片段化交聯dna的快速分離與檢測試劑盒及方法
【專利摘要】本發明公開一種片段化交聯DNA的快速分離與檢測試劑盒及方法，該試劑盒包括用于片段化DNA解交聯與分離提取的試劑，所述試劑為Chelex100。所述試劑盒可以進一步包括蛋白降解試劑、分子量標記物、加樣承載緩沖液和/或降解RNA的試劑。Chelex?100能夠整合多價金屬離子，具有較高的金屬離子選擇性和結合力，能夠分離DNA，并防止DNA降解。本發明的一種片段化的交聯DNA的快速分離檢測方法，可通過快速質控超聲片段化的效果，決定待檢樣品是需要繼續超聲，還是可用于下一步沉淀實驗；或用于多個待檢樣品超聲優化，以選擇最佳條件。實現用于染色質免疫沉淀(ChIP)等技術中染色質超聲片段化樣品質量的快速檢測，能夠極大地提高了ChIP的成功率。
【專利說明】
片段化交聯DNA的快速分離與檢測試劑盒及方法
技術領域
[0001]本發明涉及片段化DNA的質控。更具體地，涉及一種片段化交聯DNA的快速分離與 檢測。
【背景技術】
[0002] 染色質免疫沉淀技術（chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)是目前研 究體內蛋白質與DNA相互作用的唯一方法，在基因表達調控研究中起著無可替代的作用。真 核生物的基因組DNA與組蛋白等相互作用構成染色質，是遺傳物質的載體和存在形式。研究 染色質中蛋白質與DNA相互作用是闡明基因表達調控機制的基本途徑。
[0003] ChIP的基本原理是在活細胞狀態下通過福爾馬林固定DNA -蛋白質復合物，超聲 隨機剪切形成染色質小片段，經目的蛋白特異性的抗體沉淀，特異性富集目的蛋白結合的 DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。ChIP不僅 可以檢測體內轉錄調控蛋白與DNA的動態相互作用，還可以用來研究染色體組蛋白修飾與 基因表達及活性的關系，已廣泛用于轉錄調控蛋白靶基因的高通量篩選，如ChIP-on-chip， ChlP-seq 等。
[0004] 染色質通過超聲隨機剪切形成染色質小片段，即染色質DNA超聲片段化是ChIP過 程中最為關鍵的步驟之一，也是最難控制的一個技術環節。超聲片段化效果取決于超聲功 率的大小、超聲時間的長短，樣品染色質DNA的濃度、裂解程度、容量，甚至超聲探頭深入樣 品液面多少都會影響超聲片段化的效果，因此即使是優化好的同一條件，在同一時間對不 同的樣品，或不同時間對相同的樣品都會產生不同的結果。而且超聲功率過大、或超聲時間 過長，會引起樣品液體產生泡沫而影響超聲效果，或導致樣品中蛋白質變性失活，或導致染 色質DNA片段過短。反之，超聲功率過小、或超聲時間過短，會導致樣品中染色質DNA片段過 長，影響染色質DNA的沉淀效果，導致非特異性增加。染色質免疫共沉淀反應之前需要檢測 染色質DNA超聲片段化效果，優化染色質剪切條件。因此，染色質DNA超聲片段化的檢測至關 重要。
[0005] 由于染色質DNA超聲片段化的過程是不可逆的，因此，人們傾向于減小輸出功率、 延長超聲時間進行優化，但目前的檢測方法，都必須經過4小時以上解交聯過程，并經過繁 瑣(酚氯仿)或昂貴(試劑盒)的DNA片段分離純化，費時超過1天，而且因為回收效果的問題， 不能忠實、精確反映待檢樣品DNA片段的實際大小（圖1)。在染色質DNA超聲片段化的的質檢 過程中，樣本或凍存、或繼續加入抗體沉淀，如果超聲片段化的效果不佳(如DNA片段過長）， 待檢樣品或被廢棄（因凍存無法再進行超聲片段化處理），或即使已加入抗體沉淀也不得不 終止反應廢棄。
[0006] 因此，急需一種快捷的質控超聲片段化效果的檢測試劑盒和方法。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的第一個技術問題是提供一種片段化交聯DNA的快速分離檢測試劑 盒。
[0008]本發明解決的第二個技術問題是提供一種片段化交聯DNA的快速分離檢測方法。 [0009]為解決上述技術問題，本發明采用下述技術方案：
[0010] -種片段化交聯DNA的快速分離與檢測試劑盒，該試劑盒包括用于片段化DNA解交 聯與分離提取的試劑，所述試劑為Che 1 ex 100。
[0011] 所述試劑盒進一步包括蛋白質降解試劑，所述蛋白質降解試劑選自能夠降解組蛋 白的蛋白酶。優選地，所述蛋白酶是ChIP級蛋白酶。優選地，所述蛋白酶選自蛋白酶K、胰蛋 白酶和組織蛋白酶中的一種或多種。其中所述蛋白酶K是一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白 酶。所述胰蛋白酶是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。組織蛋白酶是來源 于各種動物組織的細胞內的一類由組織蛋白酶A、B、C、D和/或E等多種酶組成的蛋白酶。
