用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法

用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法，所述分離的多核苷酸序列包括：(a)SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸序列；或(b)在嚴格條件下與(a)限定的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列；或(c)與(a)限定的多核苷酸序列具有80％以上同一性的多核苷酸序列；或(d)(a)限定的多核苷酸序列的至少19個連續核苷酸的多核苷酸序列，其中鞘翅目昆蟲害蟲攝取包含與所述多核苷酸序列互補的至少一條鏈的雙鏈RNA，抑制所述鞘翅目昆蟲害蟲的生長；或(e)上述(a)、(b)、(c)或(d)限定的多核苷酸序列的互補序列。本發明首次公開了一個用于控制鞘翅目昆蟲害蟲褐足角胸葉甲的靶標序列，高效、特異、方便且成本低。
【專利說明】
用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法，特別是涉及一種利用 RNAi技術降低或關閉褐足角胸葉甲體內靶標序列的表達來控制褐足角胸葉甲的方法。
【背景技術】
[0002] 農田作物通常是昆蟲攻擊的目標。在過去數十年中，關于開發用于作物中昆蟲侵 襲的更為有效的方法和組合物，已有了一些實質性的進展。化學殺蟲劑對于控制有害生物 侵襲是比較有效的手段。但是，使用化學殺蟲劑同時也有很多缺點。首先化學殺蟲劑是非選 擇性的，人們意欲應用化學殺蟲劑來控制對多種作物和其他植物來說有害的昆蟲，但是由 于其缺乏選擇性，化學殺蟲劑對于非目標的生物也會造成傷害，例如蚯蚓等。并且，在化學 殺蟲劑應用過的一段時間，通常會使田野貧瘠。化學殺蟲劑持續存在于環境中，通常很慢被 代謝。這種緩慢代謝，使得作物及環境中存在化學殺蟲劑的殘留，它們會積累于食物鏈中， 特別是高等食肉動物的食物鏈中。這些化學殺蟲劑的積累導致對更高端的物種誘導了疾 病，例如人類的癌癥。因此人們強烈需要對環境友善的方法用于控制或根除作物生產中的 昆蟲侵襲，即選擇性的，環境友好的，生物可降解的，并且能很好地用于有害生物抗性管理 體系的方法。
[0003] 在過去的幾十年中，開發用于控制植物蟲害的有效方法已取得了實質性的進展。 化學殺蟲劑雖然對于根除植物害蟲非常有效，但是其對于非靶標昆蟲也會施加作用，同時 化學殺蟲劑持續存在于環境中，不僅對環境造成不可逆的污染，還會導致抗藥性昆蟲的出 現。微生物殺蟲劑，特別是從蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)菌株所獲 得的殺蟲劑，作為化學殺蟲劑的替代品，在農業生產中發揮了重要作用，其對包括鱗翅目、 雙翅目和鞘翅目等昆蟲具有一定的殺蟲活性，但是微生物殺蟲劑對于施藥環境的要求比較 高，如果環境不適合這些微生物的生長，在生產上則需要重復施用，有些甚至重復施用也不 能達到控制害蟲的目的，大大增加了生產成本。通過基因工程將編碼Bt殺蟲蛋白的一種或 多種基因轉入植物中，可獲得一些害蟲抗性增強的轉基因植物，例如經基因工程產生Cry毒 素的玉米和棉花植物已經廣泛應用于美國的農業生產中，并且為農民提供了傳統害蟲控制 方法的可選方案。但是目前開發的含有Cry毒素的轉基因作物只能用于防治范圍相對狹窄 的害蟲，而尚未有能夠防治刺吸式害蟲的產品。而刺吸式害蟲因其繁殖速度快，分布區域 廣，正在成為已開發的轉基因作物中的最主要害蟲。
[0004] 本領域中已報道了反義方法和組合物，它們被相信能通過單鏈RNA分子(理論上， 能在體內與高度互補的正義鏈RNA分子雜交)的合成施加其作用。反義技術難于在很多系統 中使用，這有三個主要原因。首先，轉化細胞中表達的反義序列不穩定。第二，轉化細胞中表 達的反義序列的不穩定性隨之對將該序列運送到遠離轉基因細胞的宿主、細胞類型或生物 系統造成困難。第三，隨著不穩定性和反義序列的運送遇到的困難對于如下企圖來說也制 造困難，所述企圖是:在編碼該反義序列的重組細胞內部提供能有效調節目標正義核苷酸 序列表達水平的劑量。
