用于定性檢測白血病融合基因的引物、探針、試劑盒及方法

用于定性檢測白血病融合基因的引物、探針、試劑盒及方法
【專利摘要】本發明屬于基因工程技術領域，公開了一種用于檢測白血病融合基因的引物和探針組合、含有該引物和探針組合的試劑盒以及采用該引物和探針組合或試劑盒進行白血病融合基因檢測的多重熒光RT?PCR方法。本發明基于多重熒光RT?PCR技術，簡單、快捷，靈敏度高。此外，本發明通過合理的引物和探針搭配，有效避免了引物與引物之間、引物與探針之間以及探針與探針之間的相互作用，減少了檢測誤差。采用本發明的檢測方法可以全面地對45種白血病融合基因進行定性檢測，有效縮短了檢測時間，為臨床白血病的診斷、療效評價以及預后提供了非常重要的檢測手段。
【專利說明】
用于定性檢測白血病融合基因的引物、探針、試劑盒及方法
技術領域
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及用于定性檢測白血病融合基因的引物、 探針、試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] 白血病是兒童和青年中最常見的一種惡性克隆性疾病。多項研究表明大部分的白 血病患者中存在某種染色體結構的畸變(缺失、重復、倒位、易位等），這些是導致白血病發 生以及發展的重要原因。染色體結構的畸變，會導致原癌基因及抑癌基因的結構變異，使得 癌基因、原癌基因突變激活，抑癌基因缺失或失活，產生新的融合基因，編碼融合蛋白。因而 不同的融合基因已經成為不同類型白血病的分子生物學特異性標志。如慢性髓細胞白血病 (CML)中的BCR-ABL1融合基因，急性早幼粒細胞白血病(APL)中的PML-RARA融合基因已成為 各自的分子標志并進一步成為治療的靶標。2000年WHO關于白血病分型的標準中更是將其 中一些常見的異常歸納為白血病基本診斷的標準之一。鑒于白血病相關融合基因的檢測對 于白血病診斷、分型、臨床治療選擇、預后療效評價以及微小殘留病(MRD)檢測上的臨床價 值，融合基因檢測技術的開發具有極大的臨床意義和市場價值。
[0003] 目前，融合基因的檢測方法主要包括染色體核型分析、熒光原位雜交技術以及聚 合酶鏈式反應(PCR)。與染色體核型分析和熒光原位雜交技術相比，PCR檢測方法具有快速 有效、靈敏度高等優點，在臨床上有較廣的應用。多重PCR技術是指在同一個PCR體系中加入 多對引物，能夠同時擴增出多個DNA片段。作為PCR重要的衍生技術，多重PCR可以同時擴增 多個目的基因，具有節省時間、降低成本、提高效率的優點，尤其是能夠提高檢測的靈敏度。 熒光RT-PCR是在逆轉錄之后進行實時熒光PCR檢測，其主要優勢在于用實時熒光PCR平臺代 替普通的PCR以及電泳分析。實時熒光PCR具有如下優點：（1)閉管操作、封閉狀態檢測，減少 了模板污染和假陽性的可能；（2)無需對PCR產物進行后處理，操作更簡便快速；（3)靈敏度 高，可以檢測單拷貝基因；（4)特異性高，可通過探針與靶序列特異性的結合，特異性地檢測 目的基因；（5)通過標準曲線和Ct值進行定量分析。2003年25個歐洲實驗室通過EAC項目 (Europe Against Cancer Program)合作，對白血病中常見的10個融合基因的檢測建立了 標準化的實時熒光RT-PCR方法，包括熒光PCR引物以及探針（Leukemia，2003,17,2318- 2357)。之后許多針對白血病融合基因的熒光檢測方法都是在此項研究的基礎上發展起來 的。
[0004] 然而，多重熒光RT-PCR技術需要在同一個PCR反應體系中加入多對引物，甚至是多 條探針，這樣就增加了多對引物以及多條探針在反應體系中相互作用以及形成二聚體的幾 率，從而降低了PCR反應的特異性和效率，甚至不能擴增出特異性目標產物。此外，隨著人們 對白血病研究的不斷深入，越來越多的白血病融合基因已被發現，當前檢測白血病融合基 因的方法已經遠遠不能滿足人們對于同時檢測絕大部分融合基因的需求，亟需一種快速、 有效且易于標準化的能同時定性檢測絕大部分白血病融合基因的方法。

【發明內容】

[0005] 本發明針對現有技術中存在的上述缺陷，基于最新的白血病融合基因數據庫，重 新設計了用于檢測白血病融合基因的檢測引物和探針以及多重熒光RT-PCR方法。本發明的 檢測方法快速、有效且易于對45種白血病融合基因進行標準化的高靈敏度定性檢測。
