一種提高芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率的方法
【專利摘要】本發明具體涉及一種提高芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率的方法，屬于生物工程領域。該提高芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率的方法，其特征是在發酵初期向發酵培養基中添加定量乙醛，同時通過加入NaOH使發酵液PH的處于弱堿性狀態下，以提高芽孢桿菌的四甲基吡嗪產量。本發明的優點如下：通過在發酵初期加入乙醛提高了四甲基吡嗪的產量，另外弱堿性條件控制顯著提高四甲基吡嗪產量，該方法不僅經濟環保，而且生產成本低。
【專利說明】
一種提高芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種提高芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率的方 法。
【背景技術】
[0002] 四甲基吡嗪(TTMP)，又名川芎嗪，是中藥川芎中的有效活性成分，可以降血壓，在 治療腦血管、肺水腫、腎臟疾病方面有顯著療效，并在醫藥合成中被廣泛應用，已作為常備 藥品廣泛應用于臨床。TTMP又是一種重要的呈香物質，天然存在于白酒、可可豆、茶、牛羊豬 肉、奶酪、堅果中，具有烤面包、烤肉等香氣，國家標準GB2760-1996規定其為允許使用的食 用香料。目前，在白酒行業中對吡嗪類化合物的研究已有較高的重視度，初步證實了白酒中 TTMP除美拉德途徑產生外，微生物代謝產物途徑也能產生TTMP，但其代謝途徑及調控機理 尚不明確。
[0003] 釀酒中產生吡嗪類化合物多以細菌發酵為主，尤其以芽孢桿菌類菌株中的枯草芽 孢桿菌和地衣芽孢桿菌為主。由于釀酒中產生TTMP的合成機理尚不清晰，通過野生菌株利 用自身代謝途徑發酵生產TTMP的生產力較低;通過添加前體物質(3-羥基丁酮)可以有效強 化代謝通路，但是生產成本較高、成本效益較低;通過發酵培養基和培養條件優化及對其發 酵過程的調控，可有效提高發酵體系中TTMP的產量，但存在產物抑制等現象的束縛;通過對 菌株進行基因改造也可有效提高TTMP的產量，但分子改造菌株應用于食品發酵類的生產， 存在遺傳穩定性和安全性的隱患，難以進行工業化生產。
【發明內容】
[0004] 為了解決上述問題，本發明提供了一種低生產成本芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率 的方法。
[0005] 本發明所采用的具體技術方案如下： 一種提高芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率的方法，以芽孢桿菌為出發菌株的搖瓶發酵培 養，其特征是在發酵初期向發酵培養基中加入乙醛至1. 〇 g/L，且在發酵過程中從第72h開 始，通過流加10m〇l/L NaOH控制發酵體pH處于弱堿條件下，發酵溫度為37 °C，繼續發酵至 TTMP達到峰值。
[0006] 經實驗，所述制作種子液和發酵過程pH為7.5時取得效果最好。
[0007] 具體操作時，所述芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌(B.lincheniformis BL1)或枯草芽孢 桿菌(B.subtilis BS2)任一株。
[0008] 1.弱堿性條件控制提高TTMP產量 利用地衣芽抱桿菌（Baclicus lincheniformis BL1)、枯草芽抱桿菌（Baclicus subtilis BS2)利用發酵培養基搖瓶發酵生產TTMP的過程中，通過流加10mol/L NaOH控制 發酵體系pH呈弱堿性條件，期間向裝有200ml含70 g/L葡萄糖的YPG發酵培養基的500 mL三 角瓶的發酵體系中，以每12 h補加5 mL濃度為1 mg/mL的葡萄糖溶液，發酵時間分別為 168h、192h。
[0009] 2.發酵初期添加乙醛 (1)在地衣芽孢桿菌(B.lincheniformis BL1)搖瓶發酵初期，向發酵培養基中加入乙 醛至1.0 g/L的乙醛，發酵時間為168h。
[0010] (2)在枯草芽孢桿菌(B.subtilis BS2)搖瓶發酵初期，向發酵培養基中加入乙醛 至1.0 g/L，發酵時間為192h。
[0011] 制作種子液，搖瓶制作種子液的培養基為LB培養基，LB培養基的各種成份g / L計： 蛋白胨1 〇、酵母浸粉5、氯化鈉10，pH 7.0，121 ° C滅菌20min;培養方法:在無菌條件下，用接 種環取一環活化好的芽孢桿菌種接種到裝有50 mL LB培養基的250 mL三角瓶中，37 °C、 200 r/min搖床振蕩培養12 h，然后按接種量2 % (V/V)接到裝有50 mL含10 g/L葡萄糖的 LB培養基的250 mL三角瓶中，37 °C、200 r/min搖床振蕩培養12 h，調整菌體生長量OD600為0.05,作為種子液。
[0012]上述搖瓶發酵培養基也可以采用YPG培養基，所用YPG培養基每L含葡萄糖100 g， 蛋白胨30 g，酵母浸粉10 g，磷酸氫二銨30 g，pH調至7.5，121°C。
[0013] 發酵培養方法:將種子液按4 %的接種量(V/V)接種到裝有200ml含70 g/L葡萄糖 的YPG培養基的500 mL三角瓶中，37°C、200r/min振蕩培養，期間每12h補加5ml濃度為lmg/ 1111的葡萄糖溶液。從第7211開始，通過流加1〇111〇1/1他0田空制發酵體系?!1均為7.5，繼續發酵 至TTMP達到峰值。
[0014] 本發明提高芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率的方法的有益效果：生產過程操作簡 單，綠色環保，反應溫和、且成本低，僅需要在發酵初期添加乙醛就可以調控提高發酵產物 3-羥基丁酮，四甲基吡嗪(TTMP)的產量。另外乙醛做為國家標準GB2760-1996規定的允許使 用的食用添加劑，本發明提高芽孢桿菌產四甲基吡嗪產量的作用優越于培養基及發酵條件 的優化方法，比通過分子改造菌株提高TTMP產量更安全穩定，對環境無污染、無毒害，低用 量、無公害，操作簡單，用途廣等優點。該技術符合我國節能減排的要求，并且可以變通運用 除地衣、枯草芽孢桿菌之外的類似機理的生物發酵產業當中去，具有廣闊的應用前景，且適 于工業化生產。
【附圖說明】
[0015]圖1葡萄糖在BL1和BS2兩種芽孢桿菌中生成3-羥基丁酮和TTMP的共通代謝途 徑。
[0016] 圖2添加乙醛調控(實心)對B.lincheniformis BL1的TTMP產量（▲)菌體量(·） 和葡萄糖利用率（)的影響。
[0017] 圖3添加乙醛調控(實心）對B.subtilis BS2的TTMP產量（▲)菌體量（·）和葡萄 糖利用率（)的影響。
【具體實施方式】
[0018]下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明，本發明利用芽孢桿菌生產 四甲基吡嗪的方法，以芽孢桿菌為出發菌株的搖瓶發酵培養，其特征是在發酵初期向發酵 培養基中加入乙醛至1.0 g/L，且在發酵過程中從第72h開始，通過流加10m〇l/L NaOH控制 發酵體pH處于弱堿條件下，發酵溫度為37 °C，繼續發酵至TTMP達到峰值。
[0019] 實施例一:應用pH控制發酵提高芽孢桿菌產TTMP的能力 步驟一:種子液的準備:在無菌條件下，用接種環取一環活化好的芽孢桿菌種接種到裝 有50 mL LB培養基的250 mL三角瓶中，37 °C、200 r/min搖床振蕩培養12 h，然后按接種量 2 % (V/V)接到裝有50 mL含10 g/L葡萄糖的LB培養基的250 mL三角瓶中，37 °C、200 r/ min搖床振蕩培養12 h，調整菌體濃度(OD600)為0.05，作為種子液。
[0020] 步驟二:將種子液按4 %的接種量(V/V)接種到裝有200ml含70 g/L葡萄糖的YPG培 養基的500 mL三角瓶中，37°C、200r/min振蕩培養，期間每12h補加 5ml濃度為lmg/ml的葡萄 糖溶液，從第72h開始，通過流加 10m〇l/L NaOH控制發酵體系pH為6.5-8.5，繼續發酵至TTMP 達到峰值，發酵過程中間隔一定時間取樣分析發酵液中菌體濃度(〇D6Q())、TTMP和3-羥基丁 酮的含量。不同pH控制值下地衣芽孢桿菌(Baclicus lincheniformis BL1)、枯草芽孢桿菌 (Baclicus subtilis BS2)的菌體濃度(0D6Q())、TTMP和3-羥基丁酮的最大產量分別如表1所 示，當控制發酵液pH值為7.5時，地衣芽孢桿菌(B. lincheniformis BL1)和枯草芽孢桿菌 (B.subtilis BS2)的菌體濃度(0D6Q())、TTMP和3-羥基丁酮的產量均能達到最大值。
[0021 ]表 1 培養條件中pH對B. lincheniformis BL1 和B.subtilis BS2產物3-羥基丁酮和 TTMP的影響
3從接種到3-羥基丁酮產量達到最高時的發酵時間。 1 b從接種到TTMP產量達到最高時的發酵時間。
[0023]數據是三組實驗的平均值和標準偏差。
[0024]實施例二:應用發酵初期添加乙醛調控TTMP產量的能力 按照實施例1中的種子液制備及控制發酵液pH值為7.5時的發酵方法，在發酵初期向培 養基加入梯度濃度的乙醛:1.0，2.0，4.0和8.0 g/L，進行發酵試驗至TTMP達到峰值，發酵過 程中間隔一定時間取樣分析發酵液中菌體濃度(〇D_)、TTMP和3-羥基丁酮的含量。