[0005] RNA干擾或RNAi是用以在細胞或整個生物體環境下以序列特異性方式下調基因表 達的一種方法，其通過特異性革G向選擇和高效mRNA遏制，可以達到定向干涉革E1基因表達的 目的。雖然利用RNAi技術來進行害蟲防治是本領域的已知的，但是將這種技術用作控制昆 蟲侵襲措施的關鍵因素是選擇最適當的靶基因，即功能缺失導致必需生物過程嚴重破壞 和/或生物體死亡的那些基因。因此，本發明將下調害蟲中的特定靶基因作為一種手段來實 現控制昆蟲侵襲，特別是控制植物的昆蟲侵襲。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提供一種用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法，即利用RNAi 技術按下述方式來下調靶標序列的表達:削弱昆蟲存活、生長、繁殖、定殖特定環境和/或侵 襲寄主的能力，以實現控制昆蟲侵襲及由其造成的損害。
[0007] 為實現上述目的，本發明提供了一種分離的多核苷酸序列，包括：
[0008] (a)SEQ ID NO: 1或2所示的多核苷酸序列;或
[0009] (b)在嚴格條件下與(a)限定的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列;或 [0010] (c)與(a)限定的多核苷酸序列具有80%以上同一性的多核苷酸序列;或
[0011] (d)(a)限定的多核苷酸序列的至少17個連續核苷酸的多核苷酸序列，其中鞘翅目 昆蟲害蟲攝取包含與所述多核苷酸序列互補的至少一條鏈的雙鏈RNA，抑制所述鞘翅目昆 蟲害蟲的生長;或
[0012] (e)上述(a)、（b)、（c)或(d)限定的多核苷酸序列的互補序列。
[0013]進一步地，所述多核苷酸序列還包括所述多核苷酸序列的互補序列。
[0014] 更進一步地，所述多核苷酸序列還包括間隔序列。
[0015] 優選地，所述多核苷酸序列為SEQ ID N0:3或4。
[0016] 為實現上述目的，本發明還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調控序列調控 下的所述多核苷酸序列。
[0017] 為實現上述目的，本發明還提供了一種包含所述多核苷酸序列或所述表達盒的重 組載體。
[0018] 為實現上述目的，本發明還提供了一種所述多核苷酸序列用于干擾鞘翅目昆蟲害 蟲靶標序列表達或抑制鞘翅目昆蟲害蟲生長的用途。
[0019] 為實現上述目的，本發明還提供了一種干擾核糖核酸序列，所述干擾核糖核酸序 列在被鞘翅目昆蟲害蟲攝入后起到下調所述鞘翅目昆蟲害蟲中至少一種靶標序列表達的 作用，其中所述干擾核糖核酸序列包含至少一個沉默元件，其中所述沉默元件是包含退火 的互補鏈的一個雙鏈RNA區域，其中一條鏈包含與所述靶標序列內的一個靶標片段至少部 分地互補的一個核苷酸序列或由其組成，所述靶標序列包含所述多核苷酸序列。
[0020] 進一步地，所述沉默元件包含與所述靶標序列內的一個靶標片段互補至少部分地 互補的一個至少19個連續核苷酸的序列或由其組成。
[0021] 可選擇地，所述干擾核糖核酸序列包含至少兩個沉默元件，每一個所述沉默元件 包含與所述靶標序列內的一個靶標片段至少部分地互補的一個核苷酸序列或由其組成。 [0022]進一步地，所述沉默元件各自包含與一個不同的靶標片段互補的一個不同的核苷 酸序列或由其組成。
[0023] 更進一步地，所述不同的靶標片段來源于單一靶標序列或來源于不同的靶標序 列。
[0024] 所述不同的靶標序列來源于相同的鞘翅目昆蟲害蟲或不同的鞘翅目昆蟲害蟲。
[0025] 優選地，所述鞘翅目昆蟲害蟲為褐足角胸葉甲。
[0026] 在上述技術方案的基礎上，所述干擾核糖核酸序列還包括間隔序列。
[0027]具體地，所述干擾核糖核酸序列為SEQ ID N0:3或4。
