一種挖掘雞胚胎干細胞向雄性生殖細胞分化過程中關鍵lncRNA 的分析方法
【專利摘要】本發明公開了一種挖掘雞胚胎干細胞向雄性生殖細胞分化過程中關鍵lncRNA的分析方法，本方法首先從如皋黃雞的新鮮受精蛋的胚盤、第19期(72h)的生殖脊和第18天的睪丸，分離出雞ESCs、PGCs和SSCs,并根據CDH1基因設計特異性，以PCR擴增的方法進行性別鑒定，對運用抗體標記的ESCs、PGCs和SSCs進行分選,陽性細胞提取細胞總RNA，純化后對RNA質量進行檢測，檢測合格后進行RNA?Seq測序。將測序結果中篩選出組裝RNA的轉錄本。分離雞ESCs，PGCs和SSCs，提取總RNA，反轉錄為cDNA。對候選的lncRNA進行Trans和Cis靶基因的預測分析，并通過DAVID數據庫查找其GO功能項，再通過GO分析注釋其功能，對其進行功能分析。繪制關鍵lncRNA及其靶基因與相關信號通路之間的關系互作網絡圖。
【專利說明】
一種挖掘雞胚胎干細胞向雄性生殖細胞分化過程中關鍵 IncRNA的分析方法
技術領域：
[0001 ]本發明涉及一種挖掘雞胚胎干細胞向雄性生殖細胞分化過程中關鍵IncRNA的分 析方法，屬于干細胞工程、珍稀物種的保存和組織與細胞工程等領域。 技術背景：
[0002]生殖細胞可以把生物的遺傳信息傳遞給下一代，維持生命的傳遞，對生殖細胞分 化研究具有重要意義。因此生殖細胞可以代替胚胎干細胞用于治療不孕不育癥等疾病，且 不涉及倫理和免疫排斥問題，故如何迅速開展誘導來源于其他組織的干細胞分化成為雄性 生殖細胞的研究顯得很有必要。目前體外將ESC誘導為生殖細胞的研究已經開展多年，一方 面是將外源基因轉入ESC內，促進其向生殖細胞分化，另一方面是向培養基中添加生長因 子、化學誘導劑等，促使ESC中的特定基因表達發生變化，進而引發向生殖細胞方向變化。雖 然這些方法是利用基因和化學試劑進行誘導，且取得了一定的效果，然而效率較低，因此急 需從一個新的方法開展誘導工作來改變這一現狀。
[0003] 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, IncRNA)，是指長度大于200bp的不編碼蛋 白的RNA轉錄本，缺少有效的開放閱讀框。與mRNA相似，IncRNA同樣被RNA polymerase II轉 錄，拼接、多聚腺苷酸化和5'端加帽。目前，已有大量的研究表明，IncRNA在神經細胞、樹突 細胞和造血細胞等細胞分化、增殖以及維持細胞干性過程中起到重要的作用。
[0004] 此外，在生殖方向IncRNA的研究也取得了一定成就。有研究發現在雄性種系發育 過程中的表達并受嚴格調控的IncRNA，發現在雄性生殖細胞發育的過程中IncRNA可以在轉 錄和轉錄后兩個水平調控基因表達;此外，在精子發生過程中，研究報道的兩個精原細胞特 異性IncRNAs，Spga-lncRNAl和Spga-lncRNA 2在體外模型中顯不了顯著的分化抑制效果， 說明其在維持精原細胞的多能性上具有重要的作用。
【發明內容】
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[0005] 針對目前ESC體外誘導為雄性生殖細胞的眾多方法周期長、效率低且操作繁瑣、安 全性低等問題，本發明建立一種挖掘關鍵性IncRNA的分析方法，旨在從基因和化學試劑之 外建立一種新型方法提高ESC體外定向誘導分化為雄性生殖細胞的效率。本發明目的在于 為人們提供一種挖掘雞胚胎干細胞向雄性生殖細胞分化過程中關鍵IncRNA的分析方法。
[0006] 本發明包括以下步驟：
[0007] (1)分別從如皋黃雞的新鮮受精蛋(胚胎發育在X期）的胚盤、第19期（72h)的生殖 脊和第18天的睪丸，分離出雞ESCs、PGCs和SSCs。
