一種斑茅育種材料的篩選方法
【專利摘要】本發明提供了一種斑茅育種材料的篩選方法，包括以下步驟：收集斑茅資源，并對其進行表型性狀的變異分析與性狀間相關性分析；提取斑茅的基因組DNA作為模板，采用SCoT標記引物進行擴增，聚丙烯電泳檢測擴增產物，獲得DNA指紋圖譜；對斑茅資源進行多態性分析和J遺傳相似性系數分析，并構建UPGMA系統樹；根據不同斑茅資源的不同生態位置、表型變異特點與系統樹進行綜合分析，得到篩選材料。采用本發明的技術方案，結合使用表型性狀的變異分析與分子標記技術，使得篩選結果更靈敏、精確；綜合評價了斑茅種質資源的利用潛力，篩選出了斑茅育種材料，為甘蔗育種服務。
【專利說明】
-種斑茅育種材料的篩選方法
技術領域
[0001] 本發明屬于農業育種技術領域，尤其設及一種斑茅育種材料的篩選方法。
【背景技術】
[0002] 甘薦是我國最主要的糖料作物，也是廣西最主要的經濟作物。現代甘薦親本主要 具有熱帶種、細莖野生種(割手密)和印度種等=種血緣，在數十年"高貴化"育種進程中，甘 薦遺傳基礎變得逐漸狹窄。因此，加大力度利用甘薦野生資源拓寬甘薦遺傳基礎被認為是 甘薦育種獲突破的關鍵途徑之一。
[0003] 斑茅是甘薦重要的野生種質，具有抗旱、耐瘡、耐潰、抗病、抗蟲性強等優點，目前 是世界各甘薦研究機構重點研究的熱點。傳統的育種選擇是對表型性狀的變異進行選擇， 但有些重要性狀無法在早期檢測出來，且表型選擇容易受到環境的干擾。分子標記技術可 W從進行DNA角度出發，根據基因組遺傳多態性進行分析，能提高選擇的準確度，縮短育種 周期，提高育種效率和選擇的可靠性，相當簡便。
[0004] 斑茅具有豐富的表型性狀，單獨進行表型變異來分析斑茅的利用潛力，容易受環 境影響而最終影響斑茅利用潛力。然而，當前對斑茅種質資源進行利用性評價，往往只進行 表型性狀的調查與分析，而沒有將表型變異結果結合分子水平上的遺傳分析相結合，也無 法獲得基因型差異較大的斑茅材料等信息。
【發明內容】
[0005] 針對W上技術問題，本發明公開了一種斑茅育種材料的篩選方法，將表型性狀與 分子標記技術相結合并進行分析，可有效利用斑茅種質資源。
[0006] 對此，本發明采用的技術方案為：
[0007] -種斑茅育種材料的篩選方法，包括W下步驟：
[000引步驟Sl:收集斑茅資源，并對其進行表型性狀的變異分析與性狀間相關性分析； [0009]步驟S2:提取斑茅基因組DNA作為模板，采用SCoT標記引物進行擴增，聚丙締電泳 檢測擴增產物，獲得DNA指紋圖譜；
[0010]步驟S3:對斑茅資源進行多態性分析和遺傳相似性系數分析，并構建UPGMA系統 樹；
[0011] 步驟S4:根據不同斑茅資源的不同生態位置、表型變異特點與系統樹進行綜合分 析，得到篩選材料。
[0012] 作為本發明的進一步改進，步驟S2中，還包括對SCoT引物進行篩選，篩選出多態性 高、分布均勻和集中25化P-1000 bp區域的斑茅專用標記引物，采用斑茅專用標記引物進行 擴增。
[OOU]作為本發明的進一步改進，所述斑茅專用標記引物包括SCoTl引物、SCoT2引物、 SCoT24 引物、SCoT25 引物、SCoT26 引物、SCoT27 引物、SCoT28 引物、SCoT29 引物、SC〇T30 引物、 SCoT31引物、SCoT35引物、SCoT36引物、SCoT37引物、SCoT39引物、SCoT42引物中至少一種； 其中，所述SCoTl的氨基酸序列為SEQ ID NO: I，所述SCoT2的氨基酸序列為SEQ ID NO: 2,所 述SCoT24的氨基酸序列為SEQ ID N0:3,所述SCoT25的氨基酸序列為SEQ ID N0:4,所述 SCo26的氨基酸序列為SEQ ID N0:5,所述SCoT27的氨基酸序列為SEQ ID N0:6,所述SCoT28 的氨基酸序列為SEQ ID N0:7,所述SCoT29的氨基酸序列為SEQ ID N0:8,所述SC〇T30的氨 基酸序列為SEQ ID N0:9,所述SCoT31的氨基酸序列為SEQ ID ^:10，所述5(：〇135的氨基酸 序列為SEQ ID NO: 11，所述SCoT36的氨基酸序列為SEQ ID NO: 12,所述SCoT37的氨基酸序 列為SEQ ID NO: 13,所述SCoT39的氨基酸序列為SEQ ID NO: 14,所述SCoT42的氨基酸序列 為沈Q ID NO: 15。
[0014] 作為本發明的進一步改進，步驟S3中，所述遺傳相似性系數分析時，W相似系數為 0.73進行切割。
[0015] 作為本發明的進一步改進，步驟S2中，擴增時的反應體系為20iil，其中含10 X buffer (Mg2+) 2.0山、50ng DNA模板0.化 1、20皿01/L 引物、4. Ommo 1/L dNTP、0.2山濃度為抓/ iil的化q DNA聚合酶。
[0016] 作為本發明的進一步改進，擴增程序為:94°C預變性4min，95°C變性50s，50°C復性 40s，72°C延伸2min，36個循環，最后72°C延伸8min。
[0017] 作為本發明的進一步改進，步驟S2中，PCR產物采用6%非變性聚丙締酷胺膠進行 電泳分離。
[0018] 目標起始密碼子多態性分子標記（sta;rt condon 1:argeted polymo;rphism,SCoT) 已被證實是一種分析農作物遺傳多樣性和聚類關系的有效方法，該標記是一種基于翻譯起 始位點的目的基因標記技術，根據翻譯起始位點ATG側翼序列的保守性，設計單引物，通過 PCR擴增產生偏向候選功能基因區的顯性多態性標記，由于用于標記分析的引物長度較長， 退火溫度較高，又是一種WPCR為基礎的標記，因此，該技術不僅兼具了簡便性、低成本、豐 富多態性和重復性好等優點，而且還能對目的基因進行標記。
[0019] 基因組DNA指紋圖譜強調唯一性，運要求通過引物擴增出來的譜帶具有較好的多 態性和特異性，才能有效鑒別作物種質資源。本發明的技術方案是首先從不同生態環境收 集斑茅種質資源，先開展大田比較試驗進行表型性狀的變異分析與性狀間相關性分析;后 利用CTAB法對斑茅種質進行基因組DNA提取，利用多態性高、成熟有效的SCoT標記結合聚丙 締凝膠電泳技術，對擴增產物進行電泳檢測，從多條引物中篩選出多態性高、分布均勻和區 域集中在25化P~1000 bp的引物15條。再進行斑茅種質資源的多態性分析、遺傳相似性系數 分析及系統樹構建分析;最后結合不同生態位置、表型變異特點與系統樹，綜合分析斑茅種 質資源的利用潛力。
[0020] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0021] 單獨進行表型性狀的變異分析，往往由于環境影響大而影響結果的準確性，而 SCoT標記本身是檢測性靈敏的技術，采用本發明的技術方案，結合使用表型性狀的變異分 析與分子標記技術，使得結果更靈敏、精確;綜合評價了斑茅種質資源的利用潛力，篩選出 了斑茅育種材料，為甘薦育種服務。
[0022] 同時，本發明的技術方案進一步將不同生態位置、表型變異特點與系統樹綜合分 析，篩選出生態環境差異較大、生物量較高且基因型差異較大的5份斑茅無性系作為甘薦育 種中的重點利用材料。
【附圖說明】
[0023] 圖1是本發明SCoT29引物對斑茅無性系的ScoT檢測結果圖。
[0024] 圖2是本發明50份斑茅無性系的UPGMA聚類圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖，對本發明的較優的實施例作進一步的詳細說明。
