羊源性成分的lamp檢測方法的引物、檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明屬于分子生物學領域，公開了一種羊源性成分的LAMP檢測方法的引物和用這種引物檢測的方法，以及包含這種引物的試劑盒。所述引物的序列如SEQ ID NO.1～4所示。所述試劑盒包括引物、DNA提取試劑、2×反應液RM、Bst DNA聚合酶、熒光染料和陰性對照。本發明建立的羊源性成分的LAMP檢測方法和試劑盒具有特異性好、靈敏度高、快速、費用低廉等優點，可應用于動物組織及其加工品中羊源性成分的快速檢測。
【專利說明】
羊源性成分的LAMP檢測方法的引物、檢測方法和試劑盒
技術領域
[0001 ]本發明涉及分子生物學中羊源性成分的LAMP檢測方法，特別涉及羊源性成分的 LAMP檢測方法的引物和用這種引物檢測的方法，以及包含這種引物的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 早在20世紀80年代，國外就已經重視對動物源性成分的檢測并對其開展了鑒別的 研究。而我國在近幾年隨著國內居民收入增加，人們對肉制品的需求量，特別是羊肉的需求 量持續上漲。但由于羊肉價格高，不法分子使用廉價的肉比如豬肉、雞肉、鴨肉冒充羊肉以 此賺取利潤。因此我們需要建立一種準確、快速、可靠的檢測方法，這對保障消費者的合法 權益和為相關部門打擊不法分子提供有利的技術支持有著重要的意義。目前為止檢測方法 可分為物理、化學、免疫學和分子生物學這幾類，具體例如色譜法、ELISA法、常規PCR法、實 時熒光PCR法等。其中以PCR方法最為準確、快速、靈敏。而由于實時熒光PCR法在時間、準確 性和靈敏度上等優勢，使其成為了檢測動物源性成分最常用的分子生物學法。但此方法需 要依靠昂貴的設備，成本負擔較重，且設備較笨重，無法離開實驗室進行使用。
[0003] 環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification)是2000年由 日本榮研株式會社的學者No tomi博士等人發明的一項新的DNA擴增技術。傳統的PCR技術離 不開反復升降溫這個耗時耗能的過程，且反應程序設定也較繁瑣。相比之下，LAMP技術克服 了這些問題。根據LAMP技術的原理，它可實現在恒溫條件下（一般在60~65°C)快速連續擴 增，實現了實驗過程快速、簡便，儀器設備簡單、便攜，檢測結果特異性強、靈敏度高的優點。 LAMP擴增結果可用實時熒光法，通過實時熒光PCR儀(Real-Time PCR System)進行實時觀 察，也可在反應結束后加入鈣黃綠素熒光指示劑用肉眼觀察，呈綠色表明發生了擴增，橙色 則表示未發生擴增。
[0004] LAMP反應原理如下：模板DNA在65°C左右處于動態平衡狀態，在Bst酶作用下引物 與其中一條鏈互補配對延伸時，另一條鏈就會解離。LAMP整個反應分三步完成，即起初反應 物模板的合成;循環擴增階段;延伸和再循環。首先是反應模板合成階段：內引物FIP和模板 鏈的F2c結合啟動互補鏈的合成。F3再和模板鏈上的F3c結合，通過Bst酶啟動鏈置換反應， 與模板DNA形成雙鏈結構，并且釋放出FIP合成延長單鏈。FIP延長單鏈5'端F1序列與Flc序 列堿基互補形成莖環結構。以之前置換的與模板DNA互補的FIP延長單鏈作為模板，BIP啟動 互補鏈的合成，形成雙鏈DNA。然后B3再插入此雙鏈DNA中，和FIP延長鏈的B3c結合，啟動鏈 置換反應，釋放出兩端分別含互補區域(一端Flc和F1互補，一端Blc和B1互補）的DNA，形成 啞鈴狀結構。該結構是LAMP法基因擴增循環的起始結構。其次是循環擴增階段:在啞鈴狀結 構中，以F1區段的3'末端為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸。與此同時，FIP引物F2與 啞鈴結構環上單鏈F2c雜交，啟動新一輪鏈置換反應。解離由F1區段合成的雙鏈核酸。同樣， 在解離出的單鏈核酸上也會形成環狀結構。最后是延伸和再循環階段:在環狀結構上存在 單鏈形式B2c，BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增。經過一系列擴增階段，形成了鏈 長延伸一倍的新產物鏈和錘狀結構，并將進一步以相同方式延伸。隨后再循環反應，莖的長 度和環的個數都逐漸增加，最后的產物為莖環DNA組成的混合物，即含有若干倍莖長度莖環 結構和類似花椰菜的結構。其中，若在體系中添加兩條環引物Loop F和Loop B可加速擴增 反應。
