一種測定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種測定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒及其制備方法，包括的成分及相應含量為：試劑R1：緩沖液20~180 mmol/L、吐溫?20 0.1~1.0 g/L，其溶劑為純化水，試劑R2：緩沖液20~180 mmol/L、L?亮氨酰?P?硝基苯胺0.1~15.0 mmol/L、復合酶穩定劑0.1~1.0mL/L，其溶劑為純化水，制備方法和使用方法包括以下步驟：按照組分含量配制好試劑；將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應；用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值；根據吸光度變化值計算出樣本中的亮氨酰氨基肽酶的濃度。本發明具有穩定性好、測定準確度高等優點。
【專利說明】
-種測定亮氨醜氨基化酶的試劑盒及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明設及醫學及生物化學技術領域，具體來說是一種測定亮氨酷氨基膚酶的試 劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 亮氨酷氨基膚酶(LAP)是一種蛋白分解酶，能水解膚鏈N端并由亮氨酸與其它氨基 酸形成膚鍵的酶，其廣泛分布于肝、膜、腎等組織中，其中肝內含量最高，當肝內外膽渺時， 亮氨酷氨基膚酶活力顯著增高，尤其在惡性膽渺時，其活力隨病情進展而持續增高，除了肝 臟病變外，亮氨酷氨基膚酶在膽囊、膜腺等組織病變時，亦可出現血清亮氨酷氨基膚酶的升 高，亮氨酷氨基膚酶不像其它肝功的酶，只能檢測血液樣本，亮氨酷氨基膚酶還可W檢測尿 液，在一些病例中，可W檢測尿液中亮氨酷氨基膚酶的變化，而不必采血。
[0003] 亮氨酷氨基膚酶亦可W反應早期的腎功能的損害和程度，并為臨床鑒別腎小球、 腎小管損傷提供可能的幫助。
[0004] 目前，市場上的對亮氨酷氨基膚酶的檢測試劑盒不僅操作復雜，而且測定的準確 度、精密度均比較差，需要進行改進。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是為了克服現有的技術操作復雜、準確度和精密度均 比較差的缺陷，而提供一種測定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒及其制備方法。
[0006] 本發明解決上述技術問題提供的技術方案是:本發明公開了一種測定亮氨酷氨基 膚酶的試劑盒，包括彼此獨立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑Rl: 緩沖液 20~180 mmol/L 吐溫-20 0.1 ~1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[0007] 試劑 R2: 緩沖液 20~180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 0. ^15.0 mmol/L 復合酶穩定劑 0.1~1.0血/L 其溶劑為純化水。
[000引作為優選，本發明公開了一種測定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒，包括彼此獨立的試 劑Rl和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑Rl: 緩沖液 100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 試劑 R2: 緩沖液 100 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 復合酶穩定劑 0.5mL/L 其溶劑為純化水。
[0010] 作為優選，所述的試劑Rl中，所述的緩沖液采用憐酸鹽緩沖液、=徑甲基氨基甲燒 緩沖液、1,4-贓嗦二乙橫酸緩沖液、4-徑乙基贓嗦丙橫酸緩沖液、4-徑乙基贓嗦乙橫酸緩沖 液、=徑甲基甲胺基丙橫酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、棚酸緩沖液、3-嗎嘟丙橫酸緩沖液、3-(N-嗎嘟基)-2-徑丙基橫酸緩沖液、2-嗎嘟乙橫酸緩沖液、憐酸二氨鋼緩沖液中的一種或多 種的組合，所述的試劑R2中，所述的緩沖液采用憐酸鹽緩沖液、=徑甲基氨基甲燒緩沖液、 1,4-贓嗦二乙橫酸緩沖液、4-徑乙基贓嗦丙橫酸緩沖液、4-徑乙基贓嗦乙橫酸緩沖液、S徑 甲基甲胺基丙橫酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、棚酸緩沖液、3-嗎嘟丙橫酸緩沖液、3-(N-嗎嘟 基)-2-徑丙基橫酸緩沖液、2-嗎嘟乙橫酸緩沖液、憐酸二氨鋼緩沖液中的一種或多種的組 厶 1=1 O
[0011] 作為優選，所述的試劑R2中，所述的復合酶穩定劑采用聚乙二醇、甘油、海藻糖、山 梨醇、牛血清白蛋白中的一種或多種的組合。
[0012] 作為優選，本發明還公開了上述測定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒的制備方法和使用 方法，包括W下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 緩沖液 20~180 mmol/L 吐溫-20 0.1 ~1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[OOU]試劑 R2: 緩沖液 20~180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 0. ^15.0 mmol/L 復合酶穩定劑 0.1~1.0血/L 其溶劑為純化水。