[0026] 操作流程:斑茅資源收集一大田表型分析試驗一不同表現性狀的變異分析一不同 表型性狀間的相關性分析一提取斑茅基因組DNA-SCoT擴增一聚丙締凝膠電泳一統計分 析一獲得DNA指紋圖譜一斑茅資源的多態性分析一UPGMA系統樹構建與分析一不同生態位 置、表型變異特點與系統樹綜合分析一重點利用材料篩選。
[0027] 具體方法和過程如下：
[0028] (1)從廣西不同生態地區采集斑茅無性系50份，同時利用GI^儀器測量采集點的海 拔和經締度，50份供試斑茅無性系的名稱及來源如表1所示。
[0029] 表1供試斑茅無性系的名稱及來源
[0030]
[0031]
[0032] (2)主要表型性狀變異調查與分析
[0033] 采用桶栽種植，隨機區組設計，3個重復。2014年2月2日種植，10月30日調查其株 高、莖徑、穗長、穗節數等指標，分析斑茅無性系的數量性狀變異。利用SAS軟件對數量性狀 進行變異系數(CV)分析，描述4個數量性狀的離散程。
[0034] 如表2所示，50份斑茅無性系的4個數量性狀變異幅度介于12.71 %-16.14%之間。 株高范圍是219-404畑1，平均為337cm;莖徑范圍是0.56-1.07畑1，平均為0.82cm;穗長范圍是 40.2-80.4cm，平均為59.7cm;穗節數范圍是11-21節，平均為17節。不同材料之間存在一定 差異，表現出明顯的形態多樣性。變異幅度最大的是莖徑，變異系數達16.14%;其次是穗 長，變異系數為15.97 % ;株高和穗節數變異系數分別為13.12 %和12.71 %。
[0035] 表2廣西斑茅無性系形態學特征分析
[00371
[0038] 對不同來源的50份廣西斑茅材料4個數量性狀進行相關性分析，結果如表3所示， 株高與莖徑、穗長均呈極顯著正相關，相關系數分別為0.4468、0.328;莖徑與穗節數呈極顯 著正相關，相關系數為0.211，與穗長呈顯著正相關，相關系數為0.0612;穗長與穗節數呈極 顯著正相關，相關系數為0.4529。結果表明，隨著斑茅不斷長高，莖徑變得越來越大;斑茅的 植株高度越高，其花穗也越長;莖徑較大和花穗較長的斑茅，其穗節數就越多。
[0039] 表3廣西斑茅形態學性狀間的相關關系 [00401
[0041] 注:*表示顯著相關;**表示極顯著相關。
[0042] (3)斑茅基因組DNA提取
[0043] 采用CTAB提取各斑茅材料的基因組DNA。
[0044] (4)引物設計和篩選
[0045] 選用GUX01、GUX02、GUX03、GUX04、GUX05等50份斑茅材料，對46對SCoT引物進行初 步篩選，聚丙締電泳檢測擴增產物。15對引物擴增出了較清晰的譜帶，并具有良好的重復 性，其中分子量范圍25化P-1000 bp之間譜帶較好，部分結果見圖1。
[0046] 從46對引物中篩選出15條引物（要求多態性和特異性好，譜帶在250bp-1000bp分 布較集中且均勻，氨基酸序列如表4所示。
[0047] 表4 SCoT標記引物序列 [004引
[00加]選用GUX01、GUX02、GUX03、GUX04、GUX05等50份斑茅材料，提取其基因組DNA作為模 板，分別利用W上15條引物進行擴增，聚丙締電泳檢測擴增產物(圖1)。
[0051]反應體系為20山，其中含10Xbuffer(Mg2+)2.0i^l、DNA模板(50ng)0.?^l、20皿ol? レl引物、4.0mmol?レldNTP、0.化lTaqDNA聚合酶（5UA^l)。擴增程序為：94°C預變性 4min，95°C 變性 5〇3,50°(：復性4〇3,72°(：延伸2111111，36個循環，最后72°(：延伸8111111。？0?產物采 用6%非變性聚丙締酷胺膠進行電泳分離。
