一種病毒基因組引物及用該引物檢測病毒基因組的方法
【專利摘要】本發明涉及一種引物，尤其是涉及一種病毒基因組引物及運用其檢測病毒基因組的方法。一種病毒基因組引物，包括如SEQ ID NO:1?SEQ ID NO:8所示的八條核苷酸序列。采用了本發明所述的病毒基因組的引物，克服了現有技術中采用傳統隨機引物RP檢測靈敏度低的缺點，通過分析NCBI病毒庫中所有參考病毒基因組序列，篩選出能夠廣泛識別參考病毒基因組的寡核苷酸序列，并在該序列的基礎上建立了一種病毒基因組檢測技術，既滿足廣泛識別病毒基因組的最基本的需要，又達到提高檢測病毒基因組的靈敏度的更高目標。
【專利說明】
一種病毒基因組引物及用該引物檢測病毒基因組的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種引物，尤其是涉及一種病毒基因組引物及運用其檢測病毒基因組 的方法。
【背景技術】
[0002] 2009年，Victoria，J.G等人在國外著名雜志Journal of Virology上發表了一篇 關于新型腸道病毒發現的文章 （Metagenomic analyses of viruses in stool samples from children with acute flaccid paralysis.J Virol,2009.83(9):p.4642_51)，公開 了一種能夠非特異識別和擴增未知病毒基因組的方法，該方法利用隨機引物RP能夠識別所 有病毒的核苷酸序列的特點，對不明病因的病例標本進行檢測，從而對不明疾病的病因進 行診斷，但是利用隨機引物RP的未知病毒檢測方法的靈敏度普遍偏低，只能檢測到至少含 有1〇5個病毒顆粒的臨床樣本，這就極大地限制了該方法直接在臨床診斷中的應用，究其原 因，主要是由于隨機引物RP中二聚體的廣泛大量存在，大大降低了隨機引物RP中有效引物 的濃度。
[0003] 有鑒于此，特提出本發明。
【發明內容】
[0004] 本發明提供一種可以廣譜的識別和擴增病毒基因組的引物以及包含該引物的試 劑盒。
[0005] 另一方面，本發明提供該病毒基因組引物和該試劑盒在檢測病毒基因組方面的應 用。
[0006] 另一方面，本發明提供一種運用病毒基因組引物檢測病毒基因組的方法。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明采用技術方案的基本構思是:一種病毒基因組引物， 包括如SEQIDN0:1-SEQIDN0:8所示的八條核苷酸序列。 SEQ ID NO: 1 GACCATCTAGCGACCTCCACCTNCTNYT; SEQ ID NO:2 GACCATCTAGCGACCTCCACCTNTTRYT;
[0008] SEQ ID N0:3 GACCATCTAGCGACCTCCACTTRCTNYT; SEQ ID N0:4 GACCATCTAGCGACCTCCACTTRTTRYT; SEQ ID N0:5 GACCATCTAGCGACCTCCACAGYAGYYT; SEQ ID N(3:6 GACCATCTAGCGACCTCCACAGYTCNYT;
[0009] SEQ ID N(3:7 GACCATCTAGCGACCTCCACTCNAGYYT; SEQ ID NO:8 GACCATCTAGCGACCTCCACTCNTCNYT;
[0010] 兼并堿基 N: A/T/C/G; R: A/G; Y: C/T。
[0011] 如上所述的病毒基因組引物在檢測病毒基因組方面的應用。
[0012] -種試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的病毒基因組引物。
[0013] -種如上所述的試劑盒在檢測病毒基因組方面的應用。
[0014] 用如上所述的病毒基因組引物檢測病毒基因組的方法，包括如下步驟：
[0015] 1)合成如權利要求1所述的病毒基因組引物；
[0016] 2)對樣本前處理和消化；
[0017]用離心機離心5分鐘，取上清液用0.22μπι的濾器過濾，將得到的樣本采用70U的 DNase I，8U的TURBO DNase和50yg的RNase Α在37°C溫度下消化90分鐘；
[0018] 3)第一鏈的合成；
[0019]提取樣本中包含的DNA病毒/RNA病毒的核酸成分，溶解到20yL無核酶的去離子水 中，生成核酸提取液;同時將提取到的核酸提取液，用權利要求1所述的病毒基因組引物，對 病毒的RNA基因組進行逆轉錄，生成DNA第一鏈；
[0020] 4)第二鏈的合成和PCR反應；