[0014] (b)將待測樣本與試劑Rl和試劑R2混合，使其充分反應； (C)用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d)根據吸光度變化值計算出樣本中的亮氨酷氨基膚酶的濃度。
[0015] 本發明的檢測原理是:樣品中的亮氨酷氨基膚酶催化水解底物k亮氨酷-P-硝基 苯胺，生成亮氨酸和對硝基苯胺，用405nm波長檢測吸光度的變化率，求出樣品中亮氨酷氨 基膚酶的活性。 「mi Al T干斗、下 OXH白 I主 VU/Ly- LS 八 V U/Ly
式中：A Au/min 待測樣品平均每分鐘的吸光度變化值 A Ae/min 校準液平均每分鐘的吸光度變化值 Cs 校準液中亮氨酷氨基膚酶的濃度 與現有技術相比，本發明具有W下有益優點:本發明所述的測定亮氨酷氨基膚酶的試 劑盒通過添加復合酶穩定劑，復合酶穩定劑可W有效的提高k亮氨酷-P-硝基苯胺的穩定 性，運樣在測試的過程中，整個反應也就更趨于穩定，因此本發明所述的測定亮氨酷氨基膚 酶的試劑盒的穩定性好、測定準確度高，另外本發明制備方法簡單、成本低，另外操作也比 較方便。
【具體實施方式】
[0017] W下結合具體實施例進一步說明，但本發明并不僅限于運些實施例。
[001引實施例1 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其中 試劑Rl: S徑甲基氨基甲燒緩沖液 100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶劑為純化水。
[0019] 試劑R2: 2-嗎嘟乙橫酸緩沖液 100 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 海藻糖 0.5mL/L 其溶劑為純化水。
[0020] 實施例2 本發明的試劑盒包括彼此獨立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其中 試劑Rl: 甘氨酸緩沖液 20mmol/L 吐溫-20 1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[00別]試劑R2: 4-徑乙基贓嗦乙橫酸緩沖液 180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 15.0 mmol/L 甘油 0.1血/L 其溶劑為純化水。
[0022]實施例3 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: S徑甲基氨基甲燒緩沖液100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶劑為純化水。
[002；3]試劑 R2: 2-嗎嘟乙橫酸緩沖液 100 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 海藻糖 0.5mL/L 其溶劑為純化水。
[0024] 2、全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長405皿、副波長505皿； (C)反應時間：8min，其中，解育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度Al, 3min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d)反應方向：正反應。
[00巧]3、檢測步驟 (a) 取2(K)山試劑Rl與12.5山待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下解育5min; (C)加入50iil試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，3min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 AA = A2-A1； 'J、訪舊
巧奪T 的巧化W/ U= LS A I U/ L八T異卞奪T的巧勃?腳:安L萃趴曬:的W議。
[00%] 實施例4 試劑盒的制備和使用方法 1、按照下列組分含量配制好試劑： 試劑Rl: 甘氨酸緩沖液 20mmol/L 吐溫-20 1.0 g/L 其溶劑為純化水。
[0027]試劑 R2: 4-徑乙基贓嗦乙橫酸緩沖液 180 mmol/L k亮氨酷-P-硝基苯胺 15.0 mmol/L 甘油 0.1血/L 其溶劑為純化水。
[0028] 2、全自動生化分析儀參數設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長405皿、副波長505皿； (C)反應時間：8min，其中，解育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度Al, 3min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d)反應方向：正反應。
[0029] 3、檢測步驟 (a) 取2(K)山試劑Rl與12.5山待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下解育5min; (C)加入50iil試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，3min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 AA = A2-A1； (d)巧據
巧傘中LAF的巧巧W/U= Us X LU/U訂昇出巧傘中的兌到斷到巷職暇的m設。
[0030] 表1為實施例1所制得的測定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒W及實施例2所制得的測定 亮氨酷氨基膚酶的試劑盒分別對質控品1進行測定的結果，其中質控品1中的亮氨酷氨基膚 酶的濃度為14U/L，測定結果見表1: 泰1
