實時熒光pcr技術定量檢測myd88基因l265p突變的方法、引物和探針的制作方法
【專利摘要】本發明提供了實時熒光PCR技術定量檢測MYD88基因L265P突變的方法、引物和探針，并建立了MYD88第265位氨基酸突變型和野生型之間的ΔCT值與突變比例之間的指數方程關系，用以確定突變比例的方法。所述方法通量大，準確度高，適于輔助臨床診斷。
【專利說明】
實時熒光PCR技術定量檢測MYD88基因 L265P突變的方法、引物 和探針
技術領域
[0001 ]本發明屬生命科學和生物技術領域，特別涉及一種采用MGB探針及實時熒光PCR技 術定量檢測MYD88基因 L265P突變及其突變比例的方法及引物。實時熒光PCR技術經濟成熟， 通量大，適于輔助臨床診斷。
【背景技術】
[0002] 淋巴衆細胞淋巴瘤(Lymphoplasmacytic lymphoma，LPL)為淋巴結髓質區B細胞腫 瘤，由小B淋巴細胞、漿細胞樣淋巴細胞和漿細胞組成；常侵潤骨髓，有時也累及淋巴結和 脾。當LPL侵犯骨髓，同時伴有血清中單克隆免疫球蛋白IgM分泌，則被稱為華氏巨球蛋白血 癥（Waldenstrom macroglobulinemia，WM)〇
[0003] 盡管LPL具有產生單克隆免疫球蛋白IgM的特征，但仍有約5%的患者為IgA型或 IgG型，甚至為不分泌型。而其他B系腫瘤，如結內邊緣區淋巴瘤（Nodal marginal zone lymphoma，NMZL)、脾邊緣區淋巴瘤（Splenic marginal zone lymphoma，SMZL)、慢性淋巴細 胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia，CLL);甚至IgM分泌型多發性骨髓瘤(Multiple myeloma，麗)均能有單克隆免疫球蛋白IgM的存在。故有時候僅從腫瘤的臨床表現和病理特 征是無法明確區分LPL和其他腫瘤，特別是SMZL的。
[0004] MYD88基因 L265P突變見于約90%LPL/WM(淋巴漿細胞淋巴瘤/Waldenstrom巨球蛋 白血癥）。而SMZL、CLL伴漿細胞分化及IgM分泌型MM中則罕見甚至無 MYD88基因突變。故該基 因突變可用于LPL/WM的鑒別診斷。MYD88基因突變也是預后判斷的指標，伴突變的LPL/WM患 者預示著疾病進展緩慢且生存期更長。此外，MYD88基因突變也是疾病治療的靶標和微小殘 留病灶(MRD)監測的分子標志。
[0005] 目前用于MYD88基因 L265P突變的方法有：Sanger測序法和AS-PCR法。Sanger測序 法盡管被認為是金標準，但是其靈敏度低，只能檢測到突變比例>20%的突變峰。而LPL/WM 患者受檢樣本通常為骨髓，其骨髓樣本中所含的腫瘤細胞本身就低。除非通過CD19+篩選出 B細胞，否則Sanger測序檢測結果的假陰性率會達到30%-50%。而通過⑶19+揀選出腫瘤細 胞是個繁重的過程，不適用于臨床常規診斷使用。故AS-PCR法被美國NCCN指南推薦為 MYD88L265P突變檢測的基本方法，其靈敏度可以達到1 %甚至1 %以下。
[0006] AS-PCR法雖然靈敏度高，但其檢測過程相對繁瑣，需要進行瓊脂糖凝膠電泳分析， 容易造成污染。同時結果判斷相對主觀，沒法進行突變比例的準確定量。用于患者的輔助診 斷尚可，但不適用于患者的MRD檢測。
【發明內容】
[0007] 鑒于目前檢測MYD88L265P突變的方法不能兼顧靈敏度高、方便快捷和相對定量的 需求，本發明考慮使用MGB探針結合實時熒光PCR技術的方法對L265P突變進行相對定量檢 測，以滿足臨床對靈敏度高、檢測流程簡便和MRD監測的需求。
[0008] 一種用于MGB探針結合實時熒光PCR技術檢測MYD88L265P突變的引物和探針，所述 引物和探針的核苷酸序列如下：
[0009] MYD88QF：CCTTGGCTTGCAGGTGC
[0010] MYD88QR：AGGATGCTGGGGAACTCTTT
[0011] MYD88-WP：HEX-AAGCGACTGATCC-MGB
[0012] MYD88-MP：FAM-AAGCGACCGATCC-MGB
[0013]本發明還提供了使用熒光PCR中FAM通道和HEX通道，在一管PCR反應體系中分別檢 測MYD88第265位氨基酸突變型和野生型，并通過兩者的Δ CT值與突變比例之間建立指數方 程關系。其方法如下：
[0014] ⑴合成MYD88L265P突變型和野生型質粒（由寶生物工程大連有限公司合成）；
[0015] ⑵將兩種質粒均稀釋至2ng/ul;
[0016] ⑶按如下表格配置成不同突變比例的混合物；
[0017]
