子以阻止二聚化的方式折疊。結合至結構域1和3的配體誘導主要構象變化，最終暴露 所述受體的結構域2中的二聚化環。二聚化環的這種暴露允許受體二聚化。
[0004] 首次在1990年描述的HER3受體是僅有的缺乏內在激酶活性的HER家族成員受體， 并且下游信號轉導通過異源二聚化實現。因此，作為單體的HER3受體被稱為"非自身的 (non-self)"并且不能形成同二聚體。配體神經調節蛋白（NRG)與HER3受體的結合觸發HER3 與其它HER家族受體(HER2優先）的異源二聚化。在該異源二聚體內，HER3激酶結構域充當其 ffiR家族伴侶的變構活化劑。
[0005] HER3涉及各種癌癥包括乳腺癌和卵巢癌的腫瘤形成（Lee-Hoeflich ST，Cancer Res.2008；McIntyre E,Breast Cancer Res Treat.2010；Tanner B,J Clin Oncol.2006)〇 HER3表達與腫瘤進展和惡性黑色素瘤和轉移中的患者存活減少相關，并且與卵巢癌中的存 活降低相關。重要地，在乳腺癌中，具有低J1ER2表達的腫瘤，其不適于赫賽汀(Herceptin)治 療，經常被"程序化"以強烈表達HER3(Smi th等Br. J. Cancer 2004)，以及HER2+++腫瘤，其在 長期治療后變得對赫賽汀耐藥，被"再程序化"以強烈表達HER3(Narayan，Cancer Res ? 2009)。西妥昔單抗（Cetuximab)抗性也與肺癌(Wheeler，Oncogene 2008)和結腸直腸 癌（Lu Cancer Res 2007)中的HER3過表達，以及EGFR內化/降解的失調相關。最近，HER3過 表達與結腸直腸癌中的更差的無轉移存活相關(Ho-Pun-Cheung, Int J Cancer 2010)。因 此，HER3過表達和通過PI3K/AKT途徑活化的補償性信號轉導涉及對用HER-靶向療法(抗體 和TKI) (Wheeeler 2008，Lu 2007，Narayan，2009，Sergina，2007)而且對用IGFR-靶向療法 (Desbois-Mouthon,Clin Cancer Res 2009)和用化療劑（Kruser,Exp Cell Res 2010)的 治療耐藥的發展中。
[0006] 所有這些發現表明，HER3-靶向劑，并且尤其是抗體，可有助于進一步理解HER3信 號轉導在癌癥中的作用并且特別是用作有效的免疫治療劑。
[0007] 目前，沒有治療性抗HER3抗體銷售，盡管特定文獻強烈強調靶向HER3在治療腫瘤 學中的意義。兩種人抗體目前處于Merrimack Pharmaceuticals/Sanofi Aventis(MM_121 抗體；PCT W02008/100624)和U3PharmaAG/Daiichi Sankyo/Amgen(U3-1287或AMG-888;PCT TO2007/077028)的開發中。MM-121抗體參與在NSCLC的I期臨床試驗和ER+PR+HER2-乳腺癌 中的I/II期試驗。U3-1287抗體與厄洛替尼（Erlotinib)聯合處于NSCLC中的I期中。一種 已0卩1?/冊1?3雙特異性抗體]\^皿79454(661161^6(^;?0'102010/108127)仍然處于研究開發 中。一種HER2/HER3雙特異性抗體MM-111 (Merrimack Pharmaceuticals ;PCT W02005/ 117973，102006/091209)在冊1?2-擴增的乳腺癌中，單獨或與曲妥珠單抗或拉帕替尼組合， 參與I/II期臨床試驗。
[0008] 所有以上提及的抗體阻斷HER3受體的調蛋白-結合位點，由此減少對嗜配體腫瘤 (1 igand-addicted tumors)的這些抗體療法。用不針對HER3受體的調蛋白-結合位點的抗 體靶向HER3應使得可能在耐藥性HER2-擴增乳腺癌中繞過對靶向療法或化療的耐藥性，拓 寬靶向療法對HER2低乳腺癌(其目前不適于這種治療）的應用領域，或者治療三陰性乳腺癌 (其表達HER3并且還沒有可用的靶向療法）。
[0009] 發明概述
[0010] 本發明涉及神經調節蛋白（NRG)-非競爭性變構抗人HER3抗體及其在診斷和治療 方法中的用途。
[0011] 發明詳述
[0012]本發明人已經表征鼠抗人HER3抗體，命名為9F7-F11，其在配體神經調節蛋白存在 的情況下對ffiR3陽性細胞具有獨特的特異性。具體而言，本發明人已經表明當神經調節蛋 白存在時，9F7-F11/HER3親和力不受抑制(9F7-F11抗體是神經調節蛋白非競爭性的），但是 此外，當神經調節蛋白存在于HER3陽性細胞的環境中時，9F7-F11/HER3親和力被變構增加 (9F7-F11是變構抗HER3抗體KNRG-非競爭性變構抗體9F7-F11抑制MAPK、AKT和p53途徑，在 G1期中阻斷細胞周期，抑制細胞增殖，并恢復腫瘤細胞的凋亡。這種獨特抗體9F7-F11降低 嗜NRG胰腺癌和HER2-擴增或三陰性乳腺癌的腫瘤生長，并且與HER2組合曲妥珠單抗/帕妥 珠單抗或單獨使用的J1ER2抗體相比，與HER-2特異性抗體帕妥珠單抗組合時更有效。
[0013]與缺乏變構效應的配體競爭性抗體或配體非競爭性抗體(其靶向更受限的HER3活 化的機制)相比，治療性抗體9F7-F11將在廣譜腫瘤中具有臨床效用。由于其變構效應，當神 經調節蛋白由腫瘤分泌（自分泌)或由微環境分泌(旁分泌)時，NRG-非競爭性抗體9F7-F11 將比其它抗體對配體依賴性腫瘤更有效。由于其變構效應，當由神經調節蛋白的上調介導 的耐藥性發生（即，結腸直腸癌中的西妥昔單抗耐藥性)時，抗體9F7-F11會更有效。由于其 變構效應，當受體在配體活化之后異源二聚化時，9F7-F11結合可能得到改進。綜上，NRG-非 競爭性變構抗人HER3抗體9F7-F11可以用于治療其中現有治療性抗體在臨床上無效的病 癥。
[0014]總之，本發明的抗體相比于現有技術中描述的抗HER3抗體提供以下優點：
[0015] -它們是變構抗體
[0016] -它們是神經調節蛋白非競爭性的
[0017] -它們提供更廣譜的作用(配體非依賴性和配體依賴性癌癥）
[0018] -它們對自分泌或旁分泌配體依賴性腫瘤更有效（由于其變構效應）
[0019] -當HER3配體的上調介導的耐藥性(例如:對抗體或TKI、對化療劑、對抗激素劑的 耐藥性)發生時，它們更有效。
[0020] -它們可用于治療其中現有的治療性抗體在臨床上無效的病癥，諸如三陰性乳腺 癌、胰腺癌、其它生態位(例如:腎細胞癌）
[0021]定義:
[0022] 神經調節蛋白"具有其在本領域中的一般含義，且經常與術語"調蛋白"互換 使用。調蛋白家族包括a、0和y調蛋白（Holmes等，Science,256:1205-1210(1992);美國專 利號5，641，869;和Schaefer等Oncogene 15:1385-1394( 1997)) ;neu分化因子（NDFs)、神經 膠質生長因子（GGFs);乙酰膽堿受體誘導活性（ARIA);和感覺和運動神經元衍生因子 (SMDF)。對于綜述，參見Groenen等Growth Factors 11: 235_257( 1994) ;Lemke，G.Molec ?& Cell.Neurosci.7:247-262(1996)and Lee etal.Pharm.Rev.47:51-85(1995)；Falls and D ? (2003) ? ''Neuregulins: functions，forms，and signaling strategies ? ''Experimental Cell Research 284(1):14-30。
[0023]術語 "HER3" 是指如Plowman等，Proc ? Natl ? Acad ? Sci ? USA，87 :4905-4909(1990); 還參見Kani等，Biochemistry 44:15842-857(2005)，Cho and Leahy,Science 297:1330-1333 (2002))中描述的人HER3受體。HER3也稱為"HER3"。
[0024]術語"抗人HER3抗體"是指針對人HER3的抗體。
[0025]根據本發明，"抗體"或"免疫球蛋白"具有相同的意義，并且在本發明中等同地使 用。如本文所使用，術語"抗體"是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，BP 含有免疫特異性結合抗原的抗原結合位點的分子。因此，術語抗體不僅涵蓋完整抗體分子， 而且涵蓋抗體片段以及抗體和抗體片段的變體(包括衍生物）。在天然抗體中，兩條重鏈通 過二硫鍵彼此連接，并且每條重鏈通過二硫鍵與輕鏈連接。存在兩種類型的輕鏈，Ml)和k (k)。存在五種主要的重鏈類型(或同種型），其決定抗體分子的功能活性:IgM，IgD，IgG，IgA 和IgE。每條鏈含有獨特的序列結構域。輕鏈包括兩個結構域，可變結構域(VL)和恒定結構 域(CL)。重鏈包括四個結構域，可變結構域(VH)和三個恒定結構域(CHI、CH2和CH3，統稱為 CH)。輕鏈(VL)和重鏈(VH)兩者的可變區決定對抗原的結合識別和特異性。輕鏈(CL)和重鏈 (CH)的恒定區結構域賦予重要的生物學性質，諸如抗體鏈締合、分泌、跨胎盤移動性、補體 結合和結合Fc受體(FcRhFv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-端部分，并且由一條輕鏈和 一條重鏈的可變部分構成。抗體的特異性在于抗體結合位點與抗原決定簇之間的結構互補 性。抗體結合位點由主要來自高變區或互補決定區（CDR)的殘基構成。有時，來自非高變區 或框架區(FR)的殘基影響總體結構域結構，并因此影響結合位點。互補決定區或CDR是指一 起限定天然免疫球蛋白結合位點的天然Fv區的結合親和力和特異性的氨基酸序列。免疫球 蛋白的輕鏈和重鏈各自具有三個CDR，分別命名為L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和11-〇)1?1、11-⑶R2、H-CDR3。因此，抗原結合位點包括六個⑶R，包含來自重鏈和輕鏈V區域各自的⑶R集 合。框架區(FR)是指插在CDR之間的氨基酸序列。
[0026]術語"嵌合抗體"是指包含源自9F7-F11抗體的抗體的VH結構域和VL結構域以及人 抗體的CH結構域和CL結構域的抗體。
[0027]根據本發明，術語"人源化抗體"是指具有來自人抗體的可變區框架和恒定區、但 保留9F7-F11抗體的⑶R的抗體。
[0028]術語"Fab"表示具有約50，000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其中在通過 用蛋白酶(木瓜蛋白酶)處理IgG而獲得的片段間，H鏈的N-端側的約一半與整個L鏈通過二 硫鍵結合在一起。
[0029]術語"F(ab'）2"是指具有約100,000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，在通過 用蛋白酶（胃蛋白酶)處理IgG而獲得的片段間，其略大于通過鉸鏈區的二硫鍵結合的Fab。
[0030]術語"Fab"'是指具有約50,000的分子量和抗原結合活性的抗體片段，其通過切割 F(ab '）2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得。
[0031 ]單鏈Fv( "scFv"）多肽是共價連接的VH: : VL異二聚體，其通常從包括通過肽編碼接 頭連接的VH和VL編碼基因的基因融合體表達。"dsFv"是通過二硫鍵穩定化的VH: :VL異二聚 體。二價和多價抗體片段可以通過單價scFv的締合自發形成，或者可以通過用肽接頭偶聯 單價scFv來生成，諸如二價sc(Fv)2。
[0032] 術語"雙特異抗體"是指具有兩個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含與同 一多肽鏈中的輕鏈可變結構域(VL)相連的重鏈可變結構域(VH) (VH-VL)。通過使用太短而 不允許同一鏈上的兩個結構域之間配對的接頭，迫使結構域與另一條鏈的互補結構域配 對，并產生兩個抗原結合位點。
[0033] "純化的"或"分離的"當涉及本發明的抗體或涉及核苷酸序列時，意指所示分子在 基本上不存在相同類型的其它生物大分子的情況下存在。如本文所使用，術語"純化的"優 選地意指存在至少75重量％、更優選地至少85重量％、更優選地至少95重量％、最優選地至 少98重量％的相同類型的生物大分子。編碼特定多肽的"分離的"核酸分子是指基本上不含 不編碼所述多肽的其它核酸分子的核酸分子;然而，所述分子可以包括不有害影響組合物 的基本特征的一些另外的堿基或部分。