[0005] 鈣黃綠素是一種熒光指示劑。在原有LAMP反應試劑的基礎上添加鈣黃綠素和氯化 錳后，可以衍生出另外一種更為簡便的可視化LAMP，一步即可完成LAMP擴增及結果判定。將 鈣黃綠素與錳離子混合，會使鈣黃綠素熒光淬滅，溶液顯現橙色。把這種混合的熒光指示劑 加入LAMP體系中，在LAMP擴增反應進行當中，產生的大量的焦磷酸根(P2〇740，奪去了與鈣 黃綠素結合的錳離子，形成焦磷酸錳沉淀。之后，鈣黃綠素由于失去了錳離子而發出綠色熒 光，使得溶液呈現綠色，肉眼即可觀察。這種可視化LAMP不但簡化了產物檢測方法，使得 LAMP擴增和產物檢測一步完成，而且不開蓋的操作還降低了產物對檢測地點污染的潛在威 脅。
[0006] 至今為止，國內外對羊源性成分（山羊、綿羊)采用LAMP技術來檢測鑒別鮮有報道。 綜上所述，需要建立一種可檢測兩種羊源性成分的LAMP檢測方法，為羊源性成分的檢測提 供更多選擇。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供特異性好、靈敏度高的羊源性成分的LAMP檢測方法的引物。
[0008] 本發明的另一目的是提供一種羊源性成分的LAMP檢測方法。
[0009]本發明的另一目的是提供一種檢測羊源性成分的試劑盒。
[0010]為達到上述目的之一，本發明采用以下技術方案： 羊源性成分的LAMP檢測方法的引物，所述引物包括： 引物FIP: 5 ' -TGCTGAAGATGGCGGTATATAGAGATAAACCCCGATAAACCTCA-3 ' ；（ SEQ ID N0 · 1) 引物BIP:5' -GCTCAATCACAACACATAAAGACGTAAGGTAGAAAATGTAGCCCAT-3,；(SEQ ID NO.2) 引物F3:5'-TCTAGAGGAGCCTGTTCT-3'；（SEQIDN0·3) 引物B3:5'-GTCATTAATTTCATAATGGCTTTCG-3'（SEQIDN0·4)。
[0011 ] -種羊源性成分的LAMP檢測方法，包括以下步驟： 51、 提取待測樣品DNA; 52、 配制LAMP檢測反應體系，反應體系包括以上所述的引物； 53、 以S1的DNA為模板進行LAMP擴增反應，用實時熒光法鑒定結果。
[0012] 進一步地，所述反應體系為：2 X反應液RM 12 · 5yL，引物FIP、BIP各1 · OyL，引物F3、 B3各 1 · OyL，Bst DNA聚合酶 1 · OyL，熒光染料0 · 5yL，DNA模版2 · OyL，補水至25yL。
[0013] 進一步地，所述引物FIP、BIP的濃度是40ymol/L，所述引物F3、B3的濃度是5ymol/ L〇
[0014] 進一步地，所述擴增反應的程序為：保溫階段63°C 30s，1個循環；循環階段63°C 15s，63 °C 45s，60個循環。
[0015] -種檢測羊源性成分的試劑盒，所述試劑盒包括以上所述的引物。
[0016] 進一步地，所述試劑盒還包括DNA提取試劑、2X反應液RM、Bst DNA聚合酶、熒光染 料。
[0017] 2X反應液RM含有dNTPs和緩沖液。
[0018] 本發明有以下有益效果： 為了對肉制品中羊源性成分進行有效鑒定，本發明根據羊的線粒體DNA(mtDNA)序列， 使用分子生物軟件LAMP Designer設計了一套引物，用來建立羊源性成分LAMP檢測方法。結 果表明，LAMP檢測方法對肉制品中羊源性成分的檢測特異性良好，且方法的靈敏度高，可檢 測到100拷貝的數量級。對送檢樣品檢測的結果與標準方法得出的結果一致。本發明的檢測 方法和試劑盒可應用于動物組織及其加工品中羊源性成分的快速檢測。
[0019] 本發明在設計引物時，羊線粒體基因上的外引物跨度為220bp左右，這樣即使肉制 品經過高溫、高壓等加工，樣品不至于因 DNA片段受損或因設計的片段在該部位不存在而出 現漏檢的情況。