[0052]本著"不同引物中，同一個等位基因位點，多態性較豐富的引物結果入選"的原則， 從15對專用引物中篩選出336條譜帶，范圍在25化p-lOOObp，共檢測到位點336個，其中多態 性位點284個，多態性檢出率為83.93%。各引物多態性變幅為69.57 %-100%，多態性最高 的是引物SCoT24,達100.00%。多態性最低的是引物8(：〇135，為69.57%。每條引物檢測的位 點數為17-30個，平均位點數為22個，其中多態性位點16-26個，平均為19個;總位點數和多 態性位點數最多的引物均為SCOT27，詳見表5。
[0化3] 表5 15條SCoT引物的多態性 |；0化41
[0055] 參試的50份材料中，遺傳相似系數在0.65-0.81之間，平均為0.71。遺傳相似系數 最高是GUX09和GUXlO，為0.88;遺傳相似系數最低是GUXlO和GUX30，為0.61。根據遺傳相似 性系數，用UPGM進行聚類，構建50份斑茅無性系的分子系統樹（圖2)。在相似系數約0.73切 割時，所有供試材料可劃分為4個類群。其中，GUX45、GUX49、GUX50為第I類群;GUX48為第n 類群;GUX38為第虹類群;GUX01、GUX02、GUX03等45份無性系為第IV類群。
[0056] 6.不同生態位置、表型變異特點與系統樹綜合分析，及重點利用材料篩選。
[0057] 從系統樹中可知，自成一系的GUX38、GUX45、GUX48、GUX49、GUX50與絕大部分材料 的基因型差異較大，運些材料主要來自廣西桂林市永福縣、廣西憑祥市、廣西河池市融水縣 下精坪村和廣西百色市田陽縣，運幾個材料的株高在292-358cm之間，同時大多高于平均水 平，因此運些斑茅材料的生物量會處于較高水平(株高與莖徑是斑茅生物量的主要影響因 子）。結合不同生態氣候、生物量和基因型差異綜合分析，篩選出GUX38、GUX45、GUX48、 GUX49、GUX50等5個優良，應作為甘薦育種中的重點利用材料。
[005引本發明通過表型變異調查，表明株高、莖徑、穗長、穗節數等4個數量性狀變異系數 介于12.71 %-16.14%之間，莖徑的變異系數最大，為16.14%，其次是穗長，為15.97 %，最 小是穗節數，為12.71%，莖徑的利用潛力最大。相關性分析表明，株高與莖徑、穗長均呈極 顯著正相關，相關系數分別為0.4468、0.328。莖徑與穗節數呈極顯著正相關，相關系數為 0.211。莖徑與穗長呈顯著正相關，相關系數為0.0612。穗長與穗節數呈極顯著正相關，相關 系數為0.4529;通過15對引物336條譜帶獲得的斑茅基因組DNA指紋圖譜，其中多態性位點 284個，多態性為83.93%，說明廣西斑茅具有較豐富的遺傳多樣性;進行UPGMA聚類分析，50 份廣西斑茅無性系遺傳相似系數范圍為0.65-0.81，在相似系數為0.73時，可劃分為4個類 群，同一地區的廣西斑茅無性系基本聚在同一類群，呈現出一定的地域性分布規律;最后將 不同生態位置、表型變異特點與系統樹綜合分析，篩選出生態環境差異較大、生物量較高且 基因型差異較大的5份斑茅無性系作為甘薦育種中的重點利用材料。
[0059]由上述實驗結果可見，將表型變異與SCoT標記結合使用，使得結果有效而精確。篩 選出的15對斑茅種質的適宜引物，多態性和特異性好，譜帶在25化P- 1000 bp分布較集中、均 勻。將不同生態位置、表型變異特點與系統樹綜合分析，篩選出了可在甘薦育種中重點關注 的斑茅種質材料。
[0060] W上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于運些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下，還可W做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的 保護犯i圍。