[0034] 本發明的抗體:
[0035]本發明提供分離的神經調節蛋白（NRG)-非競爭性變構抗HER3抗體或其片段。具體 而言，本發明人已經提出了產生鼠抗J1ER3抗體(9F7-F11)的雜交瘤。本發明人已經克隆并表 征了所述mAb 9F7-F11的輕鏈和重鏈的可變結構域，并因此確定了所述抗體的互補決定區 (CDR)結構域，如表1中所述：
[0037]
[0038] 表1 :mAb 9F7-F11的VH、VL和CDR的氨基酸序列
[0039]因此，本發明涉及對HER3具有特異性的單克隆抗體，其包含重鏈，其中可變結構域 包含具有選自H-CDR1 的SEQ ID N0:2、H-CDR2的SEQ ID N0:3和H-CDR3的SEQ ID N0:4的序 列的至少一個⑶R。
[0040]本發明還涉及對HER3具有特異性的單克隆抗體，其包含輕鏈，其中可變結構域包 含具有選自1-〇)1?1的5￡0 10勵：6、1-001?2的5￡0 10勵：7和1-〇)1?3的5￡0 10腸：8的序列 的至少一個⑶R。
[0041 ]本發明的單克隆抗體可以包含重鏈，其中可變結構域包含具有選自H-⑶R1的SEQ ID N0:2、H-CDR2的SEQ ID N0:3和H-CDR3的SEQ ID N0:4的序列的至少一個CDR，以及輕鏈， 其中可變結構域包含具有選自L-CDR1的SEQ ID N0:6、L-CDR2的SEQ ID N0:7和L-CDR3的 SEQ ID NO:8的序列的至少一個CDR。
[0042]具體而言，本發明提供抗HER3單克隆抗體，所述抗體包含:重鏈可變區，其包含H-0)1?1區中的5￡〇10勵:2、11-〇)1?2區中的5￡〇10勵:3和11-〇)1?3區中的5￡〇10勵:4 ;以及輕 鏈可變區，其包含L-CDR1區中的SEQ ID N0:6、L-CDR2區中的SEQ ID N0:7和L-CDR3區中的 SEQ ID N0:8。
[0043]在一種特定實施方式中，所述抗體的重鏈可變區具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基 酸序列，和/或輕鏈可變區具有如SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列。
[0044] 在另一種實施方式中，本發明的單克隆抗體是嵌合抗體，優選地是嵌合小鼠/人抗 體。具體而言，所述小鼠/人嵌合抗體可以包含如上定義的9F7-F11抗體的可變結構域。
[0045] 在另一種實施方式中，本發明的單克隆抗體是人源化抗體。具體而言，在所述人源 化抗體中，可變結構域包含人受體框架區和任選的人恒定結構域(在存在的情況下），以及 非人供體CDR，諸如如上面定義的小鼠 CDR。
[0046]本發明進一步提供所述抗體的直接針對HER3的抗HER3片段，其包括但不限于Fv、 Fab、F(ab'）2、Fab'、(18卩￥、8〇卩￥、8(：(卩￥)2和雙特異抗體。
[0047]另一方面，本發明涉及具有選自 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8的序列的多肽。
[0048] 產生本發明的抗體的方法:
[0049]本發明的抗人HER3抗體可以通過本領域中已知的任何技術來產生，所述技術諸如 但不限于單獨或組合的任何化學、生物學、遺傳學或酶學技術。
[0050] 知道所需序列的氨基酸序列，本領域技術人員可以通過用于產生多肽的標準技術 容易地產生所述抗體。例如，可以使用眾所周知的固相方法，優選地使用可商購的肽合成裝 置(諸如由Applied Biosystems，Foster City，California制造的裝置)并遵循制造商的說 明書來合成它們。或者，本發明的抗體可以通過本領域眾所周知的重組DNA技術來合成。例 如，可以在將編碼抗體的DNA序列并入表達載體中并將這種載體引入表達所需抗體的合適 的真核或原核宿主中之后，作為DNA表達產物來獲得抗體，隨后可以使用眾所周知的技術從 所述宿主分離抗體。
[0051] 因此，本發明的一個進一步目的涉及編碼本發明的抗體的核酸序列。
[0052]在一種特定實施方式中，本發明涉及編碼可獲得自雜交瘤9F7-F11的抗體的VH結 構域或可獲得自雜交瘤9F7-F11的抗體的VL結構域的核酸序列。
[0053]在一種特定實施方式中，本發明涉及包含序列SEQ ID N0:9的核酸序列。
[0054]在一種特定實施方式中，本發明涉及包含序列SEQ ID N0:10的核酸序列。
[0056] 表2:本發明的mAb 9F7-F11的VH和VL結構域的核酸
[0057]通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包括于任何合適的載體諸如質粒、黏粒、 附加體、人工染色體、噬菌體或病毒載體中。
[0058] 術語"載體"、"克隆載體"和"表達載體"是指可以借以將DNA或RNA序列（例如外來 基因）引入宿主細胞中以便轉化宿主并促進引入序列的表達(例如轉錄和翻譯)的媒介物。
[0059] 因此，本發明的一個進一步目的涉及包含本發明的核酸的載體。
[0060] 這種載體可以包含調控元件諸如啟動子、增強子、終止子等，以在施用于受試者后 引起或指導所述抗體的表達。在用于動物細胞的表達載體中使用的啟動子和增強子的實例 包括SV40的早期啟動子和增強子(Mizukami T.等1987)1〇1〇1^7小鼠白血病病毒的1^1?啟 動子和增強子(Kuwana Y等1987)、免疫球蛋白H鏈的啟動子(Mason J0等1985)和增強子 (Gillies SD等 1983)等。
[0061] 可以使用用于動物細胞的任何表達載體，只要可以插入并表達編碼人抗體C區域 的基因。合適的載體的實例包括pAGE107(Miyaji H等1990)、pAGE103(Mizukami T等1987)、 pHSG274(Brady G等1984)、pKCR(0'Hare K等1981)、pSGlbeta d2-4-(Miyaji H等1990)等。 質粒的其它實例包括包含復制起點的復制型質粒或整合型質粒，諸如例如pUC、pcDNA、pBR 等。病毒載體的其它實例包括腺病毒、反轉錄病毒、皰疹病毒和AAV載體。這種重組病毒可以 通過本領域已知的技術來生產，所述技術諸如通過轉染包裝細胞或通過用輔助質粒或病毒 瞬時轉染。病毒包裝細胞的典型實例包括PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv+細胞、293細胞 等。產生這種復制缺陷型重組病毒的詳細方案可以在例如WO 95/14785、W0 96/22378、US 5,882,877、US 6,013,516、US 4,861，719、US 5,278,056和WO 94/19478中找到。
[0062] 本發明的一個進一步目的涉及已經用本發明的核酸和/或載體轉染、感染或轉化 的宿主細胞。
[0063] 術語"轉化"意指將"外來"（即外部或細胞外的）基因、DNA或RNA序列引入宿主細胞 中，以便宿主細胞將表達引入的基因或序列以產生所需物質，通常為引入的基因或序列編 碼的蛋白或酶。接受并表達引入的DNA或RNA的宿主細胞已經被"轉化"。
[0064] 本發明的核酸可用于在合適的表達系統中產生本發明的抗體。術語"表達系統"意 指在合適條件下的宿主細胞和相容載體，例如用于由載體攜帶并引入宿主細胞的外來DNA 編碼的蛋白的表達。
[0065] 常用表達系統包括大腸桿菌宿主細胞和質粒載體，昆蟲宿主細胞和桿狀病毒載 體，以及哺乳動物宿主細胞和載體。宿主細胞的其它實例包括但不限于原核細胞(諸如細 菌)和真核細胞(諸如酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞等）。具體實例包括大腸 桿菌、克魯維酵母屬或酵母屬酵母、哺乳動物細胞系(例如Vero細胞、CH0細胞、3T3細胞、C0S 細胞等）以及原代或建立的哺乳動物細胞培養物(例如由成淋巴細胞、成纖維細胞、胚胎細 胞、上皮細胞、神經細胞、脂肪細胞等產生）。實例還包括小鼠SP2/0-Agl4細胞（ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、二氫葉酸還原酶基因（在下文中稱為 "DHFR基因"）缺陷的CH0細胞(Urlaub G等，1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(ATCC CRL1662，在下文中稱為"YB2/0細胞"）等。
[0066] 本發明還涉及產生表達本發明的抗體的重組宿主細胞的方法，所述方法包括下列 步驟：（i)在體外或離體將上述重組核酸或載體引入感受態宿主細胞中，（ii)在體外或離體 培養獲得的重組宿主細胞，以及（iii)任選地，選擇表達和/或分泌所述抗體的細胞。這種重 組宿主細胞可用于產生本發明的抗體。
[0067] 在另一種特定實施方式中，該方法包括下列步驟：
[0068] (i)在適合于允許16D3-C1抗體表達的條件下培養雜交瘤9F7-F11;和
[0069] (ii)回收表達的抗體。
[0070]通過常規免疫球蛋白純化程序，諸如例如蛋白A-瓊脂糖、羥基磷灰石層析、凝膠電 泳、透析或親和層析，合適地從培養基分離本發明的抗體。
[0071] 在一種特定實施方式中，本發明的人嵌合抗體可以通過如下產生:獲得如前所述 編碼VL和VH結構域的核酸序列，通過將它們插入具有編碼人抗體CH和人抗體CL的基因的用 于動物細胞的表達載體中來構建人嵌合抗體表達載體，并通過將所述表達載體引入動物細 胞中來表達所述編碼序列。
[0072] 作為人嵌合抗體的CH結構域，它可以是屬于人免疫球蛋白的任何區域，但IgG類的 區域是合適的，并且也可以使用屬于IgG類的任一亞類，諸如IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。此外， 作為人嵌合抗體的CL，它可以是屬于Ig的任何區域，并且可以使用k類或A類的區域。
[0073] 用于產生嵌合抗體的方法涉及本領域中眾所周知的常規重組DNA和基因轉染技術 (參見Morrison SL?等，（1984)和專利文獻US5，202，238;和US5，204，244)。
[0074] 本發明的人源化抗體可以通過如下產生:獲得如前所述的編碼CDR結構域的核酸 序列，通過將它們插入具有編碼（i)與人抗體的重鏈恒定區相同的重鏈恒定區和（ii)與人 抗體的輕鏈恒定區相同的輕鏈恒定區的基因的用于動物細胞的表達載體中構建人源化抗 體表達載體，并通過將所述表達載體引入動物細胞中來表達所述基因。
[0075] 人源化抗體表達載體可以是其中編碼抗體重鏈的基因和編碼抗體輕鏈的基因存 在于單獨的載體上的類型，或者是兩個基因存在于同一載體上的類型（串聯類型）。就構建 人源化抗體表達載體的簡易性、引入動物細胞的簡易性以及抗體H和L鏈在動物細胞中的表 達水平之間的平衡而言，串聯類型的人源化抗體表達載體是優選的（Shitara K等，1994)。 串聯類型的人源化抗體表達載體的實例包括pKANTEX93(W097/10354)、pEE18等。
[0076]基于常規的重組DNA和基因轉染技術產生人源化抗體的方法在本領域中是眾所周 知的（參見例如Riechmann L?等，1988 ;Neuberger MS?等，1985)。抗體可以使用本領域中已 知的各種技術進行人源化，所述技術包括例如CDR-接枝（EP239,400;PCT公開號W091/ 09967;美國專利號5,225，539、5,530,101 和5,585,089)、鑲飾或表面重修(EP 592,106; EP519,596;Padlan EA(1991);Studnicka GM 等，（1994);Roguska MA?等，（1994))和鏈改組 (美國專利號5,565,332)。用于制備這種抗體的通用重組0嫩技術也是已知的（參見歐洲專 利申請EP125023和國際專利申請W096/02576)。
[0077]本發明的Fab可以通過用蛋白酶(木瓜蛋白酶)處理與人HER3特異性反應的抗體來 獲得。此外，也可以通過將編碼抗體的Fab的DNA插入用于原核表達系統或用于真核表達系 統的載體中，并將載體引入原核生物或真核生物中（適當時）以表達Fab來產生Fab。
