一種新型高活力蒜氨酸酶及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種新型高活力蒜氨酸酶及其制備方法，其技術方案是利用隨機突變技術改造來源于大蒜鱗莖的野生型蒜氨酸酶基因，得到高活力的蒜氨酸酶突變體基因，即新型高活力蒜氨酸酶基因，然后將新型高活力蒜氨酸酶基因分別在枯草芽孢桿菌表達系統、畢赤酵母表達系統(包括畢赤酵母游離表達系統和畢赤酵母細胞表面展示系統)中表達，得到產高活力蒜氨酸酶的重組菌株，發酵表達后，檢測高活力蒜氨酸酶的比酶活較野生型蒜氨酸酶提高50％。
【專利說明】
一種新型高活力蒜氨酸酶及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物工程領域，涉及通過易錯PCR技術體外定向進化構建的比酶活提 高的新型蒜氨酸酶突變體，具體地說涉及到基因的隨機突變和重組DNA技術，尤其是一種新 型高活力蒜氨酸酶及其制備方法。 技術背景
[0002] 蒜氨酸酶又稱烷基半胱氨酸亞砜酶、C-S酶等(E. C. 4.4.1.4)，1949年由Sto 11和 Seeback首先發現。它有二聚體、三聚體、四聚體等形式。不同的植物蛋白聚合形式是不同 的，如大蒜(Aliiium sativum)的蒜氨酸酶為二聚體，而洋蔥(Aliiium cepa)的則為四聚 體。
[0003] 國外學者已經從洋蔥、韭菜、熊蔥及大蒜中得到編碼蒜氨酸酶的基因，但所報道的 基因序列、蛋白分子質量及生化性質有諸多分歧。Rabinkov等克隆的大#示鱗莖#示氣酸酶基 因長達2200bp，為翻譯后剪切前未成熟酶(precursor alliinase)的全長基因序列。該蒜氨 酸酶只存在于大蒜鱗莖及葉中，而不存在于大蒜根中，但其根中具有很高的酶活性，由此推 斷大蒜根部含有蒜氨酸酶的同工酶。2000年，Lancaster等從洋蔥根中純化了一種新型蒜氨 酸酶，得到了編碼洋蔥根蒜氨酸酶蛋白的cDNA，闡述了其結構與功能。
[0004] 1998年，Weik等研究了蒜氨酸酶在大腸桿菌、釀酒酵母及畢赤酵母中重組表達，獲 得了重組蒜氨酸酶。2010年，來慶勤等克隆得到蒜氨酸酶基因，并在大腸桿菌中進行了表 達，獲得了重組蛋白包涵體，經蛋白復性，重組蒜氨酸酶比活力高于Weik的報道。但與經植 物化學方法直接從大蒜中提取的樣品相比尚不理想。2010年，吳曉莉等根據GenBank登錄的 蒜氨酸酶序列設計引物，通過RT-PCR技術在國內首次克隆登錄了我國浙江大蒜鱗莖蒜氨酸 酶基因。浙江蒜氨酸酶比GenBank登錄的大蒜蒜氨酸酶序列多了3個堿基，有9個位點發生突 變。并將目的基因成功構建到pPICZaC畢赤酵母表達載體上。重組蒜氨酸酶具有酶活性，酶 比活力為(82.09 ± 3.89)U/mg，低于提取的天然蒜氨酸酶。
[0005] 大蒜在醫藥和保健方面的作用已得到普遍的認可，因而蒜氨酸酶的作用就顯得尤 為重要。目前國內外生產的大蒜片劑和膠囊達到30種以上，從大蒜中分別提取蒜氨酸和蒜 氨酸酶，利用蒜氨酸和蒜氨酸酶生產復合膠囊或注射針劑。因此，開展DNA分子重組技術構 建蒜氨酸酶表達系統生產蒜氨酸酶，以及利用隨機突變提高酶活性和穩定性這些方面的研 究，就成為提高蒜類藥品藥效的行之有效的途徑，并將為蒜類藥品和保健品的開發與應用 提供更廣闊的空間。
[0006] 酶分子體外定向進化屬于蛋白質的非理性設計，是蛋白質工程的新策略。利用分 子生物學手段在分子水平創造出分子的多樣性，結合靈敏的篩選技術，迅速得到理想的突 變體。它不需事先了解蛋白質的空間結構、活性位點、催化機制等因素，而是人為地創造特 殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外改造酶基因，獲得具有某些預期特征的結構酶。 其中，易錯PCR是指在擴增目的基因的同時，利用Taq酶不具備3'-5'校對功能，同時改變反 應體系中Mn2+、Mg2+和各種dNTP的濃度，以一定的頻率向目的基因隨機引入堿基錯配，導致 目的基因發生隨機突變。然而，經一次突變的基因一般很難獲得滿意的結果，由此又發展出 連續易錯PCR(Sequential Error-prone PCR)策略。即將一次PCR擴增得到的產物作為下一 次PCR擴增的模板，連續反復地進行易錯，使每一次獲得的小突變不斷進行積累而產生重要 的有益突變。因此，具有獨有的優勢。