[0028] 為實現上述目的，本發明還提供了一種控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的組合物，包含 至少一種所述干擾核糖核酸序列和至少一種合適的載體、賦形劑或稀釋劑。
[0029] 進一步地，所述組合物包含一種表達或能夠表達所述干擾核糖核酸序列的宿主細 胞。具體地，所述宿主細胞是細菌細胞。
[0030] 更進一步地，所述組合物是固體、液體或凝膠。具體地，所述組合物是殺蟲噴霧劑。
[0031] 可選擇地，所述組合物還包含至少一種殺蟲劑，所述殺蟲劑為化學殺蟲劑、馬鈴薯 塊莖特異蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌殺蟲蛋白、光桿狀菌殺蟲蛋白、側孢芽 孢桿菌殺蟲蛋白或球形芽孢桿菌殺蟲蛋白。
[0032] 為實現上述目的，本發明還提供了一種所述控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的組合物用 于預防和/或控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的用途。
[0033] 為實現上述目的，本發明還提供了一種控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的方法，包括使 鞘翅目昆蟲害蟲與有效量的至少一種所述干擾核糖核酸序列接觸。
[0034] 為實現上述目的，本發明還提供了一種產生控制鞘翅目昆蟲害蟲的植物的方法， 包括將所述多核苷酸序列或所述表達盒或所述重組載體導入植物。
[0035] 為實現上述目的，本發明還提供了一種用于保護植物免受由鞘翅目昆蟲害蟲引起 的損傷的方法，包括將所述多核苷酸序列或所述表達盒或所述重組載體導入植物，導入后 的植物在被鞘翅目昆蟲害蟲攝食后起到抑制所述鞘翅目昆蟲害蟲的生長的作用。
[0036]在上述技術方案的基礎上，所述植物為玉米、大豆、谷子、高粱或香蕉。所述鞘翅目 昆蟲害蟲為褐足角胸葉甲。
[0037]為實現上述目的，本發明還提供了一種蛋白質，包括：
[0038] (a)具有SEQ ID N0:21所示的氨基酸序列組成的蛋白質;或
[0039] (b)在(a)中的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具 有控制鞘翅目昆蟲害蟲生長活性的由(a)衍生的蛋白質。
[0040] 為實現上述目的，本發明還提供了一種基因，包括：
[0041] (a)編碼所述蛋白質的核苷酸序列;或
[0042] (b)在嚴格條件下與(a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有控制鞘翅目昆蟲害蟲 生長活性的蛋白質的核苷酸序列;或
[0043] (c)如SEQ ID N0:22所示的核苷酸序列。
[0044] 為實現上述目的，本發明還提供了一種表達盒，包含在有效連接的調控序列調控 下的所述控制鞘翅目昆蟲害蟲生長的基因。
[0045] 為實現上述目的，本發明還提供了一種包含所述控制鞘翅目昆蟲害蟲生長的基因 或所述表達盒的DNA構建體。
[0046]為實現上述目的，本發明還提供了 一種包含所述DNA構建體的重組載體。
[0047]本發明包含對鞘翅目昆蟲害蟲中一種或多種靶標序列的表達加以調節或抑制的 方法，所述方法包括:將經穩定的雙鏈RNA(如dsRNA)或其修飾形式(例如，小干擾RNA序列） 的部分或全部引入到無脊椎有害昆蟲體內細胞或細胞外環境中。在昆蟲體內，dsRNA或 siRNA進入到細胞中，對至少一種或多種靶標序列的表達加以抑制，并且這種抑制產生了減 弱昆蟲存活、生長、繁殖以及侵襲寄主的能力。
[0048]本發明提供了一組分離和純化的多核苷酸序列，如SEQ ID NO: 1或2。本發明提供 穩定化的雙鏈RNA分子，用于抑制鞘翅目害蟲中從這些序列和片段表達靶標序列。穩定化的 雙鏈RNA包括至少兩個編碼序列，它們相對于至少一個啟動子是有義和反義方向排列的，其 中包含有義鏈和反義鏈的核苷酸序列通過至少約5-1000個核苷酸的間隔序列連接或相連， 其中有義鏈和反義鏈可以是不同的長度，并且其中所述兩個編碼序列中的至少一個編碼序 列與SEQ ID NO: 1或2所示的任何一個或多個核苷酸序列具有至少80%的序列同一性，至少 90%，至少95%，至少98%，或100%的序列同一性。