[0078]本發明的F (ab '）2可以通過用蛋白酶（胃蛋白酶)處理與人HER3特異性反應的抗體 來獲得。此外，也可以通過將如下所述的Fab '經由硫醚鍵或二硫鍵結合來產生F( ab '）2。 [0079] 本發明的Fab '可以通過用還原劑（二硫蘇糖醇）處理與人HER3特異性反應的F (ab'）2來獲得。此外，也可以通過將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入用于原核生物的表達載 體或用于真核生物的表達載體中，并將載體引入原核生物或真核生物中（適當時）以進行其 表達來產生Fab'。
[0080] 本發明的s cF V可以通過如下生產：獲得編碼如前所述的VH和VL結構域的cDNA，構 建編碼scFv的DNA，將所述DNA插入用于原核生物的表達載體或用于真核生物的表達載體 中，并然后將所述表達載體引入原核生物或真核生物中（適當時）以表達scFv。為了生成人 源化的scFv片段，可以使用眾所周知的被稱為CDR接枝的技術，所述技術涉及從供體scFv片 段選擇互補決定區（CDR)，并將它們接枝至三維結構已知的人scFv片段框架上（參見例如 W098/45322、W087/02671、US5，859，205、US5，585，089、US4，816，567、EP0173494)。
[0081] 預期本文描述的抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能希望改進抗體的結合親和力 和/或其它生物學性質。已知當僅僅通過簡單地將源自非人動物的抗體的VH和VL中的CDR接 枝于人抗體的VH和VL的FR中來產生人源化抗體時，抗原結合活性與源自非人動物的原始抗 體的抗原結合活性相比降低。考慮到非人抗體的VH和VL的幾個氨基酸殘基(不僅在CDR中， 而且在FR中）與抗原結合活性直接或間接相關。因此，用源自人抗體的VH和VL的FR的不同氨 基酸殘基置換這些氨基酸殘基將降低結合活性。為了解決這一問題，在用人CDR接枝的抗體 中，必須嘗試在人抗體的VH和VL的FR的氨基酸序列間鑒定與結合至抗體直接相關、或者與 CDR的氨基酸殘基相互作用、或者維持抗體的三維結構并且與抗原結合直接相關的氨基酸 殘基。通過用源自非人動物的原始抗體的氨基酸殘基替換鑒定的氨基酸可以提高所述降低 的抗原結合活性。
[0082] 修飾和改變可以在本發明抗體的結構中以及在編碼它們的DNA序列中進行，并且 仍獲得編碼具有所需特性的抗體的功能分子。
[0083]在氨基酸序列中進行改變時，可以考慮氨基酸的親水性指數（hydropathic index)。氨基酸親水性指數在賦予蛋白相互活性生物功能中的重要性在本領域中是廣泛理 解的。公認的是氨基酸的相對親水性特征對所得蛋白的二級結構有貢獻，其進而定義所述 蛋白與其它分子例如酶、底物、受體、DNA、抗體、抗原等的相互作用。在其疏水性和電荷特征 的基礎上為每種氨基酸指定了親水性指數，這些是:異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2);亮氨 酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸( + 1.8);甘 氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6); 組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸 (-3.9);和精氨酸(-4.5)。
[0084] 本發明的一個進一步目的還涵蓋本發明的抗體的功能保守性變體。
[0085] "功能保守性變體"是蛋白或酶中的給定氨基酸殘基已被改變而不改變所述多肽 的總體構象和功能的變體，包括但不限于將氨基酸用具有相似性質(例如極性、氫鍵形成潛 力、酸性、堿性、疏水性、芳香性等）的氨基酸置換。在蛋白中除了被指明為保守的那些之外 的氨基酸可以不同，以使得功能相似的任何兩個蛋白之間的蛋白或氨基酸序列相似性百分 數可以變化，并且當通過例如根據其中相似性基于MEG ALIGN算法的Cluster方法根據比對 方案進行測定時，可以為例如70%至99%。"功能保守性變體"還包括當通過BLAST或FASTA 算法確定時具有至少60 %、優選地至少75 %、更優選地至少85 %、更優選地至少90 %、甚至 更優選地至少95%的氨基酸同一性，并且具有與進行比較的天然或親本蛋白相同或基本上 相似的性質或功能的多肽。
[0086]當在較短序列的整個長度上超過80%、優選地超過85%、優選地超過90%的氨基 酸相同，或者超過約90%、優選地超過95%的氨基酸相似(功能上相同）時，兩個氨基酸序列 是"基本上同源的"或"基本上相似的"。優選地，使用例如GCG(Genetics Computer Group， GCG軟件包程序手冊，第7版，Madison，Wisconsin)堆積程序或任何序列比較算法諸如 BLAST、FASTA等，通過比對來鑒定相似或同源的序列。
[0087]例如，蛋白結構中的某些氨基酸可以被其它氨基酸置換而沒有可察覺的活性喪 失。由于蛋白的相互作用能力和特性限定蛋白的生物學功能活性，因此可以在蛋白序列中 以及當然在其DNA編碼序列中做出某些氨基酸置換，同時仍獲得具有類似性質的蛋白。因 此，預期可以在本發明的抗體序列或編碼所述抗體的相應DNA序列中做出各種改變而沒有 可察覺的其生物活性的喪失。
[0088]在本領域中已知，某些氨基酸可以被具有相似親水性指數或得分的其它氨基酸置 換并仍產生具有相似生物活性的蛋白，即仍然獲得生物學功能等同的蛋白。
[0089]因此，正如上面所概括，氨基酸替換通常基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性，例 如它們的疏水性、親水性、電荷、大小等。將各種上述特性考慮在內的示例性置換對于本領 域技術人員是眾所周知的，并且包括:精氨酸和賴氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;絲氨酸和蘇氨 酸;谷氨酰胺和天冬酰胺；以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸。
[0090] 因此，本發明還提供包含重鏈的抗體，其中可變結構域包含：
[0091] -與如SEQ ID N0:2所示的序列具有至少90%或95%同一性的H-CDR1，
[0092] -與如SEQ ID N0:3所示的序列具有至少90%或95%同一性的H-CDR2，
[0093] -與如SEQ ID N0:4所示的序列具有至少90%或95%同一性的H-CDR3，
[0094] -與如SEQ ID N0:6所示的序列具有至少90%或95%同一性的L-CDR1，
[0095] -與如SEQ ID N0:7所示的序列具有至少90%或95%同一性的L-CDR2，
[0096]-與如SEQ ID N0:8所示的序列具有至少90%或95%同一性的L-CDR3,并且 [0097] _所述抗體特異性結合HER3,其親和力與下述抗體基本上相同，所述抗體包含其中 可變結構域包含H-CDR1 的SEQ ID N0:2、H-CDR2的SEQ ID N0:3和H-CDR3的SEQ ID N0:4的 重鏈，以及其中可變結構域包含L-CDR1的SEQ ID N0:6、L-CDR2的SEQ ID N0:7和L-CDR3的 SEQ ID從):8的輕鏈，并且更優選地其親和力與鼠抗冊1?3抗體9?7411基本上相同。
[0098] 可以通過本領域已知的任何方法來測定所述抗體的特異性結合。許多不同的競爭 性結合測定形式可用于表位框并（epitope binning)。可以使用的免疫測定法包括但不限 于使用諸如western印跡的技術的競爭性測定系統、放射免疫測定法、ELISA、"夾心"免疫測 定法、免疫沉淀測定法、沉淀素測定法、凝膠擴散沉淀素測定法、免疫放射測量分析、熒光免 疫測定法、蛋白A免疫測定法和補體固定測定法。這種測定法在本領域中是常規且眾所周知 的（參見例如Ausubel等，eds，1994Current Protocols in Molecular Biology，Vol.l, John Wiley&sons, Inc.，New York)。例如，BIACORE?(GE Healthcare，Piscaataway, NJ)是常規用于單克隆抗體的表位框并組的多種表面等離子體共振測定形式之一。另外，可 以進行常規的交叉阻斷測定法，例如在Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow and David Lane,1988中所描述。
[0099] 本發明的工程化抗體包括對VH和/或VL內的框架殘基進行修飾以例如改進抗體性 質的抗體。進行這種框架修飾通常是為了降低抗體的免疫原性。例如，一種方法是將一個或 多個框架殘基"回復突變"成相應的種系序列。更具體地，已經歷體細胞突變的抗體可能含 有與抗體所源自的種系序列不同的框架殘基。這種殘基可以通過將抗體框架序列與抗體所 源自的種系序列進行比較來鑒定。為了使框架區序列返回至它們的種系構造，可以通過例 如定點誘變或PCR介導的誘變將體細胞突變"回復突變"成種系序列。這種"回復突變的"抗 體也意欲被本發明所涵蓋。另一種類型的框架修飾包括對框架區內或甚至一個或多個CDR 區內的一個或多個殘基進行突變以除去T細胞表位，從而降低抗體的潛在免疫原性。這種方 法也被稱為"脫免疫（deimmunization )"，并且更詳細描述于Carr等的美國專利公開號 20030153043 中。
[0100]除了在框架或CDR區內進行的修飾之外或替代這種修飾，可以對本發明的抗體進 行工程化以在Fc區內包括修飾，通常用于改變抗體的一種或多種功能性能，諸如血清半衰 期、補體固定、Fc受體結合和/或抗原依賴性細胞性細胞毒性。此外，可以對本發明的抗體進 行化學修飾(例如可以將一個或多個化學部分連接至抗體)或進行修飾以改變其糖基化，再 次改變抗體的一種或多種功能性質。這些實施方式中的每一種在下面進一步詳細描述。Fc 區中殘基的編號方式是Kabat的EU索引的編號方式。
[0101 ]在一種實施方式中，對CH1的鉸鏈區進行修飾以使得改變、例如增加或減少鉸鏈區 中半胱氨酸殘基的數目。這種方法進一步描述于Bodmer等的美國專利號5,677,425中。改變 CH1的鉸鏈區中的半胱氨酸殘基數量，以例如便于輕鏈和重鏈的組裝或提高或降低抗體的 穩定性。
[0102] 在另一種實施方式中，對抗體的Fc鉸鏈區進行突變以降低抗體的生物半衰期。更 具體地，將一個或多個氨基酸突變引入Fc-鉸鏈片段的CH2-CH3結構域界面區中，以使得抗 體相對于天然Fc-鉸鏈結構域的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合具有減弱的SpA結合。這種方法進 一步詳細描述于Ward等的美國專利號6，165，745中。
[0103] 在另一種實施方式中，對抗體進行修飾以增加其生物半衰期。各種方法都是可能 的。例如，如Ward的美國專利號6,277,375中所述，可以引入一個或多個下列突變:T252L， T254S，T256F。或者，為了增加生物半衰期，可以在CH1或CL區中對抗體進行改變以含有從 IgG的Fc區的CH2結構域的兩個環獲取的挽救受體結合表位，如Presta等的美國專利號5， 869,046 和6,121,022 中所述。
[0104] 在還有其它的實施方式中，通過將至少一個氨基酸殘基用不同的氨基酸殘基替換 對Fc區進行改變，以改變抗體的效應子功能。例如，可以將一個或多個氨基酸用不同氨基酸 殘基替換，以使得抗體對效應配體具有改變的親和力，但仍保留親本抗體的抗原結合能力。 親和力被改變的效應配體可以是例如Fc受體或補體的C1組分。這種方法進一步詳細描述于 Winter等的美國專利號5,624,821和5,648,260中。
[0105] 在另一種實施方式中，選自氨基酸殘基的一個或多個氨基酸可以被不同的氨基酸 殘基替換，以使得抗體具有改變的Clq結合和/或降低或消除的補體依賴性細胞毒性(CDC)。 這種方法進一步詳細描述于Idusogie等的美國專利號6,194,551中。
[0106] 在另一種實施方式中，改變一個或多個氨基酸殘基，從而改變抗體固定補體的能 力。這種方法進一步描述于Bodmer等的PCT公開W094/29351中。
[0107] 在又一種實施方式中，通過修飾一個或多個氨基酸對Fc區進行修飾以提高抗體介 導抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對Fc受體的親和力。這種方法 進一步描述于Presta的PCT公開TO00/42072中。此外，人IgGl上對于Fc y RI、Fc y RII、Fc y RIII和FcRn的結合位點已進行作圖，并且具有提高的結合的變體已得到描述（參見 Shields，R.L?等，2001J.Biol ? Chen. 276:6591-6604，W02010106180)〇