【附圖說明】
[0020] 圖1是實施例2中LAMP檢測方法對羊肉樣品的檢測結果； 圖2是實施例2中LAMP檢測方法的特異性試驗結果； 圖3是實施例2中LAMP檢測方法的靈敏度試驗結果； 圖4是實施例2中LAMP檢測方法對送檢樣品的檢測結果。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明： 實施例1 羊源性成分的LAMP檢測方法的引物 按照LAMP引物設計原則，根據GenBank數據庫中綿羊和山羊的線粒體基因組序列，進行 多序列比對，在線粒體基因上尋找一段高度保守區作為擴增對象，然后通過分子生物學軟 件LAMP Dsigner設計引物。引物由上海輝睿生物科技有限公司合成，采用HPLC純化方式。合 成后的引物用超純水稀釋成1 OOpmo 1/yL溶液，-20 °C保存備用。引物序列見表1。
[0022] 表1羊源性成分LAMP引物
實施例2 羊源性成分的LAMP檢測方法 DNA提取試劑盒E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit為美國OMEGA公司產品，LAMP擴增體系的2 X反應液RM、Bst DNA聚合酶、熒光染料均為廣州迪澳生物科技有限公司產品。2 X反應液RM 含有dNTPs和緩沖液。
[0023] ABI ViiA7 Real-Time PCR System、ABI 7500 Fast Real-Time PCR System和 9700 PCR System，均為為美國Applied Biosystems公司產品。Alpha Imager HP凝膠成像 分析系統為美國Alpha Innotech公司產品。SIGMA 3-18 K小型高速冰凍臺式離心機，為德 國Sartorius公司產品。NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer紫外分光光度計為美國 NanoDrop Technologies公司產品。
[0024] 1、標準方法的建立 實驗室保存和外購的動物組織樣品共18份，其中包括牛肉（黃牛肉、牦牛肉、水牛肉各 兩份）、豬肉、羊肉（綿羊肉、山羊肉各一份）、雞肉、鴨肉、鵝肉、狗肉、梅花鹿角、駱駝、水貂皮 張、狐貍皮張、驢肉。
[0025] 18份樣品均使用了國家標準、行業標準和CNAS認可標準《脊椎動物源性成分PCR鑒 別方法》(ZHJS 001-2006)來驗證，結果見表2。
[0026] 表2樣品驗證結果 2、提取樣品DNA
樣品為綿羊和山羊樣品。
[0027] DNA的提取方法按照DNA提取試劑盒說明書中關于組織DNA提取要求進行，具體步 驟如下： (1) 將30mg左右的組織樣品加入1 · 5mL離心管； (2) 加200yL TL Buffer和25yL 0B溶液到樣品中，漩渦震蕩混勻以裂解樣品； (3)將1.5mL離心管放入55°C的恒溫水浴鍋中20~30分鐘，中途可拿出樣品搖晃，效果更 好； ⑷時間到后將離心管放于離心機中，以10000 X g的速度離心5分鐘； (5) 將上清液用移液器吸出到新的1.5mL離心管中，注意不要吸到沉淀層； (6) 加220yL BL溶液到離心管中，混勻后放入70°C的恒溫水浴鍋中10分鐘； (7) 加220yL的100%酒精于離心管中，混勻后用移液器全部吸出到DNA mini Column管， 并將其插到2mL Collection Tube管，離心一分鐘； (8) 取出后換新Collection Tube管，加500yL HBC溶液到mini Column管，離心30秒； (9) 取出后再換新Collection Tube管，加700yL DNA Wash Buffer溶液到mini Column 管，離心30秒； (10) 重復第(9)步； (11) 將Col lection Tube管液體倒掉，再空轉2分鐘； (12) 把mini Column管轉移到1.5mL離心管中，加200yL Elution Buffer于室溫2分鐘； (13) 離心一分鐘，DNA溶液轉移到了 1.5mL離心管中，丟棄mini Column管； (14) 將DNA溶液儲存于-20°C中。