[0006] 為此，本發明一方面提供了一種用于檢測白血病融合基因的引物和探針組合，其 由SEQ ID N0.1-114所示的引物和探針組成。
[0007] 在本發明優選的實施方案中，該引物和探針組合進一步由第1-12組引物和探針組 成，其中第1組由SEQ ID N0.1-9所示的引物和SEQ ID N0.10-11所示的探針組成，第2組由 SEQ ID N0.12-16所示的引物和SEQ ID N0.17-18所示的探針組成，第3組由SEQ ID NO. 19- 27所示的引物和SEQ ID NO.28-29所示的探針組成，第4組由SEQ ID NO.30-35所示的引物 和SEQ ID NO. 36-38所示的探針組成，第5組由SEQ ID NO. 39-43所示的引物和SEQ ID NO.44-45所示的探針組成，第6組由SEQ ID NO.46-50所示的引物和SEQ ID NO.51-52所示 的探針組成，第7組由SEQ ID NO.53-59所示的引物和SEQ ID NO.60-62所示的探針組成，第 8組由SEQ ID N0.63-66所示的引物和SEQ ID N0.67-88所示的探針組成，第9組由SEQ ID NO.69-76所示的引物和SEQ ID NO.77-78所示的探針組成，第10組由SEQ ID NO.79-87所示 的引物和SEQ ID NO.88-89所示的探針組成，第11組由SEQ ID NO.90-99所示的引物和SEQ ID NO. 100-101所示的探針組成，第12組由SEQ ID NO. 102-111所示的引物和SEQ ID NO. 112-114所示的探針組成。
[0008] 本發明通過選擇相關基因斷裂位點上游序列和下游序列，來進行特異性多重熒光 RT-PCR引物和探針的設計。所設計的引物Tm值均在60°C附近，整合搭配各個引物，從而盡量 避免了引物二聚體的產生;探針Tm值均在70°C附近，避免了探針與其他非特異性序列之間 的結合，同時也避免了探針相互之間形成復雜的二聚體，提高了 PCR擴增的特異性和效率。
[0009] 針對45種白血病融合基因，本發明設計的具體引物和探針情況如表1所示。
[0010] 表1、本發明的引物和探針情況表
[0014]
[0015] 在本發明優選的實施方案中，部分探針的5'端連接熒光報告基團FAM，3'端連接熒 光淬滅基團TAMRA;其余探針的5 '端連接熒光報告基團J0E，3 '端連接熒光淬滅基團TAMRA; 內參基因 GAPDH探針的5'端連接熒光報告基團J0E，3'端連接熒光淬滅基團TAMRA。
[0016] 本發明另一方面提供了一種用于檢測白血病融合基因的試劑盒，其包含本發明所 述的引物和探針組合。
[0017] 在本發明優選的實施方案中，試劑盒中全部引物的濃度為3pm〇lAU，全部探針的 濃度為 2ρηιο1/μ1。
[0018] 本發明另一方面提供了本發明所述的引物和探針組合在制備檢測白血病融合基 因試劑盒中的應用。
[0019] 本發明再一方面提供了本發明所述的引物和探針組合，或者本發明所述的試劑盒 在檢測白血病融合基因中的應用。
[0020] 本發明最后一方面提供了一種檢測白血病融合基因的多重熒光RT-PCR方法，其包 含以下步驟：
[0021] 1、獲取待測樣品的cDNA。
[0022] cDNA合成可以采用Promega逆轉錄試劑盒，簡要流程如下：
[0023] 取 1 ~5ug總RNA用于逆轉錄，取50ug/ml的Random Prime 1.5ul和 15ul的RNA產物， 70°C反應5min以促進RNA二級結構的打開，放置冰上至少2min。加入5 X Reaction Buffer 6uK25mM MgCl2 3.8uKPCR Nucleotide Mixl.5uK RNasinRibonuclease Inhibitor 0.3ul、GoScript? Reverse Transcriptaselul、Nuclease_Free Water 0.9ul至終體積 30ul 〇