[0021] 將步驟3)得到的病毒的核酸提取液和第一鏈溶液，采用如權利要求1所述的病毒 基因組引物擴增得到DNA第二鏈；
[0022] 將DNA第一鏈和DNA第二鏈組成的DNA雙鏈液進行抽提；
[0023] 將抽提后的DNA雙鏈液用SEQ ID N0:9引物進行PCR反應；
[0024] 5)PCR產物的克隆和序列測定；
[0025] 將PCR產物連接到載體上構建克隆庫，通過藍白斑篩選有插入的克隆并進行測序；
[0026] 藍白斑篩選是重組子篩選的一種方法:是根據載體的遺傳特征篩選重組子，如α- 互補、抗生素基因等。現在使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段，其中有β- 半乳糖苷酶基因（lacZ)的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了 一個多克隆位點(MCS)，它并不破壞讀框，但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨 基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此， 宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學活性的蛋白 質。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒 之間實現了互補，稱為互補。由互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下，在生 色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位 點后，幾乎不可避免地導致無互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白 色菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化 菌平板37°C溫箱倒置培養12-16hr后，有重組質粒的細菌形成白色菌落。
[0027] 6)數據的處理和分析；
[0028]將測序得到的核苷酸序列進行剪切，去除載體部分的序列，并剔除不含有SEQ ID N0:9引物序列的核苷酸序列，與數據庫進行比對，找到最匹配的病毒種/株后，綜合分析所 有的序列信息，判斷該樣本中含有的病毒種類。
[0029] 進一步的，所述步驟4)中PCR反應條件如下：1個循環的95°C5min，35個循環的95°C 158〇。，50。(：1586。，721€211^11，1個循環的721€711^11。
[0030]采用上述技術方案后，本發明與現有技術相比具有以下有益效果:采用了本發明 所述的病毒基因組的引物，克服了現有技術中采用傳統隨機引物RP檢測靈敏度低、對臨床 樣本中低濃度的病毒釀別效果差的缺點，通過分析NCBI病毒庫中所有參考病毒序列，篩選 出能夠廣泛識別參考病毒基因組的寡核苷酸序列，并在該序列的基礎上建立了一種病毒基 因組檢測技術，能夠檢測到臨床樣本中濃度更低的病毒基因組序列，既滿足廣泛識別病毒 基因組的最基本的需要，又達到提高檢測病毒基因組的靈敏度的更高目標。
【附圖說明】
[0031]圖1是本發明病毒基因組引物與隨機引物RP靈敏度的比較圖。
【具體實施方式】
[0032]以下結合具體實施例和附圖對本發明做進一步解釋說明。
[0033]本發明是在傳統隨機引物聚合酶鏈式反應(rPCR)的基礎上，將本發明篩選的病毒 基因組引物(PVGPs)代替rPCR中的隨機引物RP，來檢測病毒基因組的方法，具體技術方案如 下：
[0034] 1、合成病毒基因組引物
[0035] 本發明涉及共計八組包含兼并堿基的核苷酸引物，每組引物合成量為5~100D(見 下表），根據其合成量用相應體積的TE溶液溶解成1 ΟΟμΜ濃度的引物溶液，根據每組引物包 含的引物條數，計算PVGPs混合液中應該含有每組引物的體積，將這八組引物溶液按照下表 最后一列的體積混合，即本發明的PVGPs。本發明PVGPs中每條引物的濃度是相等的（均為 2.78μΜ)，具體過程如下表1所示：
[0036] 表1病毒基因組引物的合成和配制
[0037]
[0039] 2、樣本前處理和消化
[0040]為了盡量去除樣本中的細胞成分、細菌成分和較大顆粒物質，需要對樣本進行前 處理。用離心機在最高的轉速，如13,000轉/分鐘、離心5分鐘，取上清液用0.22μπι的濾器 (Millipore)過濾。