[0012] 所述試劑盒進一步包括加樣承載緩沖液，所述加樣承載緩沖液可選自但不限于商 業出售的加樣承載緩沖液。優選地，所述加樣承載緩沖液包括示蹤核酸分子電泳迀移速度 的染料，優選地，所述染料分子量相當于50_400bp的DNA，更優選地，所述染料分子量相當于 50-150bp的DNA，更優選地，所述染料分子量相當于50bp的DNA。為避免常規的DNA的加樣緩 沖液顏色因與DNA片段重疊造成的遮蓋干擾。所述染料選自但不限于二甲苯藍、甲酚紅、溴 酸藍、橙黃G和梓檬黃中的一種或多種。
[0013] 所述試劑盒進一步包括分子量標記物(DNA ladder marker)，用于DNA凝膠電泳時 指示待測樣本的分子量。
[0014] 所述試劑盒進一步包括RNA降解試劑。所述RNA降解試劑用于降解樣品中的RNA，減 少RNA對待檢測DNA的干擾。所述RNA降解試劑選自但不限于商業出售的相關試劑，如RNaseA 或RNase H〇
[0015] 所述Chelex 100是一種微珠，一直作為微量DNA的提取試劑來應用，未曾用于片段 化的交聯DNA的分離，
【申請人】發現特殊的條件下，Chelex 100能夠將片段化的交聯DNA與蛋 白質分離，特別是能夠將片段化的交聯染色質DNA與蛋白質分離。優選地，所述試劑盒中， Chelex 100的濃度為2-40% (g/mL)，優選地為濃度為10% (g/mL)，即100ml溶液中含有10g Chelex 100,其中所述溶液為能夠發揮并穩定Chelex 100的理化性質，同時抑制細菌或真 菌產生和生長的常規溶液，如20 %乙醇溶液。
[0016] -種片段化交聯DNA的快速分離與檢測的方法，該方法包括如下步驟:在樣品中加 入蛋白質降解試劑，孵育;添加片段化DNA解交聯與分離提取的試劑，震蕩；高溫震動孵化； 離心留取上清;加樣承載緩沖液至上清中；電泳檢測。
[0017] 優選地，所述震蕩時間為5-30S，更優選地，震蕩時間為1 Os
[0018] 所述高溫震動孵化條件為80-100°C，100-1500轉/分，5-30min，優選地，所述高溫 震動孵化條件為95°C，500轉/分，lOmin。
[0019] 所述快速分離檢測方法進一步包括將上清轉入新的管中。
[0020] 所述快速分離檢測方法進一步包括加入RNA降解試劑，優選地，且加入RNA降解試 劑后孵育，優選地于室溫孵育。
[0021] 所述電泳檢測是進行凝膠分析或快速凝膠分析，優選地用1.2%凝膠進行電泳分 析。
[0022]本發明的有益效果如下：
[0023]
【申請人】首次通過一種較高的金屬離子選擇性和較強的結合力化學整合樹脂 Chelex-100,進行DNA分離，并通過優化探索，發明一種片段化的交聯DNA的快速分離檢測方 法，可通過快速質控超聲片段化的效果，決定待檢樣品是需要繼續超聲，還是可用于下一步 沉淀實驗;或用于多個待檢樣品超聲優化，選擇最佳條件。本發明方法為染色質DNA超聲片 段化這一 ChIP過程中最為關鍵、也是最難控制的一個技術環節提供快速有效的質控檢測， 不僅節省樣本資源，而且能夠極大地提高ChIP的成功率。
【附圖說明】
[0024]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0025] 圖1示出凝膠電泳分析新發明方法分離的片段化DNA。
【具體實施方式】
[0026] 為了更清楚地說明本發明，下面結合優選實施例和附圖對本發明做進一步的說 明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具體 描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發明的保護范圍。
[0027]實施例1:實驗方法建立 [0028] 1.染色質DNA超聲片段化
[0029]步驟：
[0030] 1)制備細胞裂解液，轉移10yL細胞裂解液至1.7yL微型離心機管(EP管），標記為 S0；
[0031] 2)DNA片段化條件：使用Sonicator 3000(MIS0NIX，Part#S3000)超聲儀的 1/16英 寸探針進入細胞裂解樣品液面下2-3毫米的深度。超聲裂解樣品中染色質DNA，設置超聲儀 功率:0.5W，時間：2sec開/15sec關，共8次為一輪。
[0032]按上述條件超聲，每輪超聲一輪后轉移10此細胞裂解液至1.7mL EP管，分別標記 為 S1、S2、S3 等。
[0033] 如果樣品出現泡沫，立即停止超聲，在4°C下6000g離心樣品lmin，以消除泡沫，泡 沫消除后繼續超聲。