[0024] 逆轉錄程序為：25°C5min ;42°C60min;70°C 15min。將獲得的 cDNA 用Nuclease-Free Water進行相應地稀釋(根據總RNA濃度進行計算），稀釋后的cDNA用來進行融合基因的多重 熒光RT-PCR定性檢測。
[0025] 2、采用本發明所述的引物和探針組合，或采用本發明所述的試劑盒，以步驟1中獲 取的cDNA為模板，進行多重熒光RT-PCR擴增，并收集熒光信號。
[0026]在本發明的多重熒光RT-PCR檢測中，20ul的反應體系包括：10ul的熒光PCR反應 液、lul的R0X Reference Dye、5ul的稀釋后cDNA模板（Nuclease-Free Water作為陰性對 照）、2ul的引物探針混合液以及2ul的Nuclease-Free Water。
[0027] 在ABI 7500熒光PCR儀上運行程序為：先經過5〇1：21^11，95°(：1〇1^11;然后再經過95 °C 15sec，6CTC30sec，共 45 個循環。
[0028] 3、分析內參基因 GATOH的擴增結果，如果CT值小于30，檢測過程有效，如果CT值大于 35,重新進行驗證檢測。
[0029]在本發明的多重熒光RT-PCR檢測中，內參對照引物和探針采用人GAPDH基因，陰性 對照（水）中未添加 cDNA模板。只有內參基因 GAPDH的CT值小于30時，檢測過程才有效，才進 入結果判讀步驟。
[0030] 4、內參基因 GAPDH的CT值小于30時，進行白血病融合基因的結果判讀。
[0031] 在采用本發明的多重熒光RT-PCR檢測方法對待測樣本進行檢測后，只有當內參基 因 GATOH有J0E焚光信號，且其中1管中能夠檢測出FAM或J0E焚光信號，無模板對照品無信號 時，待測樣本的檢測結果才有效且呈陽性。
[0032] 在本發明優選的實施方案中，部分探針的5'端連接熒光報告基團FAM，3'端連接熒 光淬滅基團TAMRA;其余探針的5 '端連接熒光報告基團J0E，3 '端連接熒光淬滅基團TAMRA; 內參基因 GAPDH探針的5'端連接熒光報告基團J0E，3'端連接熒光淬滅基團TAMRA。
[0033]在本發明進一步優選的實施方案中，全部引物的濃度為3pm〇lAU，全部探針的濃 度為 2ρηιο1/μ1。
[0034] 由上述描述可知，與現有技術相比，本發明具備如下優點。
[0035] 1、與現有的染色體核型分析和熒光原位雜交技術相比，本發明的檢測方法基于多 重熒光RT-PCR技術，因此簡單、快捷，靈敏度高。同時，本發明采用的多重熒光RT-PCR技術與 多重巢式RT-PCR相比，具有更高的靈敏度和特異性。
[0036] 2、本發明的檢測方法通過合理的引物和探針搭配，可以有效避免引物與引物之 間、引物與探針之間以及探針與探針之間的相互作用，從而提高了特異性，降低了假陽性， 減少了檢測誤差。
[0037] 3、本發明的檢測方法可以全面地對45種白血病融合基因進行高靈敏度的定性檢 測，有效縮短了檢測時間，為臨床白血病的診斷、療效評價以及預后提供了非常重要的檢測 手段。
【附圖說明】
[0038] 圖1:具有代表性的白血病融合基因 （BCR-ABL1、CBFB-MYH11、PML-RARA和AML1- ΕΤ0)的斷裂位點以及引物和探針設計位點結構示意圖。
[0039] 圖2:實施例1中采用白血病融合基因陽性細胞系和陰性細胞系檢測本發明檢測體 系特異性的熒光擴增曲線圖。
[0040] 圖3:實施例2中采用白血病融合基因陽性細胞系檢測本發明檢測體系重復性的熒 光擴增曲線圖。
[0041] 圖4:實施例3中采用白血病融合基因陽性細胞系和陰性細胞系檢測本發明檢測體 系靈敏性的熒光擴增曲線圖。
[0042]圖5:實施例4中采用本發明檢測體系進行臨床樣本檢測的熒光擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0043]下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明，旨在用于說明本發明而非限定本 發明。應當指出，對于本領域技術人員而言，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發 明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也同樣落入本發明的保護范圍之內。