[0008] (2)對分離的ESCs和PGCs進行了性別鑒定，根據位于性染色體上的⑶HI基因序列 設計引物，通過PCR方法進行擴增，雄性為一條帶，雌性為兩條帶。
[0009] (3)以流式細胞分選技術，對運用抗體標記的ESCs、PGCs和SSCs進行分選，確保獲 得高純度的細胞。其中選擇SSEA-1、S0X2干細胞表面特異抗原及分子標記物標記ESC，酪氨 酸激酶受體C-kit及SSEA-1標記PGC，精原干細胞重要表面標志integrina6及integrinPl雙 重標記SSC。
[0010] ⑷提取流失分選的陽性細胞總RNA，純化后使用Agilent 2100Bioanalyzer對RNA 質量進行檢測，檢測合格后進行后續試驗。參照Illumina公司mRNA-Seq步驟進行RNA建庫， 在上海歐易生物醫學科技有限公司公司使用Illumina公司HisSeq2000進行測序，上樣量為 50ng。測序結果同數據庫進行比對注釋后，進行后續實驗分析。RNA標準為RIN2 7,28S/18S >0.7〇
[0011] (5)結合Tophat和Cuff link程序包，將測序結果中篩選出組裝RNA的轉錄本。
[0012] (6)篩選出候選IncRNA后，分離雞ESC，PGC和SSC細胞，提取總RNA，反轉錄為cDNA， 以qRT-PCR檢測候選IncRNA的在ESCs、PGCs和SSCs中的表達變化，并與RNA-Seq結果對比。 [0013] (7)對候選的IncRNA進行Trans和Cis革E基因的預測分析，并通過DAVID(http: // david.abcc.ncifcrf.gov/)數據庫查找其G0功能項，再通過G0分析（http:// wego · genomics · org · cn/cgi-bin/wego/index · pi)注釋其功能，對其進行功能分析。同時以 STRING(http://string.embl .de/)，對預測的革巴基因進行蛋白網絡互作分析，并繪制關鍵 IncRNA及其靶基因與相關信號通路之間的關系互作網絡圖。
[0014]眾所周知，體外誘導ESCs分化為生殖細胞對于治療不孕不育癥等疾病具有重要的 推到作用，然而目前的誘導方法主要分為兩類:一方面是將外源基因轉入ESC內，促進其向 生殖細胞分化，另一方面是向培養基中添加生長因子、化學誘導劑等，促使ESC中的特定基 因表達發生變化，進而引發向生殖細胞方向變化。然而這兩種方案效率低下，且存在安全性 問題，因此急需從一個新的方法開展誘導工作來改變這一現狀。本發明從外源基因和化學 試劑之外，從分化過程中的關鍵IncRNA入手，建立一套挖掘雞ESCs分化為雄性生殖細胞分 化過程中的關鍵IncRNA的分析方法，提高ESCs體外誘導分化為雄性生殖細胞的效率。
[0015]針對目前雞ESCs體外誘導為雄性生殖細胞細胞周期長、效率低且操作繁瑣、安全 性低等問題，本發明采用基于RNA-Seq的基礎上，結合Tophat和Cuff link程序以及相關的生 物信息分析技術，建立一套挖掘雞ESC向雄性生殖細胞分化過程中的關鍵IncRNA的新方法， 具有周期短、安全性及可操作性強等優勢，為快速探究關鍵IncRNA功能的分析提供了重要 保障。
[0016] 本發明在RNA-Seq的基礎上，結合Tophat和Cuff link程序以及相關的生物信息分 析技術，挖掘雞ESC向雄性生殖細胞分化過程中的關鍵IncRNA，具有周期短、效率高以及可 操作性強等優勢，為快速探究關鍵IncRNA功能的分析提供了重要保障。
[0017] 本發明的優越性在于：
[0018] 1.制備周期短，制率及安全性高；