[0049] 當表達為dsRNA并且提供給害蟲時，該片段可以定義為導致害蟲死亡、攝食抑制、 受阻或停止。該片段可以例如包含SEQ ID NO: 1或2中任何一個或多個序列或其互補序列的 至少約19,21，23,25,40,60,80，100，125或更多個連續核苷酸，或約19-約100個核苷酸，或 更多。特別有用的是包括約19-300個與害蟲靶標序列同源的核苷酸的dsRNA序列。本發明也 提供了從任何所述多核苷酸序列表達的RNA，包括dsRNA。可以來自一種或多種靶害蟲的單 個序列構建選擇用于表達基因抑制劑的序列，并且用于表達抑制一種或多種靶害蟲中的單 個基因或基因家族的RNA，或該DNA序列可從多種DNA序列構建為嵌合體。
[0050] 本發明中所述的植物可以包括一種植物的任何生殖或繁殖材料，還可以包括植物 細胞、植物原生質體、植物組織培養物、植物愈傷組織及在植物或植物的部分中完好的植物 細胞，這些植物部分如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、核、穗、穗軸、外殼、莖、根、根尖 等。
[0051 ] 本發明所述的褐足角胸葉甲（Basilepta fulvipes)屬于鞘翅目（Coleoptera)葉 甲科(Chrysomeloidea)，是在我國普遍分布的害蟲，可為害多種農作物和經濟作物。在西南 與華南地區主要以成蟲為害香蕉;北方黃淮海地區以成蟲害玉米、大豆、谷子、高粱等。目前 對于褐足角胸葉甲主要采用化學防治。于初夏時，趁褐足角胸葉甲成蟲尚未出土時，將高毒 殺蟲劑噴灑于香蕉園地表，殺死土中幼蟲;或用殺蟲劑作為包衣劑一部分包衣于夏播玉米 種子上，以期殺死一部分的幼蟲。但由于往往這些殺蟲劑毒性較高，同時也將土壤有益生物 也殺死，而褐足角胸葉甲由于幼蟲躲藏在土層的不同深度，且土壤濕度等影響，導致殺蟲劑 并不能有效的對褐足角胸葉甲進行防治。而一旦羽化成蟲后，該蟲能飛善跳，食性雜，一般 殺蟲劑已無法對其進行防控。
[0052]本發明中所述的"控制昆蟲"或"控制害蟲"或"控制昆蟲害蟲"是指能夠導致昆蟲 引起的損害受到限制且作用于昆蟲的任何作用，包括但不限于殺死昆蟲、抑制昆蟲發育、以 昆蟲對植物提供較小損害的方式改變昆蟲的繁殖力或生長、減少昆蟲產生的后代數量、產 生的正常昆蟲更少、產生更易受捕食者攻擊的昆蟲或者阻止昆蟲啃食植物。
[0053]本發明中所述的"靶標序列"為意圖在昆蟲中下調的任何序列。通過下調靶標序列 來控制昆蟲的侵擾，例如破壞昆蟲中必需的生物過程。因此，優選的靶標序列包括但不限于 在調控攝食、存活、生長、發育、生殖、侵襲以及侵染方面發揮關鍵作用的基因。當該靶標序 列的表達被下調或受抑制時，至少20%的昆蟲被殺死;或阻止/延緩/妨礙/延遲/阻礙了至 少20%的昆蟲的生長，阻止了至少20%的昆蟲生殖，阻止了至少20%的昆蟲通過生命周期 的轉變;或由昆蟲引起的損害和/或昆蟲侵染或侵擾環境、表面和/或植物或作物物種的能 力降低;或至少20%的昆蟲停止從其天然食物資源(如植物和植物產物）中攝食。這些靶標 序列可以在昆蟲細胞的全部或部分中表達。此外，這些靶標序列可以僅在昆蟲的生命周期 的特定階段表達，例如成蟲期或幼蟲期或卵期。
[0054]在本發明中，術語"害蟲"優選地是引起植物侵襲/侵擾/侵染的昆蟲，且屬于鞘翅 目，優選為褐足角胸葉甲。術語"侵擾"、"侵染"和/或"侵襲"總體上通篇是可以互換使用的。 [0055]本發明"RNA干擾(RNA i) "是指一些RNA可以高效、特異地阻斷體內特定基因的表 達，促使mRNA降解，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型，其也稱為RNA干預或干涉。RNA干 擾是高度特異的在mRNA水平上的基因沉默機制。