[0007] 枯草芽孢桿屬于革蘭氏陽性菌。枯草芽孢桿菌表達系統有以下優點：1、能夠高效 地分泌各種蛋白質；2、許多枯草芽孢桿菌在發酵工業上的使用已有相當長的歷史，無致病 性，不產生任何內毒素；3、芽孢桿菌屬微生物遺傳學背景研究的十分清楚，并具有生長迅 速，對營養無特殊要求的優點;4密碼子偏愛性不明顯;5發酵簡單，枯草芽孢桿菌是好氧菌， 無需厭氧發酵設備，對培養基無特殊要求，發酵結束后，簡單地分離發酵液和細菌菌體，即 可進入目的蛋白的純化回收階段;6具有抗逆性，可生產多種耐熱性酶制劑。
[0008] 畢赤酵母是一種單細胞低等真核生物，培養條件普通，生長繁殖速度迅速。畢赤酵 母表達系統用于表達基因工程產品時，可以大規模生產，有效降低了生產成本。畢赤酵母表 達系統具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質具有一定程度上的折疊加工和糖基 化修飾，性質較原核表達系統表達的蛋白質更加穩定，畢赤酵母表達系統具有兩種表達形 式，包括畢赤酵母游離表達系統和畢赤酵母細胞表面展示系統。畢赤酵母游離表達系統表 達的外源基因具有一定的翻譯后加工能力，收獲的外源蛋白質具有一定程度上的折疊加工 和糖基化修飾，性質較原核表達系統表達的蛋白質更加穩定，某些酵母表達系統具有外分 泌信號序列，能夠將所表達的外源蛋白質分泌到細胞外，易于純化，而畢赤酵母細胞表面展 示系統除具有外源基因的翻譯后加工能力和蛋白的折疊加工及適度糖基化的優點外，經該 系統得到的全細胞催化劑還可以重復利用從而降低生產成本。畢赤酵母表達系統已成為現 代分子生物學研究最重要的工具和模型，是表達外源基因比較理想的工具。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種新型高活力蒜氨酸酶突變 體基因，本發明使用易錯PCR技術，對野生型蒜氨酸酶進行隨機突變，得到新型高活力蒜氨 酸酶(Glu225Val、Glu267Phe)，新型高活力蒜氨酸酶的比酶活比野生型蒜氨酸酶的比酶活 提尚了50%。
[0010] 本發明的目的是采用以下技術方案完成的：
[0011] 一種新型高活力蒜氨酸酶突變體基因，其基因序列為SEQ ID N0:5。
[0012] -種新型高活力蒜氨酸酶突變體基因的構建方法，將大蒜鱗莖野生型蒜氨酸酶基 因進彳丁隨機突變，第674位喊基A-T，第799位喊基G-T，第800位喊基A-T，第801位喊基A- C，得到新型高活力蒜氨酸酶突變體基因；所述大蒜鱗莖野生型蒜氨酸酶基因序列為SEQ ID N0:3〇
[0013] -種新型高活力蒜氨酸酶突變體，通過如序列3所示的核苷酸序列編碼的野生型 蒜氨酸酶氨基酸序列中，第225位的氨基酸Glu替換為Val和第267位的氨基酸Glu替換為 Phe，得到如序列6所示的氨基酸序列。
[0014] -種新型高活力蒜氨酸酶突變體的制備方法，包括如下步驟：
[0015] ⑴通過易錯PCR隨機突變大蒜鱗莖的野生型蒜氨酸酶基因，第674位堿基A-T，第 799位堿基G-T，第800位堿基A-T，第801位堿基A-C，得到新型高活力蒜氨酸酶突變體編 碼基因；
[0016] ⑵將所述的新型高活力蒜氨酸酶突變體編碼基因酶切、連接到表達或展示載體， 得到攜帶高活力蒜氨酸酶突變體編碼基因重組載體；
[0017] ⑶將重組載體轉化至宿主細胞，得到重組菌株；
[0018] ⑷表達所述的重組菌株，純化獲得如SEQ ID N0:6所示的新型高活力蒜氨酸酶。
[0019] -種含有上述基因的表達載體以及宿主細胞。