[0019] 2.方法簡單易行，可重復性強，在普通實驗室即可進行；
[0020] 3.采用本方法，可以完成IncRNA的前期篩選和分析工作，為后期的功能驗證打下 基礎；
[0021] 4.為禽類干細胞IncRNA的分析研究提供了新的方法，同時也為今后IncRNA在家禽 細胞中的后續研究提供了方法和途徑；
[0022] 5.該技術也適用于其它物種IncRNA，甚至是差異表達基因的分析探究。
【附圖說明】
[0023] 圖1為候選IncRNAs提取流程圖。
[0024] 圖2為差異IncRNAs與特異表達IncRNAs挖掘。
[0025] 圖3為候選IncRNAs相對表達量圖。
[0026] 圖4為IncRNAs與cis，trans革巴基因關系圖。
[0027]圖5為相關IncRNAs預測靶基因 G0功能分析。
[0028] 圖6為相關候選IncRNAs靶基因 STRING蛋白網絡互作圖。
[0029]圖7為相關候選IncRNAs與靶基因及相關信號通路互作關系圖。
【具體實施方式】
[0030] (1)雞ESCs、PGCs和SSCs的分離和純化 [0031] ①雞ESCs的分離
[0032] 新生受精蛋首先使用新潔爾滅清洗后，使用75%的酒精進行再次的消毒后備用。 在超凈臺中進行雞胚盤分離實驗。首先將雞胚鈍端向上握在手中，用鑷子尖頭輕輕在受精 蛋中部鉆出一個小孔后，將鑷子一端插入小孔(插入不要過深，2-5mm為宜），沿著赤道線方 向，依次用鑷子夾碎蛋殼(用力不要過猛，僅夾碎鑷子中間蛋殼即可），延赤道線分離蛋殼一 圈后，輕輕的剝離鈍端蛋殼，在此過程中應盡量保持雞胚水平，防止卵黃隨蛋清流出；剝離 蛋殼后，用鑷子將蛋清從卵黃中分離。
[0033] 使用鑷子的側面撥動卵黃，尋找胚盤(切勿使用尖端）；找到胚盤后，盡量將胚盤撥 到卵黃正中央，用剪刀沿胚盤四周呈正方形剪開卵黃(剪開后胚盤距卵黃四周不宜過大，每 側留2mm左右邊距為宜），此時，使用鑷子夾住將含有胚盤的的正方形卵黃膜一角，沿水平方 向輕輕拉出來(盡量水平，這樣可以減少帶出的卵黃數量），將此卵黃膜放入37°C的PBS的培 養皿中，輕輕晃動培養皿，使卵黃和卵黃膜從胚盤上脫離下來，從而獲得了完整的胚盤。
[0034] 收集單個胚盤放入96孔培養板中，加入適量因子培養基吹散后備用。
[0035] ②雞PGCs的分離培養
[0036]孵化至第19期（72h)，受精蛋進行消毒處理后（同①），將取下的生殖腺發生部位 (雞胚后腸前13/的背外側組織部位)用PBS浸洗三次，5-10ml EDTA-胰蛋白酶細胞消化液室 溫下消化5min，消化時輔以硅化的玻璃吸管輕輕吹。消化結束后，添加含有血清的DMEM培養 基進行終止，2000rpm離心7min，棄上清，重新加入含有血清DMEM重懸細胞，接種到60cm培養 皿中進行差速貼壁，去除其中的血細胞、成纖維細胞等雜細胞，每次差速30min。差速結束后 收集上清備用。
[0037] ③雞SSCs的分離培養
[0038]無菌獲取第18天的雞胚睪丸，用PBS中浸洗三次，在解剖鏡下剝去白膜等。加入適 量的PBS用力吹打。首先用10倍于組織塊體積的膠原酶（lmg/ml)消化，在37°C、5%C02濃度 條件下作用20min，其作用除去精曲小管的間質細胞和一些血管成分，之后用透明質酸酶 (1.5mg/ml)和胰蛋白酶(0.25% )的混合液消化5~lOmin，獲取生精上皮上的SSCs和支持細 胞，以消化液用量10%的FBS終止消化，未消化的組織成分用350目過濾篩過濾除去。過濾液 以1000r/min離心8min，棄上清，用培養液重新懸浮細胞制成單細胞懸液備用。
[0039] ④細胞的性別鑒定