[0056]本發明中"核酸"指從5'至3'末端閱讀的脫氧核糖核酸或核糖核酸堿基的單或雙 鏈聚合物。可選地，"核酸"還可含有非天然存在的或被改變的堿基，其允許通過聚合酶的正 確閱讀，不會降低該核酸編碼的多肽的表達。"核苷酸序列"指作為單獨的單鏈存在或存在 于二體中的核酸的正義和反義鏈。"核糖核酸"（RNA)包括RNAKRNA干擾）、dsRNA(雙鏈RNA)、 siRNA(小干擾RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、tRNA(轉運RNA、被或未被相應的酰化 氨基酸加上電荷的）以及cDNA和基因組DNA以及DNA-RNA雜交體。"核酸片段"、"核酸序列片 段"或更常見的"片段"將被本領域技術人員理解為:其包括基因組序列、核糖體RNA序列、轉 運RNA序列、信使RNA序列、操縱子序列和更小的工程改造過的核苷酸序列，所述序列表達或 可被改造為表達蛋白質、多肽或肽。
[0057]本發明的"干擾核糖核酸"涵蓋了能夠使靶標序列的表達下調或"沉默"的任何類 型的RNA分子，包括但不限于正義RNA、反義RNA、短干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、雙鏈 RNA(dsRNA)、發夾RNA(RNA)等。用于測定功能性干擾RNA分子的方法在本領域中是眾所周知 的并且已被披露。
[0058] 本發明的干擾核糖核酸通過結合于靶標序列內的靶片段來實現特異性下調靶標 序列表達。結合發生的原因是干擾RNA與靶片段的互補區之間的堿基配對。術語"沉默元件" 是指包含與靶標序列內的靶片段互補或至少部分互補的核苷酸序列或由其組成的干擾核 糖核酸的部分或區域，并且該部分或區域作為干擾核糖核酸的活性部分起作用以指導所述 靶標序列表達的下調。該沉默元件包含與靶標序列內的靶片段互補的具有至少17個連續核 苷酸，優選至少18或19個連續核苷酸，更優選至少21個連續核苷酸，甚至更優選至少22、23、 24或25個連續核苷酸的序列或由其組成的干擾核糖核酸。
[0059] 本發明中"靶標序列表達"是指由靶標序列編碼的RNA轉錄物的轉錄和積累和/或 mRNA翻譯成蛋白質。術語"下調"是指干擾核糖核酸借以降低由靶標序列產生的初級RNA轉 錄物、mRNA或蛋白質水平的本領域已知的方法中的任何一種。所述下調是指借以使由一種 基因產生的RNA或蛋白質的水平降低至少10%，優選至少33%，更優選至少50%，甚至更優 選至少80%的情形。特別地，下調是指如與適當控制的昆蟲(例如尚未暴露于干擾核糖核酸 或已經暴露于對照的干擾核糖核酸的昆蟲)相比，在昆蟲細胞內由一種基因產生的RNA或蛋 白質的水平的至少80%，優選至少90%，更優選至少95%，并且最優選至少99%的降低。用 于檢測RNA或蛋白質水平的降低方法在本領域中是眾所周知的，并且包括RNA溶液雜交、 Northern雜交、逆轉錄(例如定量RT-PCR分析）、微陣列分析、抗體結合、酶聯免疫吸附測定 (ELISA)以及Western印跡。同時，下調還可以指如與適當的昆蟲控制相比，RNA或蛋白質的 水平降低到足以導致昆蟲表型產生可檢測到的變化，例如細胞死亡、生長停止等。因此，可 以使用本領域中的常規技術，通過昆蟲的表型分析來測量下調。
[0060] 本發明中"對靶標序列表達的抑制"指靶標序列的蛋白和/或mRNA產物水平降低或 不存在(低于可檢測閾值）。特異性是指抑制靶標序列而對細胞其它基因無作用并且對產生 dsRNA分子的細胞內任何基因沒有影響的能力。
[0061] 本發明中"正義" RNA指對應于下述序列或片段的RNA轉錄本，所述序列或片段以能 通過植物細胞翻譯成蛋白質的mRNA的形式存在。本發明中"反義" RNA指與植物中正常產生 的mRNA的全部或一部分互補的RNA。反義RNA的互補可以是針對特定基因轉錄本的任何部分 的，即5'非編碼序列、3'非編碼序列、內含子或編碼序列。本發明中"RNA轉錄本"指對DNA序 列進行的由RNA聚合酶催化的轉錄得到的產物。當RNA轉錄本是DNA序列的完全互補拷貝時， 其被稱為一級轉錄本，或者其可以是對一級轉錄本進行轉錄后加工獲得的RNA，其被稱為成 熟 RNA〇