[0020] 而且，所述的表達載體為PBSA43、所述的宿主細胞為枯草芽孢桿菌WB600。
[0021]而且，所述的表達載體為PPIC9K、所述的宿主細胞為畢赤酵母GS115。
[0022] 而且，所述的展示載體為pPIC9K-Flo、所述的宿主細胞為畢赤酵母GS115。
[0023]本發明的獨特之處有如下幾點：
[0024] 1、本發明中新型高活力蒜氨酸酶基因在枯草芽孢桿菌表達系統和畢赤酵母表達 系統中進行了表達，分別得到枯草芽孢桿菌新型高活力蒜氨酸酶重組菌株和畢赤酵母新型 高活力蒜氨酸酶重組菌株(包括畢赤酵母新型高活力蒜氨酸酶游離表達重組菌株和畢赤酵 母細胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶重組菌株）。重組菌株發酵后，經過相應的處理可得新 型高活力蒜氨酸酶催化劑。
[0025] 2、本發明使用易錯PCR技術，對野生型蒜氨酸酶進行隨機突變，得到新型高活力蒜 氨酸酶(Glu225Val、Glu267Phe)，新型高活力蒜氨酸酶的比酶活比野生型蒜氨酸酶的比酶 活提尚了 50 %。
[0026] 3、本發明中枯草芽孢桿菌新型高活力蒜氨酸酶重組菌發酵后蒜氨酸酶的比酶活 可達到（105.34± 1.73)U/mg，畢赤酵母游離表達新型高活力蒜氨酸酶重組菌的比酶活可達 (173.72±2.89)U/mg，畢赤酵母細胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶全細胞催化劑的比酶活 可達（196.47±4.93)U/(g ·干細胞）。
[0027] 4、本發明采用酵母表面展示系統，將蒜氨酸酶展示于酵母表面，酵母細胞既作為 酶的生產者，又可以充當固定化酶中的載體，免去了酶的純化和固定等操作，簡化了生產環 節，降低了生產成本。
【附圖說明】
[0028]圖1為本發明蒜氨酸酶成熟肽基因的PCR擴增電泳圖，其中:M為DNA Marker，l為蒜 氨酸酶成熟肽基因；
[0029] 圖2為本發明重組質粒pBSA43-alliinasem酶切驗證圖，其中：M為DNA Marker，l為 pBSA43_al 1 i inasem 經 BamHI 和 Hindll I 雙酶切；
[0030] 圖3為本發明重組質粒pPIC9K-alliinasem酶切驗證圖，其中：M為DNA Marker，l為 pPIC9K_al 1 i inasem 經 EcoRI 和 Not I 雙酶切；
[0031] 圖4為本發明重組質粒pPIC9K-Fl〇-alliinasem酶切驗證圖，其中：M為DNA Marker，1 為pPIC9K_Fl〇-al 1 i inasem 經 SnaBI 和EcoRI雙酶切；
[0032] 圖5為丙酮酸標準曲線；
[0033] 圖6為以FeS〇4為標準物質繪制標準曲線；
【具體實施方式】
[0034] 下面結合實施例對本發明的技術內容做進一步說明，但本發明不只限于這些實施 例，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。
[0035] 本發明實現的目的技術路線如下
[0036]取新鮮大蒜鱗莖于液氮中研碎，按照Trizol試劑說明書進行總RNA的提取并進行 RT-PCR。以合成的cDNA第一鏈為模板，設計引物，擴增野生型蒜氨酸酶基因序列（如SEQ ID N0:3所示）。將其與pET28a載體連接后通過易錯PCR進行隨機突變，獲得新型高活力蒜氨酸 酶基因（如SEQ ID N0:5所示），構建重組載體并在枯草芽孢桿菌WB600及畢赤酵母GS115中 成功表達，得到產新型高活力蒜氨酸酶的重組菌株，進一步通過發酵提取工藝獲得高活力 的新型蒜氨酸酶。
[0037]在本發明中采用如下定義：
[0038] 1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法
[0039]使用氨基酸殘基的公認IUPAC命名法，用三字母代碼形式。DNA核酸序列采用公認 IUPAC命名法。