[0044]實施例1:利用融合基因陽性細胞系和陰性細胞系檢測本發明檢測體系的特異性 [0045] 本實施例以確定含有BCR-ABLl(p210)融合基因的K562陽性細胞系、AML1-ET0融合 基因的Kasumi細胞系以及不含融合基因的HL60陰性細胞系來驗證本發明檢測方法的可行 性及特異性。其中K562細胞系、Kasumi細胞系、HL60細胞系均購自北京鼎國昌盛生物技術有 限責任公司。
[0046]本實施例的具體檢測方法如下：
[0047] 1、細胞培養
[0048] 按照細胞培養的標準操作培養K562細胞系、Kasumi細胞系以及HL60細胞系，置于 37 °C、5 % C02培養箱內培養。
[0049] 2、核酸提取
[0050] 建議使用TIANGEN RNAprep Pure Blood Kit試劑盒，按照試劑盒說明書操作來提 取細胞系中的RNA，之后立即進行逆轉錄。
[0051] 3、逆轉錄
[0052]建議使用Promega GoScript? Reverse Transcriptase試劑盒，按照試劑盒說明 書操作來獲得cDNA。逆轉錄的cDNA用Nuclease-Free Water進行相應地稀釋(根據總RNA濃 度進行計算），稀釋后的cDNA用來進行熒光RT-PCR檢測。
[0053] 4、多重熒光RT-PCR檢測
[0054] (1)多重熒光RT-PCR檢測
[0055] 20ul的反應體系中依次加入Nuclease-Free Water 2ul、稀釋后的cDNA模板5ul、 ROX Reference Dye lul、引物探針混合液2ul、熒光PCR反應液10ul。
[0056] 在ABI 7500熒光PCR儀上運行程序為：先經過5〇1：21^11，95°(：1〇1^11;然后再經過95 °C 15sec，6CTC30sec，共 45 個循環。
[0057] 擴增過程中儀器自動收集熒光信號。
[0058] (2)數據收集處理和分析
[0059]熒光PCR擴增結束后，首先分析內參GATOH的擴增結果，如果其CT值小于30，表明整 個檢測過程有效;如果其CT值大于35，則需要重新驗證檢測。
[0060] (3)結果檢測
[0061] 本發明多重熒光RT-PCR檢測體系特異性的擴增曲線結果參見說明書附圖2。其中 圖2A為K562陽性細胞系的融合基因檢測結果，圖2B為Kasumi陽性細胞系的融合基因檢測結 果，圖2C為HL60陰性細胞系的融合基因檢測結果，圖2D為陰性對照(水)的檢測結果。
[0062] 從附圖2可以看出，圖2A、2B、2C中都可以檢測到內參GATOH的熒光信號，且GAPDH的 Ct值都小于30，說明整個檢測過程有效。K562陽性細胞系中含有BCR-ABL1的融合基因，R3中 特異性地檢測到FAM標記的BCR-ABL1熒光信號，如圖2A所示；Kasumi陽性細胞系中含有 AML1-ET0的融合基因，R9中特異性地檢測到HEX標記的AML1-ET0熒光信號，如圖2B所示； HL60陰性細胞系中不含融合基因，除了內參GAPDH的熒光信號外，R1-R12中均檢測不到其他 的熒光信號，如圖2C所示；陰性對照無模板，擴增不出內參基因 GATOH和融合基因，因而也檢 測不到熒光信號，如圖2D所示。
[0063] 由此可見，本實施例的檢測結果與融合基因陽性細胞系及陰性細胞系的特性相一 致，表明利用本發明的檢測體系可以特異性地進行白血病融合基因的定性檢測。
[0064] 實施例2:利用融合基因陽性細胞系檢測本發明檢測體系的重復性
[0065] 本實施例同樣以確定含有BCR-ABL1融合基因的K562陽性細胞系、AML1-ET0融合基 因的Kasumi細胞系來驗證本發明檢測體系的重復性。
[0066]具體檢測方法如下：
[0067]采用與實施例1相同的多重熒光RT-PCR反應體系和反應條件，以K562cDNA和 Kasumi cDNA為模板，每個樣本重復檢測三次，重復性檢測的熒光PCR擴增曲線參見說明書 附圖3。其中圖3A為K562陽性細胞系的融合基因檢測結果，圖3B為Kasumi陽性細胞系的融合 基因檢測結果。如圖3A所示，K562的陽性細胞系進行三次重復檢測，均檢測到內參GAPDH基 因和融合基因 BCR-ABL1的熒光信號，且GAPDH和BCR-ABL1的CT值吻合得很好；同樣地， Kasumi的陽性細胞系的三次重復實驗結果也相吻合。通過本實施例表明，利用本發明的檢 測體系進行白血病融合基因的多重熒光RT-PCR定性檢測具有很好的重復性。