[0108] 在又一種實施方式中，修飾抗體的糖基化。例如，可以制備無糖基化抗體（即抗體 缺少糖基化）。可以改變糖基化以例如提高抗體對抗原的親和力。這種碳水化合物修飾可以 通過例如改變抗體序列內的一個或多個糖基化位點來實現。例如，可以進行一個或多個氨 基酸置換，其導致一個或多個可變區框架糖基化位點的消除，從而消除該位點處的糖基化。 這種脫糖基化可以提高抗體對抗原的親和力。這種方法進一步詳細描述于Co等的美國專利 號5,714,350 和6,350,861 中。
[0109] 另外地或可選地，可以制備具有改變的糖基化類型的抗體，諸如具有減少量或沒 有巖藻糖基殘基的低巖藻糖基化或非巖藻糖基化抗體，或具有增加的對分GlcNac結構的抗 體。已表明，這樣改變的糖基化模式提高抗體的ADCC能力。這種糖修飾可以通過例如在具有 改變的糖基化機制的宿主細胞中表達所述抗體來實現。具有改變的糖基化機制的細胞在本 領域中已得到描述，并且可以用作在其中表達本發明的重組抗體的宿主細胞，從而產生具 有改變的糖基化的抗體。例如，Hang等的EP1，176,195描述了具有功能破壞的編碼巖藻糖基 轉移酶FUT8基因的細胞系，使得在這種細胞系中表達的抗體表現出低巖藻糖基化或不含巖 藻糖基殘基。因此，在一種實施方式中，可以通過在表現出低巖藻糖基化或非巖藻糖基化模 式的細胞系（例如編碼巖藻糖基轉移酶的FUT8基因表達缺陷的哺乳動物細胞系）中重組表 達來產生本發明的抗體。Presta的PCT公開W003/035835描述了一種變體CH0細胞系Lecl3細 胞，其具有降低的將巖藻糖連接于Asn(297)連接糖的能力，也導致在該宿主細胞中表達的 抗體的低巖藻糖基化（也參見Shields，R.L?等，2002J.Biol.Chem. 277: 26733-26740)。 Umana等的PCT公開W099/54342描述了經工程化以表達糖蛋白修飾的糖基化轉移酶(例如0 (1，4)-N乙酰葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))的細胞系，使得在所述工程化細胞系中表達 的抗體表現出增加的對分GlcNac結構，其導致抗體的ADCC活性提高（也參見Umana等， 1999Nat ? Biotech ? 17:176-180) aEureka Therapeutics進一步描述了遺傳工程化的CH0哺 乳動物細胞，其能夠生產具有不含巖藻糖基殘基的改變的哺乳動物糖基化模式的抗體 (http: //www? eurekainc ? com/a&boutus/companyoverview? html)。或者，可以在被工程化 以具有哺乳動物樣糖基化模式并且能夠產生作為糖基化模式缺少巖藻糖的抗體的酵母或 絲狀真菌中產生本發明的抗體(參見例如EP1297172B1)。
[0110] 本發明預期的本文中抗體的另一種修飾是聚乙二醇化。可以將抗體聚乙二醇化以 例如提高抗體的生物(例如血清)半衰期。為了將抗體聚乙二醇化，通常將抗體或其片段與 聚乙二醇(PEG)、諸如PEG的反應性酯或醛衍生物，在使一個或多個PEG基團變為連接至抗體 或抗體片段的條件下進行反應。聚乙二醇化可以使用反應性PEG分子(或類似的反應性水溶 性聚合物），通過酰化反應或烷基化反應來進行。如本文所使用，術語"聚乙二醇"意欲涵蓋 已用于衍生化其它蛋白的任何PEG形式，例如單(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚 乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實施方式中，待聚乙二醇化的抗體是脫糖基化抗體。蛋白聚乙 二醇化的方法在本領域中是已知的，并且可以適用于本發明的抗體。參見例如Ni shimura等 的 EP0154316 和 Ishikawa 等的 EP0401384。
[0111] 本發明預期的抗體的另一種修飾是本發明的抗體的至少抗原結合區與血清蛋白 諸如人血清白蛋白或其片段的偶聯物或蛋白融合以提高得到的分子的半衰期。這種方法描 述于例如 Ballance 等，EP0322094 中。
[0112] 另一種可能性是本發明的抗體的至少抗原結合區與能夠結合血清蛋白例如人血 清白蛋白的蛋白的融合體，以提高得到的分子的半衰期。這種方法描述于例如Nygren等的 EP0486525 中。
[0113] 免疫偶聯物:
[0114] 本發明的抗體可以與可檢測標記物偶聯以形成抗HER3免疫偶聯物。合適的可檢測 標記物包括例如放射性同位素、熒光標記物、化學發光標記物、酶標記物、生物發光標記物 或膠體金。制備和檢測這種可檢測地標記的免疫偶聯物的方法對于本領域的普通技術人員 是眾所周知的，并且在下面更詳細地描述。
[0115] 可檢測標記物可以是通過放射自顯影檢測的放射性同位素。出于本發明的目的， 特別有用的同位素是3H、 125I、131I、35S和14C。
[0116] 抗HER3免疫偶聯物也可以用熒光化合物標記。通過將免疫偶聯物暴露于適當波長 的光并檢測所得熒光來確定熒光標記的抗體的存在。熒光標記化合物包括熒光素異硫氰酸 酯、羅丹明、藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白、鄰苯二甲醛和熒光胺。
[0117] 或者，可以通過將抗體與化學發光化合物偶聯而對抗HER3免疫偶聯物進行可檢測 地標記。通過檢測在化學反應期間產生的化學發光的存在來確定帶有化學發光標簽的免疫 偶聯物的存在。化學發光標記化合物的實例包括發光氨、異發光氨、芳香族吖啶酯、咪唑、口丫 啶鹽(acridinium salt)和草酸酯。
[0118] 類似地，可以使用生物發光化合物來標記本發明的抗HER3免疫偶聯物。生物發光 是在生物系統中發現的化學發光類型，在所述系統中催化蛋白提高化學發光反應的效率。 通過檢測發光的存在來確定生物發光蛋白的存在。可用于標記的生物發光化合物包括螢光 素、螢光素酶和水母發光蛋白。
[0119] 或者，可以通過將抗HER3單克隆抗體與酶連接來可檢測地標記抗人HER3免疫偶聯 物。當將抗J1ER3抗體-酶偶聯物在適當底物存在下孵育時，酶部分與底物反應以產生可以通 過例如分光光度、熒光測量或目測手段檢測的化學部分。可用于可檢測地標記多特異性免 疫偶聯物的酶的實例包括半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、過氧化物酶和堿性磷酸酶。
[0120] 本領域技術人員知道可根據本發明使用的其它適合標記物。標志物部分與抗人 HER3單克隆抗體的結合可以使用本領域已知的標準技術來實現。在這方面，典型的方法描 述于下列文獻中：Kennedy等，Clin? Chim.Acta 70:1，1976;Schurs等，Clin? Chim.Acta 81: l，1977;Shih等，Int，l J.Cancer 46:1101，1990;Stein等，Cancer Res.50:1330，1990;和 Coligan，同上。
[0121] 此外，免疫化學檢測的方便性和通用性可以通過使用與親和素、鏈霉親合素和生 物素偶聯的抗人HER3單克隆抗體來提高（參見例如Wilchek等（編），"Avidin-Biotin Technology /'Methods In Enzymology(Vol.184)(Academic Press 1990);Bayer等， "Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,，!Methods In Molecular Biology(Vol.lO)149_162(Manson，編，The Humana Press，Inc.l992).)〇
[0122] 進行免疫測定的方法是良好建立的（參見例如Cook和Self，"Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays /'Monoclonal Antibodies:Production, Engineering,and Clinical Application 18〇-208(Ritter和Ladyman,編，Cambridge University Press 1995);Perry，"The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay TechnologyMonoclonal Antibodies:Principles and Applicationsl07-120(Birch和Lennox，編，Wiley-Liss,Inc.1995);Diamandi s， Immunoassay(Academic Press，Inc?1996)?)〇
[0123] 另一方面，本發明提供抗人HER3單克隆抗體-藥物偶聯物。如本文所使用，"抗人 HER3單克隆抗體-藥物偶聯物"是指與治療劑偶聯的本發明的抗人HER3單克隆抗體。這種抗 人HER3單克隆抗體-藥物偶聯物在施用于受試者諸如例如患有表達HER3的癌癥的受試者 時，通常是在單獨施用時，但也在與其它治療劑組合施用時，對表達HER3的細胞產生臨床有 益的效應。
[0124] 在典型的實施方式中，將抗人HER3單克隆抗體與細胞毒性劑偶聯，以便所得抗體-藥物偶聯物在被表達J1ER3的細胞(例如表達HER3的癌細胞)攝取或內化時對該細胞發揮細 胞毒性或細胞抑制性效應。用于與抗體偶聯的特別合適的部分是化療劑、前藥轉化酶、放射 活性同位素或化合物或者毒素。例如，可以將抗人J1ER3單克隆抗體與細胞毒性劑偶聯，諸如 化療劑或毒素(例如細胞抑制劑或殺細胞劑，諸如例如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外 毒素或白喉毒素）。
[0125] 有用的細胞毒性劑種類包括例如抗微管蛋白劑、奧瑞斯他汀類(auristatins)、 DNA小溝結合劑、DNA復制抑制劑、燒化劑(例如鉑復合物如順鉬、單（鉑）、雙(鉬)及三核鉑復 合物和卡鉑）、蒽環類、抗生素、抗葉酸劑、抗代謝物、化療敏化劑、倍癌霉素 (duocarmycins)、依托泊苷、氟代啼啶、離子載體、lexitropsins、亞硝基脲、順鉬 (platinols)、預形成化合物、嘌呤抗代謝物、嘌呤霉素類、輻射敏化劑、留類、紫杉烷、拓撲 異構酶抑制劑、長春花生物堿等。
[0126] 單個細胞毒性劑包括例如雄激素、安曲霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮雜胞苷、硫唑 嘌呤、博來霉素、白消安、丁硫氨酸亞砜胺、喜樹堿、卡鉑、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065(Li等， Cancer Res.42:999-1004,1982)、苯丁酸氮芥、順鉑、秋水仙堿、環磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧 啶阿拉伯糖苷、細胞松弛素B、氮烯唑胺、更生霉素(之前稱為放線菌素）、道諾霉素、氨烯咪 胺、多烯紫杉醇、阿霉素、雌激素、5-氟脫氧尿苷、磷酸依托泊苷(VP-16)、5-氟尿嘧啶、短桿 菌肽D、羥基脲、伊達比星、異環磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、二氯甲基二乙胺、美法 侖、6-巰基嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、絲裂霉素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡霉素、 丙卡巴肼、鏈脲霉素、替尼泊苷(VM-26)、6-硫鳥嘌呤、噻替派（thioTEPA)、托泊替康、長春 堿、長春新堿和長春瑞濱。
[0127] 特別合適的細胞毒性劑包括例如多拉司他汀類（例如奧瑞斯他汀E、AF P、MM AF、 MMAE)、DNA小溝結合劑(例如稀二炔類和lexitropsins)、倍癌霉素類、紫杉燒類(例如紫杉 醇和多烯紫杉醇）、嘌呤霉素類、長春花生物堿類、CC-1065、SN-38(7-乙基-10-羥基-喜樹 堿）、托泊替康、嗎啉并阿霉素、根霉素、氰基嗎啉并阿霉素、棘霉素、考布他汀、紡錘菌素、埃 博霉素A和B、雌氮芥、隱藻素（cryptophysins)、西馬多丁、美登木素類、圓皮海綿內酯 (discodermolide)、五加苷素（eleutherobin)和米托蒽醌。