[0040] 2、新型蒜氨酸酶突變體的標識
[0041] 采用"原始氨基酸位置替換的氨基酸"來表示新型蒜氨酸酶突變體中突變的氨基 酸。如Glu225Val，表示位置225的氨基酸由親本蒜氨酸酶的Glu替換成Val，位置的編號對應 于SEQ ID N0:4中蒜氨酸酶的氨基酸序列編號。
[0042] 在本發明中，aliiinase表示野生型蒜氨酸酶的原始氨基酸序列（如SEQ ID N0:4 所示），alliinasem表示新型蒜氨酸酶的突變氨基酸序列（如SEQ ID N0:6所示）。
[0043]
[0044] 用于表達所述的新型蒜氨酸酶突變體的宿主細胞為枯草芽孢桿菌WB600,表達載 體為 PBSA43;
[0045] 用于表達所述的新型蒜氨酸酶突變體的宿主細胞為畢赤酵母GS115,表達載體為 PPIC9K；
[0046] 用于表達所述的新型蒜氨酸酶突變體的宿主細胞為畢赤酵母GS115,展示載體為 pPIC9K-Flo；
[0047] 實施例1
[0048] 野生型蒜氨酸酶成熟肽基因的獲得
[0049] 1、取新鮮大蒜鱗莖于液氮中研碎，按照Trizol試劑說明書進行總RNA的提取并進 行RT-PCR。
[0050] 2、以合成的cDNA第一鏈為模板，根據Genbank序列號S73324.1登錄的蒜氨酸酶序 列，在其0RF框上下游設計一對引物，分別引入限制性酶切位點BamH I、Hindm。設計本發明 的蒜氨酸酶成熟肽基因的擴增引物如下：
[0051 ]上游引物PI (SEQ ID N0 · 1): 5 ' -CGCGGATCCATGATCTGCCTAGTGATTTTGACATG-3 '
[0054]
[0052] 下游引物P2(SEQ ID NO· 2):5，-CCCAAGCTTTTAAATGAAAGGACGACGGGAG-3，[0053] 其擴增的反應條件為：
[0055]
[0056] 擴增條件為：95°C預變性5min;95°C變性3〇8,60°(：退火4〇8,72°(：延伸11^113〇8反應 30個循環;72°C延伸lOmin。PCR擴增產物經0.8 %瓊脂糖凝膠電泳，得到1422bp的條帶（圖 1)，用小量DNA回收試劑盒回收PCR產物，得到本發明的野生型蒜氨酸酶成熟肽基因 alliinase，測序后見序列3。
[0057] 實施例2
[0058]新型高活力蒜氨酸酶基因的獲得。
[0059] 1、將重組質粒化轉入大腸桿菌DH5a中，經BamH I、Hindm雙酶切驗證，野生型蒜氨 酸酶基因已成功克隆到pET28a載體上。
[0060] 2、隨機突變
[0061] (1)基于易錯PCR技術進行隨機突變，構建新型高活力蒜氨酸酶，設計引物如下：
[0062] 上游引物PI (SEQ ID N0 · 1): 5 ' -CGCGGATCCATGATCTGCCTAGTGATTTTGACATG-3 '
[0063] 下游引物P2(SEQ ID NO· 2):5，-CCCAAGCTTTTAAATGAAAGGACGACGGGAG-3，
[0064] 在易錯PCR反應體系中，以P1和P2作為上下游引物，以野生型蒜氨酸酶成熟肽基因 為模板，進行易錯PCR。
[0065]其擴增的反應條件為：
[0066]
[0067]
[0068] 擴增條件為：95°C預變性5min;95°C變性3〇8,60°(：退火4〇8,72°(：延伸11^113〇8反應 30個循環；72°C延伸lOmin。
[0069] (2)將新型高活力蒜氨酸酶突變體基因（alliinasem)克隆入表達載體pET28a中， 轉化大腸桿菌BL21(DE3)，接種于每孔含200yL LB液體培養基(含30yg/mL的Kan)的96孔細 胞培養板中，于37°C條件下200r/min搖床培養，當OD600達到0.6，向每個孔中加入IPTG(終濃 度lmmol/L)，在16°C下誘導16h，將培養物分別進行以下3種處理方式：（1)反復凍融3次(-80 °C，15min;37°C，15min;0°C，15min); (2)加入溶菌酶（200μg/ml，30min); (3)熱處理（100°C 沸水浴，20min)，然后在4000r/min下離心10min來去除沉淀，將上清轉移到另一塊96孔板中 檢測其酶活力。