[0041 ] 為了將破碎細胞和細菌基因組的DNA和RNA去除，需要對樣本進行DNase/RNase雞 尾酒消化處理。米用70U的DNase I (Takara)，8U的TURBO DNase (Invi trogen)和50yg的 RNase A(Takara)在37°C溫度下消化90分鐘。
[0042] 3、病毒的核酸提取及RNA病毒的逆轉錄
[0043] 將消化后的樣本按照PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit(Invitrogen，病毒DNA/ RNA純化試劑盒)的產品說明書操作，提取樣本中包含的DNA病毒/RNA病毒的核酸成分，并最 終溶解到20yL無核酶的去離子水中，生成核酸提取液。
[0044] 若要檢測樣本中的RNA病毒，需要按照Superscript III RT kit(Invitrogen)的 產品說明書，采用本發明的PVGPs對病毒的RNA基因組進行逆轉錄，生成cDNA鏈(第一鏈），然 后用E.coli RNase H(Invitrogen)與cDNA鏈在37°C作用20分鐘，去除其中的RNA鏈，生成 cDNA 液。
[0045] 4、第二鏈的合成和聚合酶鏈式反應(PCR)
[0046] 采用病毒的核酸提取液和cDNA溶液，使用Klenow fragment(Invitrogen)試劑，采 用本發明的PVGPs合成DNA第二鏈。所生成的DNA雙鏈采用酚氯仿溶液進行抽提，重懸到20yL 無核酶的去離子水中，生成DNA雙鏈液。
[0047] PCR反應需要按照AmpliTaq Gold(Invitrogen)的產品說明書，采用SEQ ID N0:9 引物對DNA雙鏈液進行擴增，反應條件如下：1個循環的95°C5min，35個循環的95°C 15sec，50 。(：158〇。，721€211^11，1個循環的721€711^11。
[0048] 所述的SEQ ID 從):9引物為6厶0^1'0^6〇6厶0^0^(：。
[0049] 5、PCR產物的克隆和序列測定
[0050] PCR產物按照Pu丨·eLink'SQuick Gel Extraction Kit(Invitrogen)的說明書，切 膠回收l〇〇bp~1000bp之間的片段；按照ΤΟΡΟ1?ΤΑ cloning vector(Invitrogen)的說明 書，將PCR產物連接到載體中構建克隆庫。轉化感受態細菌DH5abacterial cells(Takara)， 通過藍白斑篩選有插入的克隆進行測序。
[0051] 6、數據的處理和分析
[0052]將測序得到的核苷酸序列進行剪切，去除載體部分的序列，并剔除不含有SEQ ID NO: 9序列的核苷酸序列，采用BLAST程序(http://blast.ncbi .nlm.nih.gov/Blast.cgi)與 美國國立生物技術信息中心(NCBI)的nr/nt數據庫進行比對，找到最匹配的病毒種/株，然 后綜合分析所有的序列信息，判斷該樣本中含有的病毒種類。
[0053]對本發明病毒基因組引物PVGPs和隨機引物RP采用上述方法，對不同濃度模式病 毒，以脊髓灰質炎病毒(human poliovirus)疫苗株為例，分別進行檢測，結果發現，如圖1所 示，在高濃度病毒組（1 X 106PFU/100yL和1 X 105PFU/100yL)，兩種引物對脊髓灰質炎病毒的 識別能力上不存在顯著差異（P分別為0.172和0.674，α = 〇.〇5);在低濃度病毒組IX 104PFU/100yL時，本發明病毒基因組引物PVGPs在隨機挑選的50個克隆中脊灰病毒的識別 率為58 %，比傳統的隨機引物RP的識別率8 %有顯著提高（X2 = 26.046，p = 0.000，α = 0.05);在最低濃度病毒組1 X 103PFU/100yL時，本發明引物PVGPs仍然能夠檢測到12%的脊 灰病毒基因組，而RP根本檢測不到。以上結果說明依賴本發明病毒基因組引物PVGPs比依賴 隨機引物RP具備更高的靈敏度。