[0128] 在某些實施方式中，細胞毒性劑是常規化療藥劑，諸如例如阿霉素、紫杉醇、美法 侖、長春花生物堿、甲氨蝶呤、絲裂霉素C或依托泊苷。此外，可以將有效試劑諸如CC-1065類 似物、卡奇霉素、美登木素、多拉司他汀10的類似物、根霉素和海葵毒素連接至抗J1ER3表達 抗體。
[0129] 在特定變化形式中，細胞毒性或細胞抑制劑是奧瑞斯他汀E(在本領域中也稱為多 拉司他汀-10)或其衍生物。奧瑞斯他汀E衍生物通常是例如奧瑞斯他汀E與酮酸之間形成的 酯。例如，可以將奧瑞斯他汀E與對乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反應以分別產生AEB和 AEVB。其它典型的奧瑞斯他汀衍生物包括AFP(二甲基纈氨酸-纈氨酸-多拉異亮氨酸-多拉 脯氨酸-苯丙氨酸-對苯二胺）、MMAF(朵纈氨酸(dovaline)-纈氨酸-多拉異亮氨酸-多拉脯 氨酸-苯丙氨酸)和MAE(單甲基奧瑞斯他汀E)。奧瑞斯他汀E及其衍生物的合成和結構描述 于美國專利申請公開號20030083263、國際專利公開號W02002/088172和W02004/010957以 及美國專利號6,884，869;6,323,315;6,239,104;6,034,065; 5,780,588;5,665,860;5， 663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410, 024; 5，138，036; 5，076，973; 4，986，988; 4，978，744; 4，879，278; 4，816，444;和4，486，414 中。
[0130] 在其它變化形式中，細胞毒性劑是DNA小溝結合劑（參見例如美國專利號6,130， 237)。例如，在某些實施方式中，小溝結合劑是CBI化合物。在其它實施方式中，小溝結合劑 是烯二炔(例如卡奇霉素）。
[0131] 在某些實施方式中，抗體-藥物偶聯物包含抗微管蛋白劑。抗微管蛋白劑的實例包 括例如紫杉烷(例如Taxol? (紫杉醇）、Taxotere? (多烯紫杉醇））、T67(Tularik)、長春 花生物堿(例如長春新堿、長春堿、長春地辛和長春瑞濱)和多拉司他汀(例如奧瑞斯他汀E、 AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)。其它抗微管蛋白劑包括例如漿果赤霉素衍生物、紫杉烷類似物 (例如埃博霉素A和B)、諾考達唑、秋水仙素和秋水仙胺、雌氮芥、隱藻素類、西馬多丁、美登 木素類、康普立停類、圓皮海綿內酯和五加苷素。在某些實施方式中，細胞毒性劑是美登醇， 另一組抗微管蛋白劑。例如，在特定實施方式中，美登醇是美登木素或DM-UlmmunoGen， Inc.;也參見Chari等，Cancer Res.52:127-131，1992)〇
[0132] 在其它實施方式中，細胞毒性劑是抗代謝物。抗代謝物可以是例如嘌呤拮抗劑(例 如硫唑嘌呤或麥考酚酸嗎乙酯）、二氫葉酸還原酶抑制劑(例如甲氨蝶呤）、阿昔洛韋、更昔 洛韋、齊多夫定、阿糖胞苷、雷巴威林、疊氮胸苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、金剛烷胺、雙脫氧尿 苷、碘代脫氧尿苷、膦甲酸(poscarnet)或曲氟胸苷。
[0133] 在其它實施方式中，將抗人HER3單克隆抗體與前藥轉化酶偶聯。前藥轉化酶可以 使用已知方法與抗體重組融合或與抗體化學偶聯。示例性的前藥轉化酶是羧肽酶G24-葡 萄糖醛酸酶、青霉素-V-酰胺酶、青霉素-G-酰胺酶、內酰胺酶、葡萄糖苷酶、硝基還原酶 和羧肽酶A。
[0134] 用于將治療劑與蛋白、特別是抗體偶聯的方法是眾所周知的（參見例如Arnon等， "Monoclonal Antibodies For Immuno targe ting Of Drugs In Cancer Therapy，'， Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld等編，Alan R.Liss，Inc ?，1985); Hellstrom等，"Antibodies For Drug DeliveryControlled Drug Delivery(Robinson 等編，Marcel Deiker，Inc?，第2版 1987) ;Thorpe，"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review/'Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications(Pinchera等編，1985); "Analysis，Results，and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin 等編， Academic Press，1985);和Thorpe等，1982，Immunol .Rev? 62:119-58D也參見例如PCT公開 W0 89/12624.)〇
[0135] 診斷用途:
[0136] 本發明的另一個目的涉及本發明的抗人HER3抗體用于診斷和/或監測與HER3表達 相關的癌癥疾病。與HER3表達相關的癌癥疾病通常包括但不限于鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、 非小細胞肺癌、胃癌、胰腺癌、神經膠質細胞腫瘤例如成膠質細胞瘤和神經纖維瘤、宮頸癌、 卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、黑素瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺 癌、腎癌、腎的癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝的癌和各種類型的頭頸癌。在一種特定實 施方式中，使用本發明的方法診斷的癌癥是乳腺癌或卵巢癌。在一種特定實施方式中，本發 明的抗體可用于診斷乳腺癌和卵巢癌。
[0137] 在一種特定實施方式中，可以如上所述的將本發明的抗體用可檢測分子或物質諸 如熒光分子、放射活性分子或本領域中已知的任何其它標記物標記。例如，可以通過本領域 已知的任何方法將本發明的抗體用放射活性分子標記。例如，放射活性分子包括但不限于 用于閃爍法研究的放射活性原子，諸如1123、1124、In 111、Re 186、Re 188。本發明的抗體還可 以用核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)的自旋標記物諸如碘-123、碘-131、銦- 111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵來標記。在施用抗體后，檢測抗體在患者內的分 布。用于檢測任何特定標記物的分布的方法對于本領域技術人員是已知的，并且可以使用 任何合適的方法。一些非限制性的實例包括計算機斷層掃描(CT)、正發射斷層掃描(PET)、 磁共振成像(MRI)、焚光、化學發光和超聲波描記術。
[0138] 本發明的抗體可用于與HER3表達相關的癌癥疾病的分期（例如，在放射免疫成像 中）。例如，本發明的抗體可以用于對乳腺癌或卵巢癌分期。它們可以單獨使用或與其它乳 腺癌或卵巢癌標志物(包括但不限于，HER2、CA1 25、HE4和對間皮素(mesothelin))組合使 用。
[0139] 通常，所述診斷方法涉及使用獲得自患者的生物樣品。如本文所使用，術語"生物 樣品"涵蓋獲得自受試者的各種樣品類型并且可以用于診斷或監測測定。生物樣品包括但 不限于血液和生物來源的其它液體樣品、固體組織樣品諸如生物活檢樣本或源于其的組織 培養物或細胞，及其后代。例如，生物樣品包括獲得自組織樣品的細胞，所述組織樣品收集 自疑似患有與J1ER3表達相關的癌癥疾病的個體，并且在一種特定實施方式中收集自乳腺或 卵巢。因此，生物樣品涵蓋臨床樣品、培養物中的細胞、細胞上清液、細胞裂解物、血清、血 漿、生物流體和組織樣品。
[0140] 在一種特定實施方式中，本發明是通過使用本發明的抗體檢測來自受試者的細胞 上的HER3而診斷受試者中與HER3表達相關的癌癥疾病的方法。具體而言，所述診斷方法可 以包括下列步驟：
[0141] (a)將可能患有與HER3表達相關的癌癥疾病的受試者的生物樣品在足以使抗體與 表達HER3的生物樣品的細胞形成復合物的條件下與本發明的抗體相接觸；
[0142] (b)檢測和/或定量所述復合物，從而所述復合物的檢測指示與HER3表達相關的癌 癥疾病。
[0143] 為了監測癌癥疾病，可以不同的時間間隔重復本發明的診斷方法，以便確定抗體 與樣品的結合增加還是減少，由此確定癌癥疾病是進展還是消退。
[0144] 治療性用途:
[0145] 本發明的抗體、片段或免疫偶聯物可用于治療任何表達HER3的癌癥。本發明的抗 體可以單獨地或與任何適合試劑組合使用。
[0146] 表達HER3的癌癥的實例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。這種 癌癥的更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃癌、胰腺癌、神經膠質細 胞腫瘤諸如成膠質細胞瘤和神經纖維瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、 結腸癌、黑素瘤、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎癌、腎的癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀 腺癌、肝的癌和各種類型的頭頸癌。在一種特定實施方式中，使用本發明的方法治療的癌癥 是乳腺癌或卵巢癌。
[0147] 因此，本發明的一個目的涉及用于治療與HER3的表達相關的癌癥的方法，所述方 法包括向有需要的受試者施用治療有效量的本發明的抗體、片段或免疫偶聯物。
[0148] 在一些實施方式中，本發明的抗體特別適合于治療配體（即，NRG)非依賴性癌癥和 配體依賴性癌癥。
[0149] 在一些實施方式中，本發明的抗體特別適合于治療自分泌或旁分泌配體依賴性腫 瘤（由于其變構效應）。
[0150] 在一些實施方式中，本發明的抗體特別適合于治療對用抗體、酪氨酸激酶抑制劑 (TKI)、化療劑或抗激素劑的治療耐藥的癌癥。
[0151] 在一些實施方式中，本發明的抗體特別適合于治療選自三陰性乳腺癌、胰腺癌和 腎細胞癌的癌癥。
[0152] 在本發明的上下文中，如本文所使用，術語"治療（treating)"或"治療 (treatment)"，意指逆轉、緩解這種術語適用的疾病或病癥病癥或者這種疾病或病癥病癥 的一種或多種癥狀、抑制其發展或對其預防。
[0153] 根據本發明，術語"患者"或"有需要的患者"意欲用于患有或可能患有與人HER3的 表達相關的癌癥的人或非人哺乳動物。
[0154] 本發明的抗體的"治療有效量"意指足以以適用于任何醫學治療的合理利益/風險 比治療所述癌癥的抗體的量。然而，應該理解，本發明的抗體和組合物的每日總用量將由主 治醫師在合理的醫療判斷的范圍內決定。任何特定患者的具體治療有效劑量水平取決于多 種因素，包括待治療的病癥和病癥的嚴重性，所使用的具體抗體的活性，所使用的具體組合 物，患者的年齡、體重、總體健康、性別和飲食，施用的時間、施用途徑和所使用的具體抗體 的排泄速率，治療的持續時間，與所使用的具體抗體組合或同時使用的藥物，以及醫學技術 領域中眾所周知的類似因素。例如，在本領域技術中眾所周知的是，化合物的劑量以低于實 現所希望的療效所需的水平開始，并逐漸增加劑量直至實現所希望的療效。
[0155] 在某些實施方式中，將抗人HER3單克隆抗體或抗體-藥物偶聯物與用于治療疾病 或病癥的第二試劑組合使用。當用于治療癌癥時，本發明的抗人HER3單克隆抗體或抗體-藥 物偶聯物可以與常規的癌癥療法組合使用，所述常規療法諸如例如手術、放療、化療或其組 合。在某些情況下，可用于與本發明的抗HER3抗體或抗體-藥物偶聯物的組合癌癥治療的其 它治療劑包括抗血管生成藥劑。在一些方面，本發明的抗體或抗體-藥物偶聯物與細胞因子 (例如刺激針對腫瘤的免疫應答的細胞因子)共同施用。