[0070] (3)酶活力檢測 [0071]①酶活力定義
[0072]蒜氨酸酶每催化1分子蒜氨酸發生反應會產生2分子丙酮酸，因此可通過測定丙酮 酸的濃度來推算酶活。因此本發明酶活的定義為:在35°C條件下，蒜氨酸酶催化蒜氨酸的反 應，每分鐘產生Uig丙酮酸定義為1個活力單位(U)。
[0073]②丙酮酸濃度與光吸收值標準曲線的繪制
[0074]丙酮酸能夠與2，4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2，4-二硝基苯腙，后者在堿性溶 液中呈櫻紅色，在波長520nm處測定吸光值。配置不同濃度的丙酮酸溶液，各取lmL，加入lmL 0.1 % 2，4-二硝基苯肼充分搖勻，再加入2mLl. 5mol/LNa0H搖勻，靜置lOmin顯色，用752紫外 分光光度計在520nm處測定吸光值。繪制丙酮酸濃度與光吸收值的標準曲線。
[0075] 丙酮酸標準曲線如圖5所示，求得回歸方程為Y = 0.0244X+0.0167,相關系數為R2 =0.9990ο
[0076]③新型蒜氨酸酶酶活的測定方法及步驟
[0077]以丙酮酸法測定酶活性。配制3mmol/L的蒜氨酸底物。收集發酵產物，加入l.OmL底 物，30°C下反應5min，加入1.5mL10 %三氯乙酸終止反應。再加入0.5mL0.1 % 2，4-二硝基苯 胼，充分混勻，加入7mL0.5mol/LNaOH溶液搖勻顯色，520nm波長測定吸光值。根據吸收值算 出丙酮酸總濃度及酶活力。用Folin-酚法測定溶液中蒜氨酸酶蛋白質量。求出所測樣品中 蒜氨酸酶的比活力。
[0078]④新型蒜氨酸酶酶活的測定
[0079] 測定原始蒜氨酸酶和突變后新型高活力蒜氨酸酶的比酶活，突變后蒜氨酸酶的比 酶活比突變前提高了 50 %。
[0080] 比酶活定義:單位重量的蛋白質中所具有酶的活力單位數，一般用U/mg蛋白質來 表不。
[0081] (4)序列測定
[0082] 測序(北京華大生物工程公司）結果表明，此時擴增得到Glu225Val、Glu267Phe的 新型高活力蒜氨酸酶基因 alii inasem，見序列5。
[0083] 實施例3
[0084]枯草芽孢桿菌新型高活力蒜氨酸酶重組菌的構建 [0085] 1、表達載體pBSA43的構建
[0086] pBSA43是以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭克隆載體pBE2為骨架，克隆入一個強的 芽孢桿菌組成型啟動子P43,以及能夠使重組蛋白直接分泌到培養基中果聚糖蔗糖酶信號 序列sacB而獲得。它帶有Amp1基因，可以在大腸桿菌中利用氨芐青霉素抗性作為篩選標記； 同時也具有KF基因，可以在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌中利用卡那霉素抗性作為篩選標 記。
[0087] 2、新型高活力蒜氨酸酶表達載體pBSA43-alliinasem的構建
[0088] 將經易錯PCR構建獲得的新型高活力蒜氨酸酶基因經BamHI和Hindlll雙酶切后與 同樣雙酶切的枯草芽孢桿菌表達載體PBSA43連接，構建重組質粒pBSA43-alliinasem。將 pBSA43-al 1 i inasem轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，挑選陽性轉化子，提取質粒進行酶切驗 證并測序，確定構建獲得重組菌株JM109/pBSA43-al 1 i inasem。
[0089] 3、表達載體pBSA43_al 1 i inasem轉化枯草芽抱桿菌WB600