[0068]實施例3:利用融合基因陽性細胞系和陰性細胞系檢測本發明檢測體系的靈敏度 [0069] 本實施例同樣以確定含有BCR-ABLl(p210)融合基因的K562陽性細胞系、AML1-ET0 融合基因的Kasumi細胞系以及不含融合基因的HL60陰性細胞系來驗證本發明檢測體系的 靈敏性。具體檢測方法如下：
[0070] 以HL-60細胞系（不含融合基因的陰性細胞系）分別對K562細胞系（含有BCR-ABL1 融合基因的陽性細胞系）和Kasumi細胞系（含有AML-ET0融合基因的陽性細胞系）進行 100 %、10 %、1%、1%〇、0 · 5%〇、0 · 25%〇、0 · 125%〇 (稀釋后陽性細胞系與陰性細胞系的比例）的 稀釋，用稀釋好的混合細胞系提取RNA并逆轉錄成cDNA，進行多重熒光RT-PCR檢測。
[0071] 采用與實施例1相同的多重熒光RT-PCR反應體系和反應條件，多重熒光RT-PCR的 擴增曲線參見說明書附圖4。圖4A 代表 100%Κ562、10%Κ562、1%Κ562、1%〇Κ562、0.5%〇Κ562、 0 · 25%〇Κ562和0 · 125%〇Κ562的熒光檢測結果；圖4B代表 100 %Kasumi、10 %Kasumi、1 % Kasumi、l%〇Kasumi、0 · 5%〇Kasumi、0 · 25%〇Kasumi 和0 · 125%〇Kasumi 的焚光檢測結果。
[0072] 由此可見，當達到0.125%〇K562或0.125%〇Kasumi細胞（8000個HL60細胞中含有1個 K562或1個Kasumi細胞)時，本發明的多重熒光RT-PCR檢測體系檢測出的融合基因 BCR-ABL1 和AML 1 -ΕΤ0的CT值仍小于35，而相應的巢式RT-PCR方法卻檢測不到相應的融合基因。由此 表明，與巢式RT-PCR相比，本發明的多重熒光RT-PCR檢測體系對白血病融合基因的檢測靈 敏度遠高于相應的巢式RT-PCR檢測方法。
[0073]實施例4:采用本發明的檢測體系進行臨床樣本的檢測
[0074]本實施例采集臨床白血病患者外周血或骨髓血樣本，按照本發明的檢測體系進行 45種融合基因的定性檢測。其中檢測到的融合基因的異構體包括8〇?481^1(?190)、8〇?- △81^(?210)、卩]\^-1^1^(1^型）、？]\^-1^1^(5型）、〇8卩8-]\〇^11(厶型）、511^^1^42厶-?8父1、 AML1-ET0、TEL-AML1、SET-CAN、DEK-CAN、MLL-ELL、MLL-AF^PMLL-AF6#。
[0075]利用本發明的多重熒光RT-PCR檢測體系檢測臨床樣本，操作步驟包括血液樣本中 白細胞RNA提取、RNA逆轉錄為cDNA和多重熒光RT-PCR檢測。具體的操作方法同本發明實施 例1。臨床樣本檢測的熒光擴增曲線參見說明書附圖5。其中圖5A為采用本發明的多重熒光 RT-PCR檢測到的4種融合基因異構體的熒光結果，包括BCR-ABLl(pl90)、BCR-ABLl(p210)、 PML-RARA(L型）和PML-RARA(S型）；圖5B為采用本發明的多重熒光RT-PCR檢測到的3種融合 基因異構體的熒光結果，包括CBFB-MYH11(A型）、SIL-TAL1和E2A-TOX1;圖5C為采用本發明 的多重熒光RT-PCR檢測到的4種融合基因異構體的熒光結果，包括AML1-ET0、SET-CAN、DEK- CAN和MLL-ELL。
[0076]由此可見，利用本發明的多重熒光RT-PCR檢測體系，檢測到的臨床樣本融合基因 的型別幾乎覆蓋了臨床上常見的白血病融合基因，且檢測結果與臨床診斷相一致。
[0077]以上結果表明，本發明的多重熒光RT-PCR檢測體系可以全面地進行白血病45種融 合基因的定性篩查。并且與巢式RT-PCR檢測方法相比，本發明的多重熒光RT-PCR檢測體系 具有較高的靈敏度和特異性，檢測工序簡單，大大縮短了檢測時間，為白血病的診斷、化療 及預后提供了一種更加全新快速簡便的基因診斷技術，具有廣泛的臨床應用價值。