[0040] 為了后續試驗的需要，對分離的ESCs和PGCs進行了性別鑒定，從而保證了樣品的 性別統一。根據位于性染色體上的c D Η 1基因序列設計引物（C H D - F : CTGCGAGAACGTGGCAACAGAGT，CHD-R: ATTGAAATGATCCAGTGCTTG)，通過PCR方法進行擴增，雄性 為一條帶，雌性為兩條的。
[0041 ] ESCs分離過程中收獲的單個胚盤使用200μ1的DMEM培養基懸浮后，取20μ1細胞懸 液加入PCR管中，離心后，棄上清，進行PCR;PGCs使用分離過程中剩余的雞胚勻漿后，吸取2μ 1細胞懸液離心后，棄上清。以細胞沉淀為模板，使用MightyAmpDNAPolymerase進行PCR擴 增，鑒定胚胎的性別。擴增體系為：
[0042]
[0043]
[0044]
[0045]⑤細胞的流式細胞篩選
[0046] 將相同性別細胞收集在一起后，以IX 106個細胞分裝入滅菌指形管，按照懸液體 積1:100加入抗體進行標記，避光孵育lh，lOOOrpm離心5min，棄上清，加入PBS重懸細胞，再 次離心并重懸。取未標記細胞為陰性對照，取單抗體標記細胞為陽性對照。每種細胞使用兩 種抗體進行標記，SSEA-1、S0X2干細胞表面特異抗原及分子標記物標記ESC，酪氨酸激酶受 體C-kit及SSEA-1標記PGC，精原干細胞重要表面標志integrina6及integrinPl雙重標記 SSC，收集雙抗體標記為陽性的細胞，備用。
[0047] (2)Illumina 深度測序
[0048] 使用QIAGEN公司總RNA提取試劑盒進行RNA抽提。總RNA并使用Qi AGENRNeasy? Kit純化后，使用Agilent 2100Bioanalyzer對RNA質量進行檢測，檢測合格后進行后續試 驗。
[0049] 參照Illumina公司mRNA-Seq步驟進行RNA建庫，在上海歐易生物醫學科技有限公 司公司使用Illumina公司HisSeq2000進行測序，上樣量為50ng。測序結果同數據庫進行比 對注釋后，進行后續實驗分析。RNA標準為RIN2 7，28S/18S>0.7。
[0050] (3)組裝RNA轉錄本的篩選
[0051]深度測序后，以獲得數據使用Tophat將測序片段與雞全基因進行比對，從而有效 地將Reads通過剪切點進行拼接。使用Cuff link程序包將比對上的Reads組裝為轉錄本，再 通過Cuffcompare程序(源自Cufflink程序包)對組裝的轉錄本進行注釋分析，進而這些組 裝的轉錄本被分為不同的類別。在這些不同類別的轉錄本中，被注釋為"u"的未知基因間轉 錄本是我們所需要的。而在此過程中，注釋的組裝轉錄本將被與Ensembl和Ref genes等數據 庫中的轉錄本進行比對。然后以一系列的過濾原則對獲取的未知基因間候選IncRNAs進行 過濾，最后以cuff diff程序對過濾后的候選IncRNAs進行差異表達分析。
[0052] (4) qRT-PCR驗證候選IncRNA表達變化
[0053] 探索出差異顯著以及特異表達的候選IncRNA，分離雞ESC，PGC和SSC細胞，利用 Rneasy kit試劑盒提取細胞總RNA，并反轉錄成cDNA，以此為模版進行RT-PCR。按照熒光定 量PCR試劑盒說明，使用SYBR熒光試劑和7900System熒光定量儀器進行Real-time PCR試 驗，最后在Microsoft Excel軟件內用相對定量法分析試驗數據，檢測候選IncRNA在 ESCs、PGCs和SSCs中的表達變化，并與RNA-Seq結果進行對比。
[0054] (5)lncRNA靶基因的預測分析
[0055] ① Trans革E1基因預測分析