[0090] 在60yL感受態細胞中加入lyL(50ngAiL)pBSA43-alliinasem混勻并轉移到冰冷的 電轉化杯（1mm)中，冰浴1-1 · 5min后，電擊一次(25yF，200 Ω，4 · 5-5 · 0ms)。電擊完畢之后，立 即加入lmL復蘇培養基(LB+0.5mo 1/L山梨醇+0.38mo 1/L甘露醇）。37°C搖床震蕩培養3h之 后，將復蘇物涂布在LB平板上，37 °C培養24-36h，挑取陽性轉化子，獲得枯草芽孢桿菌重組 菌株 WB600/pBSA43_al 1 i inasem。
[0091] 實施例4
[0092] 畢赤酵母新型高活力蒜氨酸酶游離表達重組菌的構建
[0093] 1、新型高活力蒜氨酸酶表達載體pPIC9K-alliinaSem的構建
[0094] 將經易錯PCR構建獲得的新型高活力蒜氨酸酶基因經EcoRI和Notl雙酶切后與同 樣雙酶切的畢赤酵母表達載體PPIC9K用連接酶進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌JM109 (DH5c〇感受態細胞中，經Amp抗性篩選，挑選陽性轉化子;提取陽性轉化子質粒，經37°C搖管 培養后抽提質粒，并進行單、雙酶切初步驗證，并將酶切驗證正確的重組質粒命名為 pPIC9K-alliinaSem;將酶切驗證正確的陽性克隆送至北京華大基因科技股份有限公司測 序，以進一步確保目的基因的正確性，最終確定構建獲得正確的重組菌株JM109/pPIC9K- alliinasem〇
[0095] 2、新型高活力蒜氨酸酶重組菌株的構建及新型高活力蒜氨酸酶高表達菌株的篩 選
[0096] (1)線性化重組表達質粒pPIC9K_alliinasem的制備
[0097] 重組質粒在電轉化畢赤酵母GS115前，要先將構建好的重組表達質粒pPIC9K- alliinasem進行線性化以提高重組質粒在畢赤酵母染色體上的整合效率。每次轉化需要線 性化質粒DNA 5-20yg，且質粒越純，轉化效率越高。可以分別用SacI和SalI這2種限制性內 切酶進行線性化酶切。酶切完之后，用小量DNA回收試劑盒回收線性化酶切產物。
[0098] (2)線性化質粒口？1091(-311;[;[1^861]1電轉化畢赤酵母63115、陽性轉化子的鑒定及 新型高活力蒜氨酸酶高產菌株的篩選
[0099] ①將80yL感受態細胞和5-20yg經線性化的DNA加入到1.5mL預冷的離心管中，混 勻，將反應液轉移到預先冰浴的轉化杯中；
[0100]②冰浴裝有轉化液的轉化杯5min，根據電轉裝置推薦的參數，進行畢赤酵母電轉 化：
[0101 ]③脈沖后，立即向轉化杯中加入lmL預冷的lmol/L的山梨醇溶液，把轉化液轉移到 一個新的1.5mL離心管中；
[0102] ④30°C靜置培養1-2h，吸取畢赤酵母GS115電轉液200yL涂布在MD培養基上；
[0103] ⑤30°C培養直至轉化子出現；
[0104]⑥挑取轉化子單菌落溶解在10yL去離子水中，取2yL菌液，加入Lyticase破壁酶， 30 °C反應lOmin，反應液立即放入-80 °C冰箱中冷凍lOmin，使酵母細胞壁裂解，釋放的基因 組作為模板進行PCR。以轉入空質粒pPIC9K的畢赤酵母GS115/pPIC9K作為對照，確定陽性轉 化子。
[0105] ⑦在確定陽性轉化子的基礎上，先用含不同濃度遺傳霉素的抗性平板篩選高遺傳 霉素抗性的轉化子，然后分別測定這些高遺傳霉素抗性的轉化子的新型蒜氨酸酶的酶活， 以得到新型高活力蒜氨酸酶的高產菌株GS115/pPIC9K-alliinaSem。
[0106] 實施例5
[0107] 畢赤酵母細胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶重組菌的構建
[0108] 1、重組質粒 pPIC9K_Fl〇-alliinasem 的構建