[0078]
[0079]
[0080]
[0081：
[0082]
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[0089]
[0090]
【主權項】
1. 一種用于檢測白血病融合基因的引物和探針組合，其由SEQ ID NO.1-114所示的引 物和探針組成。2. 根據權利要求1所述的引物和探針組合，其進一步由第1-12組引物和探針組成，其中 第1組由SEQ ID NO. 1-9所示的引物和SEQ ID NO. 10-11所示的探針組成，第2組由SEQ ID NO. 12-16所示的引物和SEQ ID NO. 17-18所示的探針組成，第3組由SEQ ID NO. 19-27所示 的引物和SEQ ID NO.28-29所示的探針組成，第4組由SEQ ID NO.30-35所示的引物和SEQ ID NO.36-38所示的探針組成，第5組由SEQ ID NO.39-43所示的引物和SEQ ID NO.44-45所 示的探針組成，第6組由SEQ ID NO.46-50所示的引物和SEQ ID NO.51-52所示的探針組成， 第7組由SEQ ID NO.53-59所示的引物和SEQ ID NO.60-62所示的探針組成，第8組由SEQ ID NO.63-66所示的引物和SEQ ID NO.67-88所示的探針組成，第9組由SEQ ID NO.69-76所示 的引物和SEQ ID NO.77-78所示的探針組成，第10組由SEQ ID NO.79-87所示的引物和SEQ ID NO.88-89所示的探針組成，第11組由SEQ ID NO.90-99所示的引物和SEQ ID NO. 100-101所示的探針組成，第12組由SEQ ID NO. 102-111所示的引物和SEQ ID NO. 112-114所示 的探針組成。3. 根據權利要求1或2所述的引物和探針組合，其中部分探針的5'端連接熒光報告基團 FAM，3 '端連接熒光淬滅基團TAMRA;其余探針的5 '端連接熒光報告基團JOE，3 '端連接熒光 淬滅基團TAMRA;內參基因 GAPDH探針的5 '端連接熒光報告基團JOE，3 '端連接熒光淬滅基團 TAMRA〇4. 一種用于檢測白血病融合基因的試劑盒，其包含權利要求1-3中任一項所述的引物 和探針組合。5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其中全部引物的濃度為3ρπι〇1/μ1，全部探針的濃度為 2ρηιο1/μ1 〇6. 權利要求1-3中任一項所述的引物和探針組合在制備檢測白血病融合基因試劑盒中 的應用。7. 權利要求1-3中任一項所述的引物和探針組合，或者權利要求4或5所述的試劑盒在 檢測白血病融合基因中的應用。8. -種檢測白血病融合基因的多重熒光RT-PCR方法，其包含以下步驟： (1) 獲取待測樣品的cDNA; (2) 采用權利要求1-3中任一項所述的引物和探針組合，或采用權利要求4或5所述的試 劑盒，以步驟(1)中獲取的cDNA為模板，進行多重熒光RT-PCR擴增，并收集熒光信號； (3) 分析內參基因 GAPDH的擴增結果，如果CT值小于30,檢測過程有效，如果CT值大于35， 重新進行驗證檢測； (4) 內參基因 GAPDH的CT值小于30時，進行白血病融合基因的結果判讀。9. 根據權利要求8所述的方法，其中部分探針的5 '端連接熒光報告基團FAM，3 '端連接 熒光淬滅基團TAMRA;其余探針的5'端連接熒光報告基團J0E，3'端連接熒光淬滅基團 TAMRA;內參基因 GAPDH探針的5'端連接熒光報告基團JOE，3'端連接熒光淬滅基團TAMRA。10. 根據權利要求8或9所述的方法，其中全部引物的濃度為3ρπι〇1/μ1，全部探針的濃度 為 2ρηιο1/μ1 〇
【文檔編號】C12N15/11GK105838792SQ201610254799
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月22日
【發明人】鄭仲征, 杜金偉, 張鵬, 王莉萍, 潘捷, 杜可明
【申請人】上海荻碩貝肯生物科技有限公司