[0156] 在一些其它方面，可用于組合療法的其它治療劑包括參與腫瘤生長的某些因子 (諸如，例如，EGFR、HER2或HER4)的拮抗劑。
[0157] 在一種特定實施方式中，本發明的抗人HER3單克隆抗體或抗體-藥物偶聯物與抗 人HER2單克隆抗體諸如曲妥珠單抗或帕妥珠單抗組合使用。
[0158] 在一些實施方式中，本文所述的抗人HER3單克隆抗體或抗體-藥物偶聯物與酪氨 酸激酶抑制劑(TKI)組合使用。BAY 43-9006(索拉非尼，Nexavar⑩)和SU11248(舒尼替尼， Sutent?)是已被批準的兩種這樣的TKI。其它TKI包括但不限于：甲磺酸伊馬替尼（ Gleevec?,Novartis);吉非替尼（丨ressa?,AstraZeneca);鹽酸厄洛替尼Tarceva?, Genentech);凡德他尼（ZaCtima^I^AstraZeneca)，替P比法尼（Zarnestl'a? ,Janssen-Cilag);達沙替尼（:S:|?ryCel?，B;ristol Myers Squibb);洛那法Sarasar?，Schering Plough) ; 丁二酸凡塔藍尼（Novartis，Schering AG);拉帕替尼（Tykerb⑩， GlaxoSmithKline);尼洛替尼（Novartis);來他替尼（Cephalon);鹽酸帕唑帕尼 (GlaxoSmithKline);阿昔替尼(Pfizer);二鹽酸卡奈替尼(Pfizer);培利替尼(National Cancer Institute，Wyeth);坦度替尼（Millennium);波舒替尼（Wyeth);司馬沙尼（Sugen， Taiho)；AZD-2171(AstraZeneca)；VX-680(Merck,Vertex)；EXEL-0999(Exelixis)；ARRY-142886(Array BioPharma,AstraZeneca)；PD-〇325901(Pfizer)；AMG-706(Amgen)；BIBF-1120(Boehringer Ingelheim)；SU-6668(Taiho)；CP-547632(0SI)；(AEE-788(Novartis)； BMS-582664(Bristol-Myers Squibb)；JNK-401(Celgene)；R-788(Rigel)；AZD-1152HQPA (AstraZeneca);MW-3(Genzyme Oncology);CP-868596(Pfizer);BMS_599626(Bristol-Myers Squibb)；PTC-299(PTC Therapeutics)；ABT-869(Abbott)；EXEL-2880(Exelixis)； AG-024322(Pfizer);XL-820(Exelixis);0SI-930(0SI);XL-184(Exelixis);KRN-951 (Kirin Brewery)；CP-724714(0SI)；E-7080(Eisai)；HKI-272(ffyeth)；CHIR-258(Chiron)； ZK-304709(Schering AG);EXEL-7647(Exelixis);BAY-57-9352(Bayer);BIBW-2992 (Boehringer Ingelheim) ;AV_412(AVE0) ;YN_968Dl(Advenchen Laboratories);米噪妥林 (Novartis);哌立福辛（AEterna Zentaris ,Keryx ,National Cancer Institute) ;AG_ 024322(Pfizer);AZD-1152(AstraZeneca);0N-01910Na(0nconova);和AZD-0530 (AstraZeneca)〇
[0159] 藥物組合物:
[0160] 對于施用，將抗人HER3單克隆抗體或抗體-藥物偶聯物配制成藥物組合物。包含抗 人HER3單克隆抗體或抗體-藥物偶聯物的藥物組合物可以根據制備可藥用組合物的已知方 法來配制，由此將治療性分子與藥學上可接受的載體組合于混合物中。如果組合物的施用 可以被受體患者耐受，則它被稱為是"藥學上可接受的載體"。無菌磷酸鹽緩沖鹽水是藥學 上可接受的載體的一個實例。其它合適的載體對于本領域技術人員是眾所周知的（參見例 如Gennaro(編），Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,第 19版1995).)。制劑可以進一步包括一種或多種賦形劑、防腐劑、增溶劑、緩沖劑、防止病毒 表面上的蛋白損失的白蛋白等。
[0161] 藥物組合物的形式、施用途徑、劑量和方案自然取決于待治療的病癥、疾病的嚴重 性、患者的年齡、體重和性別等。
[0162] 本發明的藥物組合物可以被配制成用于局部、經口、腸胃外、鼻內、靜脈內、肌肉 內、皮下或眼內施用等。
[0163] 優選地，藥物組合物含有對于能夠注射的制劑的藥學上可接受的媒介物。這些尤 其可以是等滲的、無菌的鹽水溶液(磷酸二氫鈉或磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、氯 化鎂等或這種鹽的混合物），或者是干燥的、特別是冷凍干燥的組合物，其在根據情況添加 無菌水或生理鹽水后，允許構成可注射溶液。
[0164] 用于施用的劑量可以隨著各種參數而變化，尤其是隨著所使用的施用方式、相關 病理或所需的治療持續時間而變化。
[0165] 為了制備藥物組合物，可以將有效量的抗體溶解或分散于藥學上可接受的載體或 水性介質中。
[0166] 適合于注射使用的藥物形式包括無菌水性溶液或分散液，包括芝麻油、花生油或 水性丙二醇的制劑；以及用于臨時制備無菌注射溶液或分散體的無菌粉劑。在所有情況下， 所述形式必須是無菌的并且必須為達到存在容易的可注射性能的程度的流體。它必須在制 造和儲存條件下穩定，并且必須進行防腐以對抗微生物諸如細菌和真菌的污染作用。
[0167] 作為游離堿或藥學上可接受的鹽的活性化合物的溶液可以在與表面活性劑諸如 羥丙基纖維素適當地混合的水中制備。分散體也可以在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中 制備，以及在油中制備。在通常的儲存和使用條件下，這些制備物含有防腐劑以防止微生物 的生長。
[0168] 本發明的抗體可以以中性或鹽形式配制成組合物。藥學上可接受的鹽包括酸加成 鹽(與蛋白的游離氨基形成），并且與無機酸諸如例如鹽酸或磷酸或者有機酸諸如乙酸、草 酸、酒石酸、扁桃酸等形成。與游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機堿諸如例如氫氧化鈉、 氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵以及有機堿諸如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡 因等。
[0169] 載體也可以是溶劑或分散體介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇 和液體聚乙二醇等）、其合適的混合物和植物油。可以例如通過使用包衣劑諸如卵磷脂，在 分散體的情況下通過維持所需粒徑以及通過使用表面活性劑，來維持適當的流動性。微生 物作用的預防可以通過各種抗細菌和抗真菌劑例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨 酸、硫柳汞等來實現。在許多情況下，包括等滲劑例如糖類或氯化鈉將是優選的。可注射組 合物的延長吸收可以通過在組合物中使用延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁和明膠來實現。 [0170]通過將活性化合物以所需量并入根據需要具有上面列舉的各種其它成分的適合 溶劑中，然后過濾滅菌來制備無菌注射溶液。通常，通過將各種滅菌活性成分并入含有基本 分散體介質和選自上面列舉的所需其它成分的無菌媒介物中來制備分散體。在用于制備無 菌注射溶液的無菌粉劑的情況下，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術，其從事先 無菌過濾的溶液產生活性成分加上任何其它所需成分的粉末。
[0171]還預期制備更加或高度濃縮的用于直接注射的溶液，其中設想使用DMS0作為溶劑 以產生極快的滲透，從而將高濃度的活性試劑遞送到小的腫瘤區域。
[0172] 在配制后，將溶液以與劑量制劑相容的方式和以諸如治療有效的量施用。制劑以 各種劑型諸如上面描述的可注射溶液的類型容易地施用，但是也可以使用藥物釋放膠囊 等。
[0173] 對于例如在水性溶液中的腸胃外施用，如果需要，溶液應該進行適當緩沖，并首先 用足夠的鹽水或葡萄糖使得液體稀釋劑等滲。這些特定水性溶液尤其適合于靜脈內、肌肉 內、皮下和腹膜內施用。關于這點，可以使用的無菌水性介質鑒于本公開內容對于本領域技 術人員是已知的。例如，可以將一個劑量溶解于lml等滲NaCl溶液中，然后添加至1000ml皮 下輸注流體或在建議輸注位點注射(參見例如"Remington's Pharmaceutical Sciences" 第15版，第1035-1038和1570-1580頁）。取決于待治療的受試者的病癥，必需對劑量進行一 些改變。在任何情況下，負責施用的人決定個別受試者的適當劑量。
[0174] 本發明的抗體可以配制在治療性混合物內以在每劑量中包含約0.0001至1.0毫 克，或約0.001至0.1毫克，或約0.1至1.0或甚至約10毫克左右。也可以施用多個劑量。
[0175] 除了為腸胃外施用諸如靜脈內或肌肉內注射配制的化合物之外，其它藥學上可接 受的形式包括例如用于口服施用的片劑或其它固體;時間釋放膠囊；以及目前使用的任何 其它形式。
[0176] 在某些實施方式中，考慮使用脂質體和/或納米顆粒將抗體引入宿主細胞中。脂質 體和/或納米顆粒的形成和使用對于本領域技術人員是已知的。
[0177] 納米膠囊(nanocapsule)通常可以穩定且可重復的方式捕集化合物。為了避免由 細胞內聚合物過載導致的副作用，通常使用能夠在體內降解的聚合物來設計這種超細顆粒 (大小在O.lMi左右）。考慮將滿足這些要求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯納米顆粒 用于本發明，這種顆粒可以容易地制造。
[0178] 脂質體從分散于水性介質中并自發形成多片層同心雙層囊泡(也被稱為多層囊泡 (MLV))的磷脂形成。MLV通常具有25nm至4mi的直徑。MLV的超聲處理導致形成小的單層囊泡 (SUV)，其直徑在200至500A的范圍內，在核心中含有水性溶液。脂質體的物理特征取決于 pH、離子強度和二價陽離子的存在。
[0179] 試劑盒:
[0180] 最后，本發明還提供包含至少一種本發明的抗體的試劑盒。含有本發明抗體的試 劑盒可用于檢測ffiR3表達，或用于治療性或診斷性測定。本發明的試劑盒可以含有與固相 支持物例如組織培養板或珠(例如瓊脂糖凝膠珠)偶聯的抗體。可以提供含有用于在體外 (例如在EL ISA或We s t ern印跡中）檢測和定量HER3的抗體的試劑盒。這種可用于檢測的抗體 可以提供有標記物諸如熒光或放射性標記物。
[0181] 本發明將通過下面的附圖和實施例進一步說明。然而，這些實施例和附圖不應被 解釋為以任何方式限制本發明的范圍。
[0182] 附圖：
[0183] 圖1顯示mAb 9F7-F11和NRG對與細胞上的HER3受體的結合的相互變構效應。當添 加各種濃度的NRG時，SKBR3細胞上9F7-F11與HER3的結合增加。相反，抗體A不受NRG結合的 影響，且抗體B被NRG結合阻斷（小圖A)。相反，當添加各種濃度的mAb 9F7-F11時，HER2/HER3 轉染的3T3成纖維細胞上NRG與HER3的結合增加，而無關IgG不影響NRG結合。相反，游離的 NRG替代標記的NRG結合至HER3(小圖B)。
[0184] 圖2定量有或無NRG的情況下9F7-F11與HER3受體的親和力。相對于NRG不存在的情 況下測量的親和力（2.33 ±0.30nM)，在NRG存在的情況下測量的親和力增加6倍(0.47 ± 0.07nM)〇
[0185] 圖3顯示在BxPC3胰腺癌細胞中通過使用抗HER3mAb 9F7-F11的HER2/HER3受體和 下游P13K/Akt和ERK信號傳導的磷酸化的抑制。
[0186] 圖4顯示mAb 9F7-F11對p53/MDM2表達和磷酸化的影響，如western印跡(A)所表明 且如Image J所定量(B)〇