[0025] 1)隨著乙醛添加量由0 g/L增加到1.0 g/L，地衣芽孢桿菌（B.lincheniformis BL1)產TTMP的最高產量由37.89 g/L提高到43.13 g/L。當培養基中乙醛的添加量提高到 1.0 g/L以上時，發酵產物TTMP的產量不再增加并且隨著乙醛添加量的增加有所減少。同 時，隨著添加乙醛量的增加，細胞生長受到較大影響。乙醛的添加，可以提高TTMP和3-羥基 丁酮的產量，對菌體細胞生長量有較大抑制作用，對葡萄糖利用率也有影響，見表2,圖2。綜 合考慮發酵時間以及乙醛添加量、產物量，可見，乙醛調控地衣芽孢桿菌 (B.lincheniformis BL1)發酵產物，最佳添加量為1.0 g/L，發酵168h可以得到43.13 g/L TTMP的產量。總體上，添加乙醛調控3-羥基丁酮和TTMP的產量影響有一致性，針對地衣芽孢 桿菌(B. lincheniformis BL1)的發酵生產是有效可行的。
[0026] 2)隨著乙醛添加量由0 g/L增加到1.0 g/L，枯草芽孢桿菌(B.subtilis BS2)產 TTMP的最高產量由21.84 g/L提高到27.64 g/LJTMP的合成受添加乙醛的影響，當培養基 中乙醛的添加量提高到1.0 g/L以上時，發酵產物TTMP的產量不再增加并且隨著乙醛添加 量的增加有較大降低，當乙醛的添加量提高到8.0 g/L時，TTMP和3-羥基丁酮的產量都降到 1.0 g/L以下。同時，隨著乙醛添加量的增加，細胞生長受到較大影響。乙醛的添加，可以提 高TTMP和3-羥基丁酮的產量，對菌體細胞生長量有很大的抑制作用，對葡萄糖利用率也有 影響，見表2,圖3。綜合考慮發酵時間以及乙醛添加量、產物量，可見，乙醛調控枯草芽孢桿 菌(B.subtilis BS2)發酵產物，最佳添加量為1.0 g/L，發酵192h可以得到27.64 g/L TTMP 的產量。總體上，添加乙醛調控3-羥基丁酮和TTMP的產量影響有一致性，針對枯草芽孢桿菌 (B.subtilis BS2)的發酵生產是有效可行的。
[0027]表2乙醛調控對B.lincheniformis BL1 和B.subtilis BS2產物3-羥基丁酮和TTMP 的影響
3從接種到3-羥基丁酮產量達到最高時的發酵時間。
[0028] b從接種到TTMP產量達到最高時的發酵時間。
[0029]數據是三組實驗的平均值和標準偏差。
[0030]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非以限定本發明，對本領域的技術 人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做 出其它各種相應的改變和修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。 [0031 ] 在研究中發現，發酵初期定量添加乙醛能夠將地衣芽孢桿菌(B. lincheniformis BL1)TTMP的產量提高13.8 %，達到43.13 g/L;能夠將枯草芽孢桿菌(B.subtilis BS2)的 TTMP產量提高26.6 %，達到27.64 g/L，同時也能提高兩種芽孢桿菌3-羥基丁酮的產量。研 究人員推測發酵初期添加乙醛可能對催化3-羥基丁酮生成乙醛的3-羥基丁酮脫氫酶系活 性具有抑制作用，阻遏自身乙醛的合成，從而減少消耗3_羥基丁酮形成乙醛的程度，同時能 夠增強乙醛向乙酰輔酶A的代謝生成，間接反饋抑制丙酮酸向乙酰輔酶A的代謝支路，增強 丙酮酸向3-羥基丁酮的代謝支路，增大TTMP的前體物質3-羥基丁酮的積累量，從而提高 TTMP的產量，兩種芽孢桿菌的共通代謝途徑如圖1所示。
【主權項】
1. 一種提高芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率的方法，以芽孢桿菌為出發菌株的搖瓶發酵 培養，其特征是在發酵初期向發酵培養基中加入乙醛至1.0 g/L，且在發酵過程中從第72h 開始，通過流加 10m〇l/L NaOH控制發酵體pH處于弱堿條件下，發酵溫度為37 °C，繼續發酵 至TTMP達到峰值。2. 如權利要求1所述的提高芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率的方法，其特征是:所述制作 種子液和發酵過程pH為7.5。3. 如權利要求1所述的提高芽孢桿菌發酵四甲基吡嗪產率的方法，其特征是:所述芽孢 桿菌為地衣芽孢桿菌(B. lincheniformis BL1)或枯草芽孢桿菌(B. subtilis BS2)任一株。
【文檔編號】C12P17/12GK105838751SQ201610151073
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月17日
【發明人】孟武, 王瑞明, 王松江, 王騰飛, 王婷
【申請人】齊魯工業大學, 諸城東曉生物科技有限公司