【主權項】
1. 一種斑茅育種材料的篩選方法，其特征在于:包括以下步驟： 步驟S1:收集斑茅資源，并對其進行表型性狀的變異分析與性狀間相關性分析； 步驟S2:提取各斑茅基因組DNA作為模板，采用SCOT標記引物進行擴增，聚丙烯電泳檢 測擴增產物，獲得DNA指紋圖譜； 步驟S3:對斑茅資源進行多態性分析和遺傳相似性系數分析，并構建UPGMA系統樹； 步驟S4:根據不同斑茅資源的不同生態位置、表型變異特點與系統樹進行綜合分析，得 到篩選材料。2. 根據權利要求1所述的斑茅育種材料的篩選方法，其特征在于：步驟S2中，還包括對 SCoT引物進行篩選，篩選出多態性高、分布均勻和集中250 bp - 1000 bp區域的斑茅專用 標記引物，采用斑茅專用標記引物進行擴增。3. 根據權利要求2所述的斑茅育種材料的篩選方法，其特征在于:所述斑茅專用標記引 物包括 SCoTl 引物、SCoT2 引物、SCoT24 引物、SCoT25 引物、SCoT26 引物、SCoT27 引物、SCoT28 引物、SCoT29 引物、SC〇T30 引物、SCoT31 引物、SCoT35 引物、SCoT36 引物、SCoT37 引物、SCoT39 引物、SC〇T42引物中至少一種;其中，所述SCoTl的氨基酸序列為SEQ ID N0:1，所述SC〇T2的 氨基酸序列為SEQIDN0:2，所述SCoT24的氨基酸序列為SEQIDN0 :3，所述SCoT25的氨基 酸序列為SEQ ID N0:4,所述SCo26的氨基酸序列為SEQ ID N0:5,所述SCoT27的氨基酸序列 為SEQ ID N0:6,所述SCoT28的氨基酸序列為SEQ ID N0:7,所述SCoT29的氨基酸序列為SEQ ID N0:8,所述SC〇T30的氨基酸序列為SEQ ID N0:9,所述SCoT31的氨基酸序列為SEQ ID NO: 10,所述SCoT35的氨基酸序列為SEQ ID NO: 11，所述SCoT36的氨基酸序列為SEQ ID NO: 12,所述SCoT37的氨基酸序列為SEQ ID NO: 13,所述SCoT39的氨基酸序列為SEQ ID NO: 14， 所述SCoT42的氨基酸序列為SEQ ID NO: 15。4. 根據權利要求1所述的斑茅育種材料的篩選方法，其特征在于：步驟S3中，所述遺傳 相似性系數分析時，以相似系數為0.73進行切割。5. 根據權利要求1所述的斑茅育種材料的篩選方法，其特征在于：步驟S2中，擴增時的 反應體系為20 μL，其中含 10 X buffer(Mg2+)2.0 μ1、50 ng DNA模板0.5 μ1、20μL?〇1/1 引 物、4.0 mmol/L dNTP、0.2 μL 濃度為5 U/μΙ的Taq DNA聚合酶。6. 根據權利要求5所述的斑茅育種材料的篩選方法，其特征在于:擴增程序為:94 °C預 變性4 min，95°C變性50 s，50 °C復性40 s，72 °C延伸2 min，36個循環，最后72 °C延伸8 min〇7. 根據權利要求5所述的斑茅育種材料的篩選方法，其特征在于:步驟S2中，PCR產物采 用6%非變性聚丙烯酰胺膠進行電泳分離。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838810SQ201610339595
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】劉昔輝, 張榮華, 宋煥忠, 李楊瑞, 張革民, 楊柳, 方位寬, 譚宏偉
【申請人】廣西壯族自治區農業科學院甘蔗研究所