[0054]為了能夠反映本發明在所有的參考病毒基因組上的擴增效果，本發明還在現有的 參考病毒基因組序列上進行模擬擴增，即以每條病毒基因組為模板，用本發明的PVGPs進行 正反向的識別，根據病毒基因組與PVGPs結合結果、將每條可能擴增的片段按照不同的片段 長度（1 ~99bp、100 ~399bp、400 ~699bp、700 ~999bp、1000~1299bp、1300 ~1599bp、1600 ~1899bp、1900~2199bp和2 2200bp)進行統計，其中所述的病毒基因組為4244個，按照不 同的病毒類型分為六類，六類病毒類型如下:double_strand DNAWsDNAhirusesjingle- strand DNA(ssDNA)viruses , double-strand RNA(dsRNA)viruses , single-strand positive RNA(ssRNA( + ))virus , single-strand negative RNA(ssRNA(-))virus and retrovirus (RT) virus。模擬擴增的結果顯示，幾乎所有的病毒基因組都能夠被PVGPs識別 擴增，除了以下5個病毒的基因組，如ssDNA病毒中的Mulard duck circovirus(accession: NC_005053，來源于鴨子，長 2kb)，Circovirus-l ike genome SAR_A( access ion: NC_013030， 來源于馬尾藻海，長 1.74kb)，Acartia tonsa copepod circovirus isolate 154_D11 (accession: NC_020099，來源于海洋燒足類，長1 · 67kb)，dsRNA病毒中的Gremmeni el la abietina RNA virus MS2(accession:NC_006444，NC_006445和NC_006446,來源于針葉林， 長1.19kb~1.78kb)和ssRNA( + )病毒中的Saccharomyces 23S RNA narnavirus(GI: 21557568,來源于酵母，長2.89kb)。可見PVGPs能夠識別并擴增已知幾乎全部的病毒基因組 包括來自各種動物、植物、細菌及真菌等物種的病毒。
[0055]本發明的病毒基因組引物(PVGPs)比傳統的隨機引物RP能夠更靈敏地檢測到樣本 中少量的病毒核酸序列，這一發明使病毒基因組引物檢測技術在臨床傳染病例的病原診斷 尤其是未知病原的診斷上能夠得以廣泛應用。
[0056]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種病毒基因組引物，其特征在于，包括如SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:8所示的八條核 苷酸序列。2. 權利要求1所述的病毒基因組引物在檢測病毒基因組方面的應用。3. -種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的病毒基因組引物。4. 權利要求3所述的試劑盒在檢測病毒基因組方面的應用。5. 用權利要求1所述的病毒基因組引物檢測病毒基因組的方法，其特征在于，包括如下 步驟： 1) 合成如權利要求1所述的病毒基因組引物； 2) 對樣本前處理和消化； 用離心機離心5分鐘，取上清液用0.22μπι的濾器過濾，將得到的樣本采用70U的DNase I，8U的TURBO DNase和50yg的RNase A在37°C溫度下消化90分鐘； 3) 第一鏈的合成； 提取樣本中包含的DNA病毒/RNA病毒的核酸成分，溶解到20yL無核酶的去離子水中，生 成核酸提取液；同時將提取到的核酸提取液，用權利要求1所述的病毒基因組引物，對病毒 的RNA基因組進行逆轉錄，生成DNA第一鏈； 4) 第二鏈的合成和PCR反應； 將步驟3)得到的病毒的核酸提取液和第一鏈溶液，采用如權利要求1所述的病毒基因 組引物擴增得到DNA第二鏈； 將DNA第一鏈和DNA第二鏈組成的DNA雙鏈液進行抽提； 將抽提后的DNA雙鏈液用SEQ ID N0:9引物進行PCR反應； 5 )PCR產物的克隆和序列測定； 將PCR產物構建克隆庫，篩選有插入的克隆并進行測序； 6)數據的處理和分析； 將測序得到的核苷酸序列進行剪切，去除載體部分的序列，并剔除不含有SEQ ID N0:9 引物序列的核苷酸序列，與數據庫進行比對，找到最匹配的病毒種/株后，判斷該樣本中含 有的病毒種類。6. 如權利要求5所述的檢測病毒基因組的方法，其特征在于，所述步驟4)中PCR反應條 件如下：1 個循環的 95°C5min，35 個循環的 95°(：1586(3,50°(：1586(3,721€2111丨11，1個循環的721€ 7min〇
【文檔編號】C12N15/11GK105838827SQ201610347518
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】李仁清, 黃芳, 吳疆, 龐星火, 賀雄, 鄧瑛, 馬彥, 劉秀穎, 龔成, 陳萌, 鄒清華
【申請人】北京市疾病預防控制中心