由表1可知，本發明所制得的測定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒對質控品1的測定結果偏差 較小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0031] 表2為實施例1所制得的測定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒W及實施例2所制得的測定亮氨 酷氨基膚酶的試劑盒分別對質控品2進行測定的結果，其中質控品2中的亮氨酷氨基膚酶的 濃度為21U/L，測定結果見表2: 表2
出巧ZKi畑，奪乂明所明巧的觀U疋巧安L腳:安L萃趴贈的W化I品:刈胸巧而ZtfJ觀U疋巧宋1炯左 較小，因此測定準確度高，而且實施例1為最優的選擇。
[0032] 表3為實施例3所制得的測定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒對同一待測樣本進行的多 次反復測定W及實施例4所制得的測定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒對同一待測樣本進行的多 次反復測定，對所得的結果進行SD和CV的計算，結果如下： 表3
由表3可知本發明所制得的測定亮氨酷氨基膚酶的試劑盒的精密度比較好，而且由表1 可知，實施例3為最優的選擇。
[0033]上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟 悉此技術的人±皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因 此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所掲示的精神與技術思想下所完 成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。
【主權項】
1. 一種測定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2 雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 20~180 mmol/L 吐溫-20 0.1-1.0 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 20~180 mmol/L L_亮氨酰-P-硝基苯胺 0.1~15.0 mmol/L 復合酶穩定劑 0.1~1. OmL/L 其溶劑為純化水。2. 根據權利要求1所述的一種測定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒，其特征在于:包括彼此獨 立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: 緩沖液 100 mmol/L 吐溫-20 0.5 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 100 mmol/L L_亮氨酰-P-硝基苯胺 7.5 mmol/L 復合酶穩定劑 0.5mL/L 其溶劑為純化水。3. 根據權利要求1或2所述的一種測定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R1中，所述的緩沖液采用磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、1，4_哌嗪二乙磺酸 緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸 緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥丙基磺酸緩 沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或多種的組合，所述的試劑R2中， 所述的緩沖液采用磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、1，4_哌嗪二乙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、三羥甲基甲胺基丙磺酸緩沖液、甘 氨酸緩沖液、硼酸緩沖液、3-嗎啉丙磺酸緩沖液、3-(N-嗎啉基)-2-羥丙基磺酸緩沖液、2-嗎 啉乙磺酸緩沖液、磷酸二氫鈉緩沖液中的一種或多種的組合。4. 根據權利要求1或2所述的一種測定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒，其特征在于:所述的 試劑R2中，所述的復合酶穩定劑采用聚乙二醇、甘油、海藻糖、山梨醇、牛血清白蛋白中的一 種或多種的組合。5. 根據權利要求1或2所述的一種測定亮氨酰氨基肽酶的試劑盒的制備方法和使用方 法，其特征在于:包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好試劑： 試劑R1: 緩沖液 20~180 mmol/L 吐溫-20 0.1-1.0 g/L 其溶劑為純化水 試劑R2: 緩沖液 20~180 mmol/L L_亮氨酰-P-硝基苯胺 0.1~15.0 mmol/L 復合酶穩定劑 0.1~1. OmL/L 其溶劑為純化水 (b) 將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應； (c) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (d )根據吸光度變化值計算出樣本中的亮氨酰氨基肽酶的濃度。
【文檔編號】C12Q1/37GK105838775SQ201610279879
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月28日
【發明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運
【申請人】安徽伊普諾康生物技術股份有限公司