[0056] LncRNA的反式作用靶基因主要是基于序列互補進行的。其認為IncRNA序列和對應 的靶基因序列互補，可以將其他因子攜帶到靶基因上進行調控。使用軟件為blast和 RNAplex，blast進行序列互補計算，RNAplex進行熱力學上的互補計算。第一步使用blast軟 件選擇出序列上具有互補性質的革巴基因。參數為:6￥31116 = 16-5，丨(16111：；^7 = 95%。第二步 使用RNAplex進行嚴格篩選，參數為e =-30。
[0057] ②Cis靶基因預測分析
[0058] LncRNA的順式作用靶基因主要是應用于IncRNA在基因組位置與mRNA的關聯，一般 采用mRNA的上下游10K范圍進行關聯。
[0059] (6)靶基因功能及蛋白網絡互作分析
[0060]通過0六￥10(111^。://(13￥丨(1.313(^.11(^;1^(^;1^.8〇￥/)數據庫查找其60功能項，再通過 G0分析(http: //wego · genomics · org · cn/cgi-bin/wego/index ·pi)注釋其功能，對其進行 功能分析。同時以311?1如(111^口://81：1'；[1^.61]1131.(16/)，對預測的革[11基因進行蛋白網絡互作 分析，并繪制關鍵IncRNA及其靶基因與相關信號通路之間的關系互作網絡圖。
[0061] 附圖中，圖1為候選IncRNAs提取流程圖測序片段通過Tophat與雞全基因組比對獲 取匹配的Reads，再以Cuff links程序包組裝、注釋分析、過濾，獲取差異表達的IncRNAs。
[0062] 圖2為差異IncRNAs與特異表達IncRNAs挖掘。（A)ESC vs PGC組中有687個IncRNAs 個顯著上調，632個IncRNAs顯著下調;在ESC vs SSC中顯著上調的IncRNAs有625個，顯著下 調的IncRNAs有557個;在PGC vs SSC組中551個IncRNAs顯著上調，497個IncRNAs顯著下調。 (B)以2倍logFC值分組，在ESC vs PGC組中，處于logFC值在2倍以下、2-4倍、4-6倍、6-8倍、 8-10倍以及10倍以上的IncRNAs分別有752、372、90、17、7和1個$3(^833(：組在2倍以下、 2-4 倍、4-6 倍、6-8 倍、8-10 倍和 10 倍以上logFC 值中分別有 594、394、76、18、GPlflncRNAs; 在PGC vs SSC組中，處于logFC值在2倍以下、2-4倍、4-6倍、6-8倍、8-10倍以及10倍以上的 IncRNAs分別有642、296、61、14、l和0個。（C)在ESCvsPGC和ESCvsSSC兩組中，有24個 IncRNAs同時存在兩組中；在ESC vs PGC和PGC vs SSC中，有10個IncRNAs同時存在兩組中； 在ESC vs SSC和PGC vs SSC兩組中，有6個IncRNAs同時存在兩組中，即在ESC、PGC和SSC中 特異表達的IncRNAs分別有24、10和6個。
[0063] 圖3為候選IncRNAs相對表達量。qRT-PCR結果顯示，有7個差異lncRNAs(lnc-ESCl、 lnc-ESC2、lnc-ESC3、lnc-ESC4、lnc-ESC5、lnc-ESC6 和 lnc-ESC7)和4個ESC 特異性 IncRNAs (lnc-ESC8、lnc-ESC9、Inc-ESCIO 和 lnc-ESCl 1)在ESC 中表達量顯著高于其在 PGC和 SSC 中的 相對表達量;有 1個差異IncRNAs (lnc-PGCl)和3個PGC 特異性IncRNAs (lnc-PGC2、lnc-PGC3 和lnc-PGC4)則在PGC中相對表達量最高；有1個差異lncRNA(lnc-SSCl)和4個SSC特異性 IncRNAs (lnc-SSC2、lnc-SSC3、lnc-SSC4 和 lnc-SSC5)在 SSC 中相對表達量達到頂峰。20 個候 選IncRNAs的在三種細胞中的表達趨勢與其RNA-Seq中表達趨勢一致。