[0109] 將易錯PCR純化產物與載體pPIC9K-Flo經SnaBI和EcoRI雙酶切后，將新型高活力 蒜氨酸酶基因連接至載體pPIC9K-Flo中，將連接產物轉化到大腸桿菌DH5a感受態中，在含 有Amp的LB固體培養基中篩選培養，挑取陽性轉化子，培養后提質粒，雙酶切鑒定并測序，命 名為 pPIC9K-Flo_alliinasem〇[0110] 2、畢赤酵母重組菌的構建
[0111]將測序正確的重組質粒經Sal I線性化后，用電轉化法轉化畢赤酵母GS115，MD平板 篩選重組子，獲得畢赤酵母細胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶重組菌GS115/pPIC9K-Fl〇- alliinasem〇
[0112] 實施例6
[0113] 新型高活力蒜氨酸酶在枯草芽孢桿菌重組菌中的表達及制備
[0114] 將枯草芽孢桿菌重組菌株WB600/pBSA43-al 1 i inasem接種于LB液體培養基(含卡 納霉素，30yg/mL)中，37°C，200r/min培養過夜，按1 %接種量轉接于50mL新鮮培養基中， 200r/min培養48h，可制備獲得新型高活力蒜氨酸酶粗酶液，然后采用分級鹽析法沉淀新型 高活力蒜氨酸酶，收集蛋白質沉淀，溶解后，透析除鹽，再經離子交換層析、凝膠層析后，冷 凍干燥制得新型高活力蒜氨酸酶純酶酶粉。
[0115] 實施例7
[0116] 新型高活力蒜氨酸酶在畢赤酵母游離表達重組菌中的表達及制備
[0117] 將培養于YH)固體平板上的畢赤酵母游離表達新型高活力蒜氨酸酶重組菌接種至 YH)液體培養基中，30 °C、250r/min培養24h。以1 %的接種量轉接到新鮮BMGY培養基中，30°C 培養24h，然后6000r/min離心5min得到菌體，轉入BMMY培養基中。30°C、250r/min，每隔24h 補甲醇，使其終濃度保持在〇.5%V/V，培養120h后可得到新型蒜氨酸酶突變體的粗酶液，然 后采用分級鹽析法沉淀新型高活力蒜氨酸酶，收集蛋白質沉淀，溶解后，透析除鹽，再經離 子交換層析、凝膠層析后，冷凍干燥制得新型高活力蒜氨酸酶純酶酶粉。
[0118] 實施例8
[0119] 畢赤酵母細胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶全細胞催化劑的制備
[0120] 將培養于YH)固體平板上的畢赤酵母細胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶重組菌接 種至Yro液體培養基中，30°C、250r/min培養24h，以1 %的接種量轉接到新鮮BMGY培養基中， 30 °C培養24h，然后6000r/min離心5min得到菌體，轉入BMMY培養基中，30 °C、250r/min培養 120h，每隔24h補甲醇，使其終濃度保持在0.5%V/V，然后離心收集取菌體，用雙蒸水洗1-2 次，加入保護劑，通過真空冷凍干燥制得畢赤酵母細胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶全細 胞催化劑。
[0121] 實施例9
[0122] 重組菌酶活力測定
[0123] 將得到的三株重組菌發酵后測定酶活，其中枯草芽孢桿菌新型高活力蒜氨酸酶重 組菌發酵后發酵液中新型蒜氨酸酶的比酶活可達到（l〇5.34±1.73)U/mg，畢赤酵母游離表 達新型高活力蒜氨酸酶重組菌發酵后發酵液中的比酶活可達（173.72±2.89)U/mg，畢赤酵 母細胞表面展示新型高活力蒜氨酸酶全細胞催化劑的比酶活可達（196.47±4.93)U/(g · 干細胞）。而枯草芽孢桿菌野生型蒜氨酸酶重組菌發酵后發酵液中蒜氨酸酶的比酶活可達 到（70.23±2.13)U/mg，畢赤酵母游離表達野生型蒜氨酸酶重組菌發酵后發酵液中的比酶 活可達（115.82 ± 2.46)U/mg，畢赤酵母細胞表面展示野生型蒜氨酸酶全細胞催化劑的比酶 活可達（130.98±3.93)U/(g ·干細胞）。
[0124] 實施例10