[0187] 圖5顯示mAb 9F7-F11對p53可誘導的基因p21、細胞周期蛋白A2、PERP、Puma和Bel- 2的表達的影響，如定量PCR所表明。將相對mRNA表達針對GAPDH表達進行均一化。
[0188] 圖6顯示mAb 9F7-F11對BxPC3胰腺癌細胞的細胞周期停滯的影響。
[0189] 圖7顯示mAb 9F7-F11對BxPC3胰腺癌細胞的細胞凋亡的影響(A)。來自9F7-F11處 理的BxPC3細胞的細胞裂解物的we stern印跡表明發動線粒體凋亡的胱天蛋白酶-9的切割 ⑶。
[0190] 圖8顯示相對于用單獨的曲妥珠單抗或西妥昔單抗觀察到的影響，單獨或與西妥 昔單抗或曲妥珠單抗組合的mAb 9F7-F11對BxPC3胰腺癌細胞的增殖的影響。
[0191] 圖9顯示mAb 9F7-F11相比于曲妥珠單抗對目標MDA-MB-453乳腺癌細胞的ADCC效 應。
[0192] 圖10顯示在用HER2-擴增/PIK3CA-突變的MDA-MB-361乳腺癌細胞異種移植的裸小 鼠中mAb 9F7-F11對腫瘤進展的抑制。
[0193] 圖11顯示在用三陰性的PTEN-突變的/p53-突變的MDA-MB-4688乳腺癌細胞異種移 植的裸小鼠中mAb 9F7-F11對腫瘤進展的抑制(A)。當MDA-MB-468腫瘤達到2000mm3的體積 時，計算Kaplan-Meier生存曲線(B)。
[0194] 圖12顯示與單獨的帕妥珠單抗(P)或媒介物(Ctrl)(小圖A)和曲妥珠單抗和帕妥 珠單抗的組合(P+T)(小圖B)相比，用嗜NRG、p53-突變的、HER2 teBxPC3胰腺癌細胞異種移植 且用單獨使用的mAb 9F7-F11(9F7)或與帕妥珠單抗組合(P+9F7)處理的裸小鼠的腫瘤進展 和存活。
[0195] 圖13顯示在用shHER3-或shLuc(對照）-敲除BxPC3胰腺癌細胞異種移植的裸小鼠 中mAb 9F7-F11對腫瘤進展的抑制(A)。對從處理小鼠回收的異種移植物通過western印跡 檢查HER3沉默(B)。
[0196] 實施例1:9F7-F11對HER3結合的變構效應
[0197] 將一只Balb/c小鼠腹膜內注射HER2/HER3-轉染的NIH 3T3細胞系（約2xl06個細 胞），所述細胞系事先用神經調節蛋白m(NRG)刺激以促進HER2/HER3異源二聚體形成。來自 免疫的小鼠的脾細胞根據已經描述的方案（Salhi等Biochem. J.2004)使用骨髓瘤 PX63Ag8.653融合。將105個融合細胞/孔在具有HAT介質的板中培養以用于雜交瘤選擇。在 融合后12天之后，通過使用蛋白HER3-FC作為抗原的ELISA進行雜交瘤上清液篩選。在對照 中，用單獨的區分抗原HER2-FC和Fc片段同時進行篩選。
[0198] 進行細胞計數法競爭實驗以便在基于SKBR3細胞的測定中定量NRG抑制抗體與 HER3的結合的能力。為此，將105個SKBR3細胞在冰上與各種濃度的競爭性NRG配體預孵育 1.5小時。在用PBS-1%BSA洗滌一次后，將選擇的抗HER3mAb 9F7-F11，以得到50%最大結合 的濃度，添加至每個孔，在冰上持續1小時。在一些實驗中，將NRG配體和抗HER3 9F7-F11抗 體在冰上共同孵育2小時。然后洗滌細胞并且在冰上與適當的FITC-偶聯的二抗(Sigma)的 1:60稀釋液進一步孵育45分鐘，然后在Quanta裝置(Beckman-Coulter)上進行細胞計數分 析。通過FACS的競爭性實驗表明，9F7-F11抗體不與NRG競爭，因此表明該抗體不結合至NRG-結合位點（圖1A)。當添加NRG時，NRG-非競爭性9F7-F11抗體結合甚至增強至160%，因此表 明mAb 9F7-F11對HER3結合的變構效應。相比之下，NRG孵育不改變陽性對照抗體A的結合， 且陽性對照抗體B顯示NRG依賴性結合(圖1A)。
[0199] 相反地，將105個HER3轉染的3T3成纖維細胞在饑餓之前培養2天，然后在+4°C在 Krebs緩沖液中與各種濃度的9F7-FllmAb孵育45分鐘。添加用d2穴狀化合物染料標記的 NRG，持續額外45分鐘。KREBS洗滌之后，使用Pherastar微板閱讀器測量在620/670nm的熒 光。如圖1B中所表明，9F7-F11結合誘導NRG與HER3的結合的增加，而無關IgG則沒有。作為對 照，各種濃度的游離NRG替代標記的NRG與HER3受體的結合（圖1B)，因此表明9F7-F11和NRG 之間對于HER3結合的相互變構效應。
[0200] 實施例2:NRG添加誘導9F7-F11對HER3受體的親和力的6倍增加
[0201] 使用CisBio BioAssay開發的Tag-Lite技術，將104個HER3Snap-標記的HEK細胞用 Lumi4-鋱穴狀化合物供體標記，然后與NRG和各種濃度的d2受體標記的mAb 9F7-F11共同孵 育。孵育16小時之后，在Pherastar FS儀器上在337nm激發后分別在620和665nm(60ys延遲， 400ys集成)測量Lumi4-鋱和d2的熒光。如圖2中所表明，在NRG存在的情況下觀察到9F7-F11 與HER3受體的劑量依賴性增加，在無NRG的情況下測量到更低的HER3結合。在與NRG共同孵 育之后，9F7-F11與HER3的結合的Kd值被計算為0.47 ± 0.07nM，而在無NRG的情況下，Kd被計 算為2.33 ± 0.30nm;因此表明NRG添加變構地誘導9F7-F11與HER3受體的親和力的6倍增加。 [0202] 實施例3:抗HER3NRG-非競爭性變構抗體9F7-F11抑制HER2和HER3磷酸化，以及阻 斷ERK1/2和AKT磷酸化
[0203] 將五十萬(Five hundred and thousand)個胰腺BxPC3腫瘤細胞添加6-孔培養板 的每個孔中，在37°C持續24小時。在含有1%FCS的RPMI完全培養基中血清饑餓16小時并進 一步洗滌后，將細胞與50μg/ml濃度的抗體9F7-F11或陰性對照抗體在37°C預孵育15分鐘或 1小時，然后洗滌并隨后用NRG的100ng/ml稀釋液刺激或不刺激。然后將細胞洗滌、破碎并用 含有20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、1.5mM MgCl2、lmM EDTA、l%Triton、10%甘油、 0.1 mM苯基甲基磺酰基氟、lOOmM氟化鈉、ImM原f凡酸鈉(Sigma-Aldrich)以及一片完整的蛋 白酶抑制劑混合物片劑(Roche Diagnostics，Indianapolis, IN)的緩沖液裂解。在30分鐘 孵育時間后，通過離心澄清樣品的不溶級分，并且將細胞裂解物中的蛋白濃度通過 Bradford測定法測定。這些蛋白裂解物與Laemmli緩沖液（l-20iig總蛋白，根據目標和細胞 系)直接混合并在95°C加熱5分鐘。在還原條件下在7%SDS-PAGE上電泳后，將蛋白轉移至聚 偏二氟乙烯膜(Millipore)，其然后在25°C在含有5%脫脂奶粉的TNT緩沖液(Tris 25mM pH 7.4，NaCl 150mM，Tween 0.1%)中飽和1小時。將針對激酶受體或信號轉導激酶以及它們的 磷酸化形式的一抗，在4 °C在TNT-5 % BSA緩沖液中孵育18小時。在TNT緩沖液中洗滌五次后， 適當時添加含有5%脫脂奶粉的TNT緩沖液中的過氧化物酶-偶聯的兔、山羊或小鼠多克隆 抗體(Sigma-Aldrich)，在25°C持續1小時。在TNT緩沖液中洗滌五次后，使用化學發光物質 (Western lightning Plus-ECL,Perkin Elmer)顯現￡口跡。
[0204] 顯著地，9F7-F11抗體阻斷Y1289-HER3和Y1242-HER2上的配體誘導的磷酸化（圖 3)。伴隨地，變構非競爭性抗體9F7-F11誘導Ser473上的Akt磷酸化和Thr202/204上的ERK1/ 2磷酸化的抑制。
[0205] 實施例4:抗HER3NRG-非競爭性變構抗體9F7-F11抑制MDM2表達和磷酸化，以及調 節P53途徑
[0206]類似地，如上所述，將BxPC3腫瘤細胞添加至6孔培養板的各孔，在37 °C持續24小 時。在含有1%FCS的RPMI完全培養基中血清饑餓16小時和進一步洗滌之后，將細胞與50yg/ ml濃度的抗體9F7-F11或陰性對照抗體在37°C預孵育24小時或72小時，然后洗滌和隨后用 NRG的lOOng/ml稀釋液刺激或不刺激。隨后將細胞裂解，用于SDS-PAGE和western印跡，或提 交于RNA提取、逆轉錄和使用適當引物進行定量PCR。如圖4中通過western印跡所表明，9F7-Fl 1處理抑制MDM2表達和磷酸化，并增加p53表達。相關地，9F7-F11治療增加p53可誘導的基 因表達，諸如P21，其涉及細胞周期和增殖的阻斷，和Puma和PERP，其正性調節細胞凋亡，如 Q-PCR所表明（圖5)。相反，在用NRG-非競爭性變構抗體9F7-F11處理之后，分別促進細胞增 殖和抑制細胞凋亡的細胞周期蛋白A2和Bcl2基因表達得到降低（圖5)。
[0207] 實施例5:抗HER3NRG-非競爭性變構抗體9F7-F11將細胞周期阻斷于G1期中、抑制 增殖并恢復細胞凋亡
[0208] 使用碘化丙啶染色評估HER3特異性Ab 9F7-F11對細胞周期的影響。簡言之，將 300，000個BxPC3腫瘤細胞/孔在6孔微量滴定板中培養24小時，然后血清饑餓，并在無FCS的 RPMI培養基中再同步24小時，然后與100μg/ml抗HER3Ab 9F7-F11和100ng/ml NRG共同孵 育。24小時后，將透化的細胞用碘化丙啶染色，然后流式細胞術分析。對于增殖和細胞凋亡 測定，在饑餓前一天，將50,000個8設03細胞/孔鋪板(在1^1〇-1%?03中）。然后添加冊1?特 異性Ab 9F7-F11和NRG，持續120小時。在培養的最后30小時過程中，通過摻入Alexa Fluor 488-偶聯的5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EdUKlnvitrogen)測量細胞增殖。通過與熒光偶聯的 膜聯蛋白V和7-氨基放線菌素D(7-AAD;B eckman-C〇ulter)孵育評價細胞凋亡。所有實驗一 式三份進行。對于胱天蛋白酶-9分析，如上所述處理和裂解BxPC3細胞。細胞裂解物的SDS-PAGE和western印跡之后，使用適當抗體證明胱天蛋白酶-9通過酶原的切割的活化。如圖6 中所示，變構9F7-FllAb的24小時處理將細胞周期阻斷于G1期中，其中G1期細胞從未處理或 對照Ab處理的細胞的36-38%增加至9F7-F11處理的BxPC3細胞的62%。9?7411處理同時降 低S和G2/m期中的BxPC3細胞的百分數（圖6)。與未處理和對照Ab處理的細胞（圖7A)相比，用 9F7-F1 ImAb處理BxPC3細胞增加早期（18% )和晚期（12 % )細胞凋亡，伴隨胱天蛋白酶-9酶 原的切割，這發動線粒體細胞凋亡（圖7B)。最終，用9F7-F1 lAb處理120小時之后，BxPC3細胞 增殖得到抑制。在ffiR2teBxPC3細胞上，用單獨的抗HER2曲妥珠單抗沒有觀察到對細胞增殖 的特定影響，而抗EGFR西妥昔單抗與抗HER3Ab 9F7-F11相比效率較低（圖8)。相反，mAb 9F7-F11和曲妥珠單抗的組合對于抑制細胞增殖比9F7-F11/西妥昔單抗組合更有效，表明 曲妥珠單抗/9F7-F11組合對HER2?腫瘤細胞的可能協同效應相比于西妥昔單抗/9F7-F11組 合對HER2?腫瘤細胞的累加效應。綜上，這些結果表明，NRG-非競爭性變構抗HER3抗體9F7-F11將細胞周期阻斷于G1期，通過胱天蛋白酶-9酶原切割恢復早期和晚期線粒體凋亡，并抑 制腫瘤細胞的增殖。在這種情況下，mAb 9F7-F11與抗HER2Ab的組合可以在HER2?腫瘤中具 有很大興趣。
[0209]實施例6:抗HER3NRG-非競爭性變構抗體9F7-F11誘導乳腺癌細胞的抗體依賴性的 細胞的細胞毒性