[0028] 獲得的DNA模板的260/280比值均在1.8~2.0之間，濃度在200~500ngAxL。提取的 DNA質量和濃度較高，適合后續的擴增反應。
[0029] 3、LAMP反應體系 反應體系為:2 X反應液RM 12.5yL，內引物FIP、BIP各1. OyL，外引物F3、B3各1. OyL，Bst DNA聚合酶1. OyL，熒光染料0.5yL，DNA模版2. OyL，補水至25yL。最后加20.0 yL的封閉液以避 免體系揮發和產物污染。
[0030] 內引物FIP、BIP的濃度是40μL?〇 1 /L，外引物F3、B3的濃度是5μL?〇 1 /L。
[0031] DNA模版由綿羊肉和山羊肉提取而得。
[0032] 4、樣品檢測 利用實時熒光法，將樣品DNA作為模板用ABI ViiA7 Real-Time PCR System進行LAMP 擴增，并實時觀察擴增曲線。
[0033] 擴增反應的程序為：設定保溫階段63°C 30s，l個循環;循環階段63°C 15s，63°C 45s，60個循環。
[0034] 在63°C 45s處收集熒光信號，熒光通道選為FAM。
[0035] 結果如圖1所示，曲線1為山羊，曲線2為綿羊，曲線3為陰性對照(水，下同）。除陰性 對照未發生擴增，綿羊和山羊均發生擴增;且熒光信號到達設定的域值時所經歷的時間相 差不大，說明設計的引物對其擴增效果一致。
[0036] 5、特異性試驗 為了驗證設計引物對羊源性成分檢測的特異性，用上述反應體系和條件，以13份非羊 肉樣品（黃牛肉、牦牛肉、水牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、狗肉、梅花鹿角、駱駝、水紹皮張、 狐貍皮張、驢肉各一份)和2份羊肉樣品（山羊、綿羊）的DNA為模板進行擴增。以山羊肉為陽 性對照的試驗結果如圖2所示，曲線1為陽性對照山羊肉，曲線2~15依次是黃牛肉、牦牛肉、 水牛肉、豬肉、雞肉、鴨肉、鵝肉、狗肉、梅花鹿角、駱駝、水貂皮張、狐貍皮張、驢肉、陰性對 照。除了山羊的DNA有明顯的擴增曲線外其他樣品均無擴增。以綿羊肉為陽性對照的試驗結 果也顯示了檢測方法具有特異性。
[0037] 6、靈敏度試驗 取綿羊的樣品DNA，分別用外引物F3、B3進行擴增，反應程序均為：94°C 4min ; 94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，35個循環;72°C 5min。將產物用電泳檢測，有目的條帶的PCR產物 送北京六合華大基因科技股份有限公司武漢分公司、廣州分公司進行測序鑒定，并以羊的 重組質粒作為陽性標準品。將重組質粒用紫外分光光度計測定質粒濃度，根據阿伏伽德羅 常數換算為目的基因的拷貝數，以10倍梯度稀釋至10拷貝ΛΛ，對梯度稀釋的陽性對照進行 LAMP反應檢測。
[0038] 將用外引物擴增的產物克隆成質粒進行10倍的梯度稀釋，稀釋好的質粒按照上面 的體系和條件，用ABI 7500 Fast Real-Time PCR System進行結果觀察，結果如圖3所示， 曲線1為1〇9拷貝，曲線2為108拷貝，曲線3為107拷貝，曲線4為10 6拷貝，曲線5為105貝，曲線6 為1〇4拷貝，曲線7為103拷貝，曲線8為102拷貝，曲線9為10 1拷貝，曲線10為陰性對照。可知羊 源性成分檢測的最低檢測濃度均達到了 100拷貝的數量級。
[0039] 7、送檢樣品的檢測 通過以上靈敏度試驗，發現檢測方法的靈敏度都在100拷貝的數量級，且均在50個循環 之前就有擴增曲線，50min之后為無效擴增，故將LAMP的反應時間設定為50min。調整反應時 間后，先后對31份送檢樣品進行檢測，部分樣品的檢測結果如圖4所示，曲線1~4均為送檢樣 品，曲線5為陰性對照。使用上述標準方法同時進行樣品檢測，LAMP方法與標準方法檢測結 果符合率為100%。
[0040] 本實施例通過使用實時熒光法對建立的檢測方法進行了通用性測試，結果發現在 羊源性成分檢測中對于2種不同種的羊的DNA都可很好地擴增出來。在靈敏度方面，引物的 靈敏度都較高，羊源性成分的檢測可以達到1〇〇拷貝的數量級，這對于羊角或其它線粒體 DNA含量較少部位的檢測具有實用性。在靈敏度試驗中發現在50min以后也沒有熒光曲線出 現，在實際應用中無參考價值，故將LAMP反應的時間設定在50min較為合理。