[0064] 圖4為IncRNAs與cis，trans革巴基因關系圖。在20個候選IncRNAs中，12個候選 IncRNAs預測出革巴基因19個，其中trans革巴基因4個，c i s革巴基因15個。（橢圓形:候選IncRNAs; 菱形:cis基因；六邊形:trans基因）。
[0065] 圖5為相關IncRNAs預測靶基因 G0功能分析。（A)靶基因 EPHA3主要在生物調節、細 胞代謝過程、細胞過程調節、大分子代謝過程發揮作用；（B)靶基因 HAT1主要作用于基因沉 默、細胞代謝、細胞生物過程、生物調節等過程；（C)靶基因 SLC25A12在細胞過程、跨膜轉運、 定位等過程起作用；（D)靶基因 GNAQ主要作用于細胞發育、細胞分化、細胞成熟、胚胎發育、 蛋白代謝等過程；（E)靶基因 LYSMD3主要在細胞壁高分子代謝過程、細胞壁高分子分解代謝 等過程發揮影響。
[0066] 圖6為相關候選IncRNAs靶基因 STRING蛋白網絡互作圖。（A)靶基因 SUFU蛋白網絡 互作圖。SUFU互作基因中，Gli家族、SM0及PTCH1均為SHH信號通路的關鍵因子。（B)靶基因 ARL3蛋白網絡互作圖。ARL3互作基因中，PDE6D和TOE8B位于cAMP/cGMP信號通路中。（C)靶基 因 EPHA3蛋白網絡互作圖。EPHA3互作基因中，JAK1、JAK2以及N0TCHUJAG1分別為JAK-STAT 和NOTCH信號通路。（D)靶基因 KLF3蛋白網絡互作圖。KLF3的互作基因中，MADH2和SMAD3是 TGF-β信號通路下游重要的信號分子。（E)靶基因 TRM8蛋白網絡互作圖。TR頂8互作基因中， S0CS1、JAK1和JAK2是JAK-STAT信號通路的重要信號分子。
[0067]圖7為相關候選IncRNAs與靶基因及相關信號通路互作關系圖。（A)正常情況下， PTC1抑制Smo蛋白活性，下游Gli家族蛋白以羧基被截斷的形式進入細胞核，抑制下游基因 轉錄。當PTC1與SHH結合后，解除對Smo蛋白的抑制，使得G1 i家族蛋白與PKA等形成大分子復 合物進入細胞核，激活下游基因轉錄，其中lnc-SSCl通過反向調控SUFU的下調，使SUFU對 Glil蛋白的抑制作用減弱，進而刺激SHH信號通路，促進ESC分化為SSCJBMTP和GTP在胞外 信號傳導后形成cAMP和cGMP，進而激活PKA和PKG，使得蛋白質磷酸化，產生細胞反應，而在 信號傳導的過程中，lnc-ESC2下調促進ARL3的表達，進而抑制TOE8B和TOE6D水解作用，防止 其終止cAMP/cGMP信號，最終促進了ESC向SSC方向分化。（C)胞膜上的受體復合物在接受 TGF-β信號后，活化胞質內的Smad2和Smad3，使其磷酸化，在此過程中，lnc-SSC2反向調節靶 基因 KLF3下調，使其對Smad2和Smad3的直接作用減弱，進而促進其磷酸化，磷酸化后的 Smad2和Smad3與Smad4結合形成Smad復合物異位入核，傳導特異性信號，促進ESC分化為 SSCjDUnc-SSCS上調后反向靶基因 EPHA3表達，從而促進相鄰細胞的Notch配體notchl與 受體Jagl間的相互作用，Notch蛋白經過γ分泌酶的剪切釋放胞質NI⑶，并進入細胞核與轉 錄因子CSL結合，形成NICD/CSL轉錄激活復合體，從而激活基因的轉錄，促進ESC向SSC分化。 (E)在JAK-STAT信號傳導過程中，lnc-ESC2反向調控靶基因 TRM8下調，進而減弱S0CS1對 JAK2誘導STAT3磷酸化的抑制作用，同時也可以使TR頂8與活化STAT3的蛋白抑制劑(PIAS3) 互相作用，抑制PIAS3的功能，促進STAT3磷酸化，TRIM8也可直接與HSP90i3相互作用，促進 STAT3磷酸化二聚體進入核內，進而調芐基因的轉錄，同時lnc-SSC5上調反向調控EPHA3后， 促進JAK1和JAK2誘導STAT3的磷酸化，進而刺激JAK-STAT信號傳導，促進ESC向SSC分化。
[0068] Table 1 Primers of related IncRNAs for qRT-PCR 「00691
12
[0070] Table 2三種細胞均有表達的差異lncRNAs(logFC>8)
[0073] Table 3三種細胞中特異表達的IncRNA 2
[0074]
[0075]
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
[0080] Table 6相關預測靶基因功能
[0081]
【主權項】
1. 一種挖掘雞胚胎干細胞向雄性生殖細胞分化過程中關鍵IncRNA的分析方法，其特征 在于，包括如下步驟： (1) 分別從如皋黃雞的新鮮受精蛋的胚盤、第19期的生殖脊和第18天的睪丸，分離出雞 ESCs、PGCs和SSCs; (2) 對分離的ESCs和PGCs進行了性別鑒定，根據位于性染色體上的⑶HI基因序列設計 引物，通過PCR方法進行擴增，雄性為一條帶，雌性為兩條帶； (3) 以流式細胞分選技術，對運用抗體標記的ESCs、PGCs和SSCs進行分選，確保獲得高 純度的細胞;其中選擇SSEA-US0X2干細胞表面特異抗原及分子標記物標記ESC，酪氨酸激 酶受體C-kit及SSEA-1標記PGC，精原干細胞重要表面標志integrina6及integrinPl雙重標 ESSC; (4) 提取流失分選的陽性細胞總RNA，純化后使用Agilent 2100Bioanalyzer對RNA質量 進行檢測，檢測合格后進行后續試驗。參照Illumina公司mRNA-Seq步驟進行RNA建庫，使用 Illumina公司HisSeq2000進行測序，上樣量為50ng;測序結果同數據庫進行比對注釋后，進 行后續實驗分析;RNA標準為RIN2 7，28S/18S>0.7; (5) 結合Tophat和Cuff link程序包，將測序結果中篩選出組裝RNA的轉錄本； (6) 篩選出候選IncRNA后，分離雞ESC，PGC和SSC細胞，提取總RNA，反轉錄為cDNA，以 qRT-PCR檢測候選IncRNA的在ESCs、PGCs和SSCs中的表達變化，并與RNA-Seq結果對比； (7) 對候選的IncRNA進行Trans和Cis靶基因的預測分析，并通過DAVID數據庫查找其GO 功能項，再通過GO分析注釋其功能，對其進行功能分析。同時以STRING對預測的靶基因進行 蛋白網絡互作分析，并繪制關鍵IncRNA及其靶基因與相關信號通路之間的關系互作網絡 圖。2. 根據權利要求1所述的一種挖掘雞胚胎干細胞向雄性生殖細胞分化過程中關鍵 IncRNA的分析方法，其特征是，步驟(1)中新鮮受精蛋為胚胎發育在X期的新鮮受精蛋。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838791SQ201610252399
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月21日
【發明人】李碧春, 李 東, 張亞妮, 紀艷芹, 王飛, 汪怡臨, 王穎潔, 路鎮宇, 靳鍇, 何娜娜
【申請人】揚州大學