[0125] 新型蒜氨酸酶抗氧化活性測定
[0126] 1、DPPH·自由基清除能力的測定
[0127] 參照Brand-WilliamsW.的方法。以下操作分別在無氧條件和有氧條件下進行：用 超純水混合蒜氨酸及重組蒜氨酸酶粗酶液，制成蒜氨酸/蒜氨酸酶混合物溶液(終濃度為 10mm〇l/Lal 1 iin，蒜氨酸酶粗酶液總蛋白含量為0.275mg/mL)，于37°C水浴中酶催化反應不 同時間，取1 mL樣品及4mL濃度為0.12mmol/L的DPPH乙醇溶液(體積分數為95% )，混勻，室 溫下避光反應3〇111；[11，如有沉淀在55001'/1]1；[11條件下離心51]1；[11。用體積分數為95%乙醇溶液 作參比，于517nm測定吸光值。根據下式計算每個樣品液對DPPH ·自由基的清除率：
[0128] 清除率/% = [l-(Ai_Aj)/Ac]X100%
[0129] 式中:Ai :為加樣品液后DPPH溶液的吸光值；
[0130] Aj:為樣品液的吸光值；
[0131] Ac:為未加樣品液時DPPH溶液的吸光值。
[0132 ] 2、總抗氧化能力的測定(FRAP值測定）
[0133] 取各供試品溶液，適當稀釋后移液器取10ΟμL，加入FRAP工作液3mL，混勻反應 20min，于593nm處讀取吸光度。以FeS04為標準物質繪制標準曲線（如圖6所示），求得回歸方 程為：
[0134] y = 0 · 3584x-0 · 0043，相關系數 R2 = 0 · 9986
[0135] 樣品的總抗氧化能力以FRAP值表示：1FRAP單位相當于lmmol/L FeS〇4,即樣品的 總抗氧化能力相當于FeS〇4的mmol/L數。
【主權項】
1. 一種新型高活力蒜氨酸酶突變體基因，其特征在于:其基因序列為SEQ ID N0:5。2. -種如權利要求1所述的新型高活力蒜氨酸酶突變體基因的構建方法，其特征在于： 將大蒜鱗莖野生型蒜氨酸酶基因進行隨機突變，第674位堿基A-T，第799位堿基G-T，第 800位堿基A-T，第801位堿基A-C，得到新型高活力蒜氨酸酶突變體基因；所述大蒜鱗莖野 生型蒜氨酸酶基因序列為SEQ ID NO:3。3. -種新型高活力蒜氨酸酶突變體，其特征在于:通過如序列3所示的核苷酸序列編碼 的野生型蒜氨酸酶氨基酸序列中，第225位的氨基酸Glu替換為Val和第267位的氨基酸Glu 替換為Phe，得到如序列6所示的氨基酸序列。4. 一種如權利要求3所述的新型高活力蒜氨酸酶突變體的制備方法，其特征在于:包括 如下步驟： ⑴通過易錯PCR隨機突變大蒜鱗莖的野生型蒜氨酸酶基因，第674位堿基A-T，第799位 堿基G-T，第800位堿基A-T，第801位堿基A-C，得到新型高活力蒜氨酸酶突變體編碼基 因； ⑵將所述的新型高活力蒜氨酸酶突變體編碼基因酶切、連接到表達或展示載體，得到 攜帶高活力蒜氨酸酶突變體編碼基因重組載體； (3)將重組載體轉化至宿主細胞，得到重組菌株； ⑷表達所述的重組菌株，純化獲得如SEQ ID NO:6所示的新型高活力蒜氨酸酶。5. -種包含權利要求1所述的基因的表達載體以及宿主細胞。6. 根據權利要求5所述的新型高活力蒜氨酸酶基因的表達載體以及宿主細胞，其特征 在于:所述的表達載體為PBSA43、所述的宿主細胞為枯草芽孢桿菌WB600。7. 根據權利要求5所述的新型高活力蒜氨酸酶基因的表達載體以及宿主細胞，其特征 在于:所述的表達載體為PPIC9K、所述的宿主細胞為畢赤酵母GS115。8. 根據權利要求5所述的新型高活力蒜氨酸酶基因的表達載體以及宿主細胞，其特征 在于:所述的展示載體為pPIC9K-Flo、所述的宿主細胞為畢赤酵母GS115。
【文檔編號】C12N15/81GK105838729SQ201610330256
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月18日
【發明人】路福平, 劉逸寒, 郭偉, 韓楊, 賈雷博
【申請人】天津科技大學