[0018] 12345 ⑷將12個質粒混合物按不同批次重復檢測至少3次，計算Δ CT = CT效-CT敕將Δ CT值作為X，突變比例作為Y(圖1)，擬合曲線如下： 2 ①y = 0 · 4688e ~ [ -0 · 4027 (x+1) ]R2 = 0 · 9834 (1 · 25-60 % ) 3 ②y = 1-0 · 5059e~ [0 · 5337(x+l) ]R2 = 0 · 9814(60-100% ) 4 1.25 %-60 %區間以曲線①為計算公式，曲線60-100 %之間以曲線②為計算公式； 即Δ CT>-1.62以曲線①為計算公式，△ CT < -1.62以②為計算公式;FAM(突變型)無擴增曲 線，貝1JCT值統一以50錄入進行計算。 5 指數方程的優點在于:在很多用ACT來計算突變比例的方案中，都會選用線性方 程來建立ACT和突變比例的關系。在擬合曲線時，符合線性關系的突變比例范圍只在20- 80 %之間。< 20 %或> 80 %的突變比例與相應的Δ CT值之間并不符合線性關系，而符合指 數方程。從圖1中可看到突變比例為5 %時，線性方程對應的X值為2.86，指數方程對應的X值 為4.56，重復檢測5%突變比例的樣本8次，X均值為4.96。故指數方程更符合Δ CT與突變比 例之間的關系。因此，當突變比例<20%時，若仍用線性方程計算突變比例的話，會造成假 陰性的情況，不利于微小殘留病灶的監測。
[0024]本發明還提供了使用上述引物、探針及擬合的曲線計算公式檢測樣本中 MYD88L265P相對突變比例的方法，其步驟如下：
[0025] ⑴提取人全血樣本中的DNA。
[0026] ⑵用MYD88QF、MYD88QR、MYD88-WP和MYD88-MP配置熒光PCR檢測體系。PCR反應條件 為:95°(：111^11;95°(：158,601€358,4(^7(3 ;并在60°(：采集熒光信號。
[0027] ⑶分析檢測數據:計算Δ CT = CT^g-CT_，將Δ CT值帶入計算公式求突變比例。若 厶(：1'>-1.62，則突變比例％=0.46886~[-0.4027(叉+1)]\100%;若么(：1'<-1.62，則突變 比例％ = {1-0 · 5059e~ [0 · 5337(x+1) ]} X 100% ;若突變型無擴增曲線，則CT效=50，帶入計 算公式進行計算。
【附圖說明】
[0028] 圖1是本發明曲線擬合中X( ACT)與Y(突變比例)之間的曲線關系圖。
[0029] 圖2A是使用本發明引物探針及方法對第一個待檢樣本進行突變比例檢測的熒光 擴增曲線圖。
[0030]圖2B是使用本發明引物探針及方法對第一個待檢樣本進行突變比例檢測的測序 驗證圖。
[0031] 圖3A是使用本發明引物探針及方法對第二個待檢樣本進行突變比例檢測的熒光 擴增曲線圖。
[0032] 圖3B是使用本發明引物探針及方法對第二個待檢樣本進行突變比例檢測的測序 驗證圖。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明 的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編 的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0034] 實施例1:
[0035] 血液DNA的提取：使用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因組DNA提取 試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司）。取300μ1待檢全血樣本加入1.5ml離心管中，加入 900ul紅細胞裂解液顛倒混勻，lOOOOrpm離心lmin，棄上清;加200uL緩沖液GA，振蕩至徹底 混勻;加入20μ1蛋白酶K溶液，混勻;加入200μ1緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 °C放置10min。再 加200μ1無水乙醇，混勻，將溶液加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm離 心30s，棄廢液；向CB3中加入500μ1緩沖液⑶，12000rpm離心30s，棄廢液；向CB3中加入600μ1 漂洗液PW，12000rpm離心30s，棄廢液；重復一次。再將CB3放回收集管中，12000rpm空離心 2min;并將CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μ1 TE，室溫放 置2-5min，12000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中，所得即為樣本DNA。
[0036] 10X紅細胞裂解液配方為：NH4C1 82g，NaHC03 8.4g，EDTA-Na2 3.72g，加 ddH20定 容至 1000ml。
[0037] 實施例2:
[0038] 熒光PCR:按如下試劑及試劑量配置PCR檢測體系，其中MYD88QF(10yM)和MYD88QR (ΙΟμΜ)各Ο·8ul;MYD88-WP(ΙΟμΜ)和MYD88-MP(ΙΟμΜ)各Ο·3ul;THUNDERBIRD qPCR Mix 12.5ul(東洋紡（上海)生物科技有限公司）；加去離子水8.3ul;最后加 DNA模版2ul。檢測程 序設置如下：檢測探針分別設置為FAM和VIC，一管雙檢;95°Clmin;95°C15s，60°C30s，40f 循環;60 °C時收集焚光信號。
[0039] 實施例3:
[0040] 結果分析：Base 1 ine設置為6-15，閾值線拉至陰性線以上，計算Δ CT = CT突g- CT彩瘦，將ACT值帶入計算公式求突變比例。若ACT>-1.62,則突變比例％=0.4688^[- 0.4027(叉+1)]\100%;若六(：1'<-1.62，則突變比例％ = {1-0.50596~[0.5337(叉+1)]}\ 100%〇
[0041 ] 實施例4:
[0042]特異性確認:取臨床血常規正常的體檢樣本32例，骨髓增殖性腫瘤患者全血樣本 32例，急性髓系白血病患者15例，共79例樣本進行特異性確認。79例樣本按實施例1-3所述 進行DNA提取、熒光PCR檢測、結果分析，計算△ CT值。
[0043] 79例樣本檢測結果均為未突變，特異性為100%。
[0044] 實施例5:
[0045] 檢測下限確認:取臨床檢測突變比例為80 %的樣本和未突變的樣本各一例，將兩 例樣本均稀釋至30ng/ul，混合至突變比例為4%、2%、1%、0.4%，0.2%。按實施例2-3所 述，不同批次檢測5次，1 %突變比例的樣本5次均能檢出，故檢測下限為1 %。
[0046]
[0048] 實施例6:
[0049] 第一個待檢全血樣本檢測：對第一個待檢全血樣本按實施例1-3所述進行DNA提 取、熒光PCR檢測、結果分析，計算Δ CT = 26 · 15-28 · 65 = -2 · 5。突變比例％ = {1-0 · 5059e ~ [0.5337(-2.5+1) ]} X 100% =77.28%。該樣本同時經測序檢測驗證，確認為突變，且突變 比例約為75 %。擴增曲線圖及測序圖如圖2A和圖2B所示。
[0050] 實施例7:
[0051]第二個待檢全血樣本檢測：對第二個待檢全血樣本按實施例1-3所述進行DNA提 取、熒光PCR檢測、結果分析，計算Δ CT = 50-24.5 = 25.5。突變比例％ = 0.4688e~ [-0.4027 (25.5+1) ]X 100% =0%。該樣本同時經測序檢測驗證，確認為未突變。擴增曲線圖及測序 圖如圖3A和圖3B所示。
【主權項】
1. 一種用于MGB探針結合實時巧光PCR技術檢測MYD8化265P突變的引物和探針，其特征 在于，所述引物和探針的核巧酸序列如下： a) MYD88QF：CCTTGGCTTGCAGGTGC b) MYD88QR：AGGATGCTGGGGAACTCTTT c) MYD88-WP:肥X-AAGCGACTGATCC-MGB d) MYD88-MP:FAM-AAGCGACCGATCC-MGB。 2. MYD88第265位氨基酸突變型和野生型之間的Δ CT值與突變比例之間建立指數方程 關系的方法，所述方法包括W下步驟： (1) 合成MYD88L265P突變型和野生型質粒； 間將質粒稀釋； 間配置成不同突變比例的混合物； (4)計算Δ CT = CT煉-CT游瘦，將Δ CT值作為X，突變比例作為Y，擬合曲線如下： ① y = 0.4688e~[-0.4027(x+l)]R2 = 0.98:34(1.25-60%) ② y= 1-0.5059e~[0.5337(x+l)]R2 = 0.9814(60-100%) 1.25%-60%區間W曲線①為計算公式，曲線60-100%之間W曲線②為計算公式；即Δ CT>-1.62 W曲線①為計算公式，A CT < -1.62 W②為計算公式;FAM(突變型）無擴增曲線， 則CT值統一 W 50錄入進行計算。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，使用巧光PCR中FAM通道和肥X通道，在一管 PCR反應體系中分別檢測MYD88第265位氨基酸突變型和野生型。4. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述質粒的稀釋至化g/ul。5. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)不同突變比例為：6. 檢測樣本中MYD88L265P相對突變比例的方法，其包括W下步驟： 過)提取人全血樣本中的DNA;。 (2) 用 MYD88QF、MYD88QR、MYD88-WP 和 MYD88-MP 配置巧光 PCR 檢測體系； 間分析檢測數據:計算A CT = CT煉-CT巧瘦，將Δ CT值帶入計算公式求突變比例;若Δ CT >-1.62，則突變比例％=0.4688e^'[-0.4027(x+l)]X100%;若ΔCT<-1.62，則突變比 例％ = {1-0.5059e~ [ο.5337(x+1) ]} X 100% ;若突變型無擴增曲線，貝IJCT滅;=50，帶入計算 公式進行計算。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR反應條件為:95 °C Imin; 95 °C 15s， 60°C 35s，40巧c;并在60°C采集巧光信號。
【文檔編號】C12N15/11GK105838811SQ201610340429
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】鄒媛, 杜翠, 陳紅梅, 夏成青
【申請人】武漢艾迪康醫學檢驗所有限公司