[0034] 如果繼續出現泡沫，調整超聲儀的設置如下：功率，2.5W;時間：lOsec開/30sec關， 總時間：1-3分鐘。
[0035] 2.片段化的交聯DNA的快速分離與檢測
[0036] 1)在10μL7樣品加入2yL ChIP-Grade蛋白酶K和8yL ddH20,混合均勻，短暫離心 (100rpm，5sec)，室溫孵化，10min;
[0037] 2)添加25yL Chelex 100微珠溶液，震蕩lOsec;
[0038] 3)高溫震動孵化，條件為:95 Γ，500轉/min，10min;
[0039] 4)離心，離心力3000-14000 X g，室溫下離心時間為30sec;
[0040] 5)取20yL上清轉移到新離心管中，加入2yL RNAse，及4yL的6X加樣承載緩沖液， 混合均勻；
[0041] 6)用1.2 %凝膠進行凝膠分析。
[0042]見圖1，其中Ml和M2是分子量范圍不同的分子量標記物。隨著超聲次數的增加，在 500-1000bp之間的DNA的片段大小，在樣品SI、S2和S3中依次減小。
[0043] 實施例2:傳統方法與本發明方法對比
[0044] 傳統方法與本發明方法在時間和效果等方面的對比，對比結果見表1。
[0045] 表1:傳統方法與本發明方法對比的對比
[0046]
[0047] 通過對比可見，本發明方法省時省力，而且能夠極大地提高ChIP的成功率。
[0048]顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對 本發明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可 以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發 明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之列。
【主權項】
1. 一種片段化交聯DNA的快速分離與檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括用于片段 化DNA解交聯與分離提取的試劑，所述試劑為Chelex 100。2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述Chelex 100的濃度為2-40% (g/ mL) 〇3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進一步包括蛋白質降解試 劑。4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述蛋白降解試劑選自蛋白酶K、胰蛋白 酶(Trypsin)和組織蛋白酶(cathepsin)中的一種或多種。5. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進一步包括加樣承載緩沖 液，所述加樣承載緩沖液包括示蹤核酸分子的染料。6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述染料分子量相當于50-400bp的DNA; 優選地，所述染料分子量相當于50-150bp的DNA，更優選地，所述染料分子量相當于50bp的 DNA〇7. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述染料選自二甲苯藍、甲酚紅、溴酚 藍、橙黃G和梓檬黃中的一種或多種。8. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進一步包括分子量標記物。9. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進一步包括RNA降解試劑，優 選地，所述RNA降解試劑為RNaseA或RNase H。10. -種片段化交聯DNA的快速分離檢測方法，該方法包括如下步驟： 將樣品中加入蛋白降解試劑，孵育;添加片段化DNA解交聯與分離提取試劑，震蕩;高溫 震動孵化;離心留取上清;加樣承載緩沖液至上清中；電泳檢測； 優選地，所述快速分離檢測方法進一步包括將上清轉入新的管中； 優選地，所述快速分離檢測方法進一步包括加入RNA降解試劑，且加入RNA降解試劑后 孵育，優選地，于室溫孵育。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838783SQ201610166405
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月22日
【發明人】黃家強, 景坤玉, 林舒曄, 林博楠
【申請人】北京交通大學, 黃家強