[0210] 在ADCC測定之前一天，將來源于基底樣三陰性乳腺癌的MDA-MB-453腫瘤目標細胞 以20,000個細胞/孔鋪板于平底96孔微量板。1?從-1?-453細胞系表達約180,000個冊1?2受體 和21，000個HER3受體，而沒有觀察到EGFR表達。在培養基中洗滌之后，在30分鐘過程中以10 μg/ml添加9F7-FllmAb，然后添加來源于外周血單核細胞（PBMC)的效應細胞。通過在 "EtablissementFrat^aisdu Sang"獲得的來自健康供體的血液樣品的密度梯度離心來制 備PBMC。將效應/目標(E/T)細胞在濕潤細胞培養箱中以15/1E/T比率孵育24小時。通過使用 細胞毒性檢測試劑盒(LDH檢測試劑盒;Promega G-1780)根據制造商的說明測量從受損細 胞的乳酸脫氫酶(LDH)釋放來評價MDA-MB-453目標細胞的殺死。簡言之，將50yl細胞上清液 小心地轉移至新的平底96孔微量板，并將來自試劑盒的LDH反應混合物(50yl/孔)孔添加至 各孔。在37°C孵育30分鐘之后，添加50yl終止溶液(在試劑盒中可得)并測量在490nm的光密 度。對于各實驗設置以下對照:單獨的PBMC，單獨的MDA-MB-453靶細胞（自發的LDH釋放），靶 細胞與PBMC(抗體依賴性的自發釋放），靶細胞與裂解緩沖液(最大的LDH釋放），PBMC與Ab， 靶細胞與Ab。使用下式測定各樣品的百分比特異性裂解:百分比特異性裂解=(樣品值-自 發釋放)/(最大釋放-自發釋放)*1〇〇。如圖9中所示，使用來自健康供體1和2的TOMC，9F7-F1 lAb誘導MDA-MB-453乳腺癌細胞的5%至10%特異性細胞裂解。在相同實驗中，陽性對照 曲妥珠單抗誘導約40 %裂解，這是由于MDA-MB-453表達比HER3受體多十倍的HER2受體。
[0211] 實施例7:用HER2擴增的MDA-MB-361和三陰性MDA-MB-468乳腺癌異種移植的小鼠 中的9F7-F11單一療法
[0212] 無胸腺的6至8_周齡雌性BALB/c裸小鼠購自Janvier和Charles Rivers Laboratories。將 HER2-擴增的/PIK3CA-突變的乳腺癌細胞 MDA-MB-361 (10xl06)和 HER2-非 擴增的/PTEN-突變的/p53-突變的/ER-/PR-三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-468(3.5xl0 6)皮下 注射至無胸腺的BALB/c裸小鼠的右腹側中。它們均以低水平（約10,000個受體/細胞)表達 HER3受體。所有體內實驗都依照法國實驗動物研究指南(協議號B34-172-27)進行。
[0213] 當腫瘤達到約100mm3的體積時，將荷瘤小鼠隨機化至不同的處理組中。小鼠通過 腹膜內注射J1ER3-特異性抗體9F7-F11相比于媒介物(PBS)進行處理。注射的抗體的量為300 yg/注射（15mg/kg)，一周三次，連續持續6周（Q2D-6W)。腫瘤大小用卡尺每周測量兩次并且 通過公式DlxD2xD3/2計算體積。腫瘤進展使用公式[(最終體積)-(初始體積）]/(初始體積） 來計算。結果也通過1^?1311-]/[6161'存活曲線表示，其使用腫瘤達到2,0001]11]1 3的確定最終體 積所花費的時間。中值延遲定義為50%的小鼠具有達到確定體積的腫瘤的時間。
[0214]如圖10中所示，我們觀察到，相對于在用媒介物處理的小鼠中測量的平均腫瘤大 小，在腫瘤移植后第55天（對應于抗體處理的結束；第40天），在9F7-F11-處理的小鼠中， MDA-MB-361腫瘤生長顯著降低47±5%(p〈0.001)。在實驗結束時（97天），在9F7-F11治療組 中觀察到腫瘤大小的較小、但顯著的21 ±2%減小，這可能是因為從57天起停止9F7-F11處 理。
[0215] 如圖11A中所示，與對照(媒介物）中相比，在9F7-F11處理的用MDA-MB-468細胞異 種移植的小鼠中，平均腫瘤體積顯著減小（用9F7-F11處理之后，在異種移植后第105天，體 積減少35% )。在用MDA-MB-468細胞異種移植的動物中，用9F7-FllAb處理使50%中值生存 時間顯著延遲20天(在實驗結束時，即190天;對于9F7-F11處理組，穩定一只小鼠；p〈0.05)。 綜上，這些結果表明，在用HER2-擴增或三陰性乳腺癌細胞系異種移植的小鼠中，NRG-非競 爭性變構抗HER3Ab 9F7-F11延遲腫瘤生長。
[0216]實施例8:在用嗜NRG的BXPC3胰腺癌異種移植的小鼠中的9F7-F11與帕妥珠單抗的 組合治療
[0217]我們先前表明，治療性抗體曲妥珠單抗與其它靶向療法的組合表明對具有低HER2 表達的胰腺癌的協同作用(Larbouret，2007，2010)。我們現在在HER#胰腺癌中評價與變構 抗HER3Ab 9F7-F11和抗HER2Ab帕妥珠單抗的組合治療。用分泌神經調節蛋白（嗜NRG的）的 HER2,夷腺BxPC-3細胞(4.5xl06)皮下注入六周齡雌性無胸腺小鼠的右腹側。當腫瘤達到 100mm3的體積時，將荷瘤小鼠隨機分配至不同處理組(至少6只動物/組），然后用2或10mg/ kg帕妥珠單抗、10mg/kg 9F7-F11或帕妥珠單抗加上9F7-F11的組合（10mg/kg各mAb)處理。 每周兩次腹膜內（i .P.)給予抗體，持續4周(Q3D-4W)。通過下式計算腫瘤體積:Dix D2X D3/ 2。對于生存比較，當腫瘤達到1000mm3的體積時，處死小鼠。
[0218]與未處理組相比，兩種單獨的抗體均明顯減慢腫瘤生長（p〈0.001)，并且在抗 HER3Ab 9F7-F11和帕妥珠單抗之間沒有觀察到顯著差異（p = 0.6488)(圖12A)。與對照相 比，50%中值生存時間在用9F7-F11處理的小鼠中顯著延遲了 17天，且在用帕妥珠單抗處理 的小鼠中顯著延遲了23天（圖12A)。此外，與各單獨抗體相比，用9F7-F11和帕妥珠單抗共處 理對腫瘤生長的抑制高得多（帕妥珠單抗相比于9F7-F11/帕妥珠單抗;p = 0.004)。在4周處 理結束時，腫瘤體積在用單獨的9F7-F11或帕妥珠單抗處理的小鼠中保持增加，而其在接受 9F7-F11/帕妥珠單抗組合的動物中仍然相當穩定（圖12A)。與對照動物(42天的增益;p = 0.0001)或接受單一抗體的小鼠中相比，中值存活時間在用雙抗體組合處理的動物中更長 (9卩7-?11/帕妥珠單抗￥89?7-?11^ = 0.0013;9?7-?11/帕妥珠單抗￥8帕妥珠單抗口 = 0.0355)(圖12A)。最后，抗HER3Ab 9F7-F11和帕妥珠單抗的組合比帕妥珠單抗/曲妥珠單抗 組合顯著更有效，其中用9F7-F11/帕妥珠單抗處理的動物中的平均存活時間（42天）比用帕 妥珠單抗/曲妥珠單抗處理的動物中（13天)更長(圖12B)。綜上，這些結果表明，與使用兩種 HER2特異性抗體的組合療法相比，使用NRG-非競爭性變構抗HER3Ab 9F7-F11和抗HER2帕妥 珠單抗在腫瘤中更有效。
[0219]實施例9: HER3敲除消除用嗜NRG的BXPC3胰腺癌異種移植的小鼠中的9F7-F11體內 功效
[0220] 基于Lee-Hoeflich等.（2008)的工作，如支持材料和方法中所述，選擇兩種短發夾 寡核苷酸以敲低ffiR3mRNA水平。對照載體(shCTRL)pSIREN-shLuc由L.Le Cam惠贈且如先前 所述(Le Cam等，2006)。然后將含有嘌呤霉素N-乙酰基轉移酶抗性基因的pSIREN-shHER3和 pSIREN-shLuc轉染于兼嗜性包裝細胞系AmphoPack_293(Clontech)中。2天后，收集含有復 制缺陷的病毒顆粒的上清液并用于感染BxPC3細胞。兩天后開始抗生素選擇（10iig/ml嘌呤 霉素）。選擇7天后，將細胞亞克隆并基于內源性HER3蛋白表達的不存在進行選擇。如上所述 用親本shHER3(3.5xl0 6)或對照shLuc BxPC-3細胞（4.5xl06)皮下注入購自Harlan(Le Ma 1 cour 1 et，France)的六周齡雌性無胸腺小鼠的右腹側。當腫瘤達到100mm3的體積時，將 荷瘤小鼠隨機分配至不同處理組(至少6只動物/組），然后用10mg/kg 9F7-F11腹膜內處理， 每周兩次，持續4周(Q3D-4W)。
[0221] 為了證實HER3表達和9F7-F11體內治療功效之間的關系，用shHER3或shCTRL BxPC-3細胞異種移植小鼠（圖13A)。與我們的體外數據一致，與未處理的對照相比，NRG-非 競爭性變構抗J1ER3抗體9F7-F11顯著抑制shCTRL BxPC-3腫瘤異種移植物的生長(p〈0.0001 和p = 0.0015)(圖13A)。相反，與未處理的對照相比，在用shHER3BxPC-3癌細胞異種移植且 用9F7-FllAb處理的小鼠中沒有觀察到顯著的腫瘤生長消退（圖13A)。在實驗結束時，在分 離自處理小鼠的shHER3BxPC-3腫瘤異種移植物中，HER3表達仍然沉默（圖13B)。這些結果表 明，HER3敲低在體內消除NRG-非競爭性變構抗HER3抗體9F7-F11的治療功效。
[0222] 參考文獻：
[0223]在整個本申請中，各個參考文獻描述了本發明所屬技術領域的狀態。這些參考文 獻的公開內容通過引用并入本公開中。
【主權項】
1. 一種神經調節蛋白非競爭性變構抗人HER3抗體，其包含重鏈，其中可變結構域包含： -與如SEQ ID NO:2所示的序列具有至少90%或95%同一性的H-CDR1， -與如SEQ ID NO:3所示的序列具有至少90%或95%同一性的H-CDR2， -與如SEQ ID NO:4所示的序列具有至少90%或95%同一性的H-CDR3， -與如SEQ ID NO:6所示的序列具有至少90%或95%同一性的L-CDR1， -與如SEQ ID NO:7所示的序列具有至少90%或95%同一性的L-CDR2， -與如SEQ ID N0:8所示的序列具有至少90%或95%同一性的L-CDR3,且 -所述抗體特異性結合HER3,其親和力與下述抗體基本上相同，所述抗體包含其中可變 結構域包含H-CDR1 的SEQ ID N0:2、H-CDR2的SEQ ID N0:3和H-CDR3的SEQ ID N0:4的重鏈， 以及其中可變結構域包含L-CDR1的SEQ ID N0:6、L-CDR2的SEQ ID N0:7和L-CDR3的SEQ ID NO :8的輕鏈。2. 權利要求1所述的抗體，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含H-CDR1區中的SEQIDN0:2、H-CDR2區中的SEQIDN0:3和H-CDR3區中的SEQIDN0:4 ;且所述 輕鏈可變區包含L-CDR1區中的SEQ ID N0:6、L-CDR2區中的SEQ ID N0:7和L-CDR3區中的 SEQ ID N0:8。3. 權利要求1所述的抗體，其中所述抗體的重鏈可變區具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基 酸序列和/或所述輕鏈可變區具有如SEQ ID N0:5所示的氨基酸序列。4. 權利要求1所述的抗體，其為嵌合抗體，優選為嵌合小鼠/人抗體。5. 權利要求1所述的抗體，其為人源化抗體。6. 根據權利要求1-5中任一項所述的抗體的片段。7. 權利要求6所述的片段，其包含VL或VH鏈。8. 權利要求6所述的片段，其選自Fv、Fab、F(ab'）2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2和雙特異 性抗體。9. 一種核酸序列，其編碼根據權利要求1-5中任一項所述的抗體或根據權利要求5-8中 任一項所述的片段。10. -種核酸序列，其編碼根據權利要求1至7中任一項所述的單克隆抗體的重鏈或輕 鏈。11. 權利要求10所述的核酸序列，其為SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10。12. -種載體，其包含根據權利要求10或11所述的核酸序列。13. -種宿主細胞，其包含根據權利要求10或11所述的核酸或根據權利要求12所述的 載體。14. 一種藥物組合物，其包含根據權利要求1-5中任一項所述的抗體或其根據權利要求 6-8中任一項所述的片段。15. 根據權利要求1-5中任一項所述的抗體或其根據權利要求6-8中任一項所述的片 段，其用作藥物。16. -種用于治療受試者中的癌癥的方法，其包括向所述受試者施用根據權利要求1-7 中任一項所述的抗體或其根據權利要求6-8中任一項所述的片段。17. 根據權利要求1-7中任一項所述的抗體或其根據權利要求6-8中任一項所述的片 段，其用于癌癥的診斷中。
【文檔編號】A61K39/395GK105849125SQ201380081577
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2013年11月7日
【發明人】T·查爾德斯, N·加博里, C·拉鮑雷特, A·佩勒格林
【申請人】國家醫療保健研究所, 蒙彼利埃大學, 蒙彼利埃地區癌癥研究所