[0041 ]綜上，本發明的LAMP檢測方法特異性好、靈敏度高，可快速檢測動物組織及其加工 品中是否含有羊源性成分。
[0042] 實施例3 檢測羊源性成分的試劑盒 引物:如表1所示，內引物FIP、BIP的濃度是40ymol/L，外引物F3、B3的濃度是5ymol/L。
[0043] DNA提取試齊丨」：美國OMEGA公司產品E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit。
[0044] LAMP擴增體系：具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶、2 X反應液RM、焚光染料均為 廣州迪澳生物科技有限公司產品；2 X反應液RM含有dNTPs和緩沖液。
[0045] 陰性對照:水。
[0046] 以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何 屬于本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應 涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求的保護范圍為準。
【主權項】
1. 羊源性成分的LAMP檢測方法的引物，其特征在于，所述引物包括： 引物FIP: 5 ' -TGCTGAAGATGGCGGTATATAGAGATAAACCCCGATAAACCTCA-3 ' ； 引物BIP:5' -GCTCAATCACAACACATAAAGACGTAAGGTAGAAAATGTAGCCCAT-3，； 引物F3:5 ' -TCTAGAGGAGCCTGTTCT-3 ' ； 引物B3:5 ' -GTCATTAATTTCATAATGGCTTTCG-3 '。2. -種羊源性成分的LAMP檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 51、 提取待測樣品DNA; 52、 配制LAMP檢測反應體系，反應體系包括權利要求1所述的引物； 53、 以S1的DNA為模板進行LAMP擴增反應，用實時熒光法鑒定結果。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述反應體系為:2 X反應液RM 12.5yL，引 物FIP、BIP各l.OyL，引物F3、B3各 1.0yL，Bst DNA聚合酶l.OyL，熒光染料0.5yL，DNA模版2.0 yL，補水至25yL。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述引物FIP、BIP的濃度是40ymol/L，所述 引物F3、B3的濃度是5ymol/L。5. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述擴增反應的程序為：保溫階段63°C 30s，1個循環;循環階段63 °C 15s，63 °C 45s，60個循環。6. -種檢測羊源性成分的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的引 物。7. 根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括DNA提取試劑、2 X反 應液RM、Bst DNA聚合酶、熒光染料。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838807SQ201610332595
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月18日
【發明人】羅寶正, 趙福振, 邵建宏, 薄清如, 王小玉, 彭玉芬, 黃海超, 陳敬
【申請人】珠海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心