[0062] 本發明中干擾核糖核酸通過RNA干擾或RNAi來下調基因的表達。RNAi是典型地由 雙鏈RNA分子(如短干擾RNA(siRNA))所介導的一種序列特異性基因調控方法。siRNA包含通 過與反義RNA鏈互補堿基配對而退火的一個正義RNA鏈。siRNA分子的正義鏈或"引導鏈"包 含與位于靶標序列的RNA轉錄物內的核苷酸序列互補的核苷酸序列。因此，siRNA的正義鏈 能夠通過沃森-克里克型(胃381：011-〇；[01^7卩6)堿基配對與1?祖轉錄物退火，并且祀向該1?· 以在稱為RNAi誘導沉默復合物或RISC的細胞復合物內降解。在本發明優選的干擾核糖核酸 的情況下，沉默元件可以是包含退火的互補鏈的雙鏈區，其中至少一條鏈包含與靶標序列 內的靶片段序列互補或至少部分互補的核苷酸序列或由其組成的干擾核糖核酸。該雙鏈區 具有至少大約19至大約25個堿基對的長度，或者大約25至大約100個堿基對的長度，甚至是 大約3000個堿基對的長度。
[0063] 本發明中dsRNA分子可以充當活性siRNA分子的前體，這些活性siRNA分子引導RNA 轉錄物至RISC復合物以進行隨后的降解。存在于生物體或其細胞周圍環境中的dsRNA分子 可以被生物體攝取并且被稱為DICER的酶加工以得到siRNA分子。可選擇地，dsRNA分子可以 在體內產生，即由存在于細胞(例如細菌細胞或植物細胞）內的編碼該dsRNA的一種或多種 多核苷酸轉錄，并且在攝入了更長的前體dsRNA后，通過宿主細胞內或優選在昆蟲細胞內的 DICER加工。該dsRNA可以由借助于互補堿基配對而退火的兩條單獨的（正義和反義)RNA鏈 形成。可替代地，dsRNA可以是一條單鏈，它能夠自身重新折疊以形成發夾RNA或莖環結構。 在一條RNA的情況中，雙鏈區或"莖"是由該RNA的兩個區域或區段形成，這些區域或區段基 本上是彼此的反向重復序列并且具有足夠的互補性以允許形成一個雙鏈區。在該分子的這 個"莖區域"中可以存在一個或多個功能性雙鏈沉默元件。反向重復區域典型地被RNA中稱 為"環"區的一個區域或區段隔開。這個區域可以包含任何賦予足夠柔性以允許在RNA的側 翼互補區域之間發生自配對的核苷酸序列，總體而言，該環區實質上是單鏈的并且充當反 向重復序列之間的間隔序列。
[0064]本發明中干擾核糖核酸包含至少一個雙鏈區，典型地是該干擾核糖核酸的沉默元 件，它包含通過與反義RNA鏈互補堿基配對而退火的正義RNA鏈，其中dsRNA分子的正義鏈包 含與位于靶標序列的RNA轉錄物內的核苷酸序列互補的核苷酸序列。沉默元件或其至少一 條鏈（當沉默元件為雙鏈時）可以與靶標序列的靶片段完全地互補或部分地互補。術語"完 全地互補"是指沉默元件核苷酸序列的所有堿基都與靶片段的堿基互補或"匹配"。術語"至 少部分地互補"是指沉默元件的堿基與靶片段的堿基之間存在小于100%的匹配。本領域技 術人員將理解，為了介導靶標序列表達的下調，沉默元件僅需要與靶片段至少部分的互補。 本領域已知，相對于靶標序列而具有插入、缺失以及錯配的RNA序列在RNAi方面仍然可以有 效。優選的是，沉默元件與靶標序列的靶片段共有至少80%或85%的序列一致性，優選至少 90 %或95 %的序列一致性，或更優選至少97 %或98 %的序列一致性并且再優選至少99 %的 序列一致性。可選擇的，在24個部分地互補的核苷酸的每個長度上，如與靶片段相比，沉默 元件可以包含1、2或3個錯配。本領域技術人員所公知的，沉默元件與靶片段之間共有的互 補性程度因有待下調的靶標序列或者基因表達有待控制的昆蟲物種而改變。
[0065] 本發明中靶片段可以選自靶標序列或其RNA轉錄物的任何合適區域或核苷酸序 列。例如，靶片段可以位于靶標序列或RNA轉錄物的5'UTR或3'UTR內，或者基因的外顯子或 內含子區域內。
[0066] 本發明的干擾核糖核酸可以包含一個或多個沉默元件，其中每個沉默元件包含與 靶標序列內的靶片段至少部分地互補的核苷酸序列或由其組成，并且在被昆蟲攝入后起到 下調所述靶標序列表達的作用。術語"多個"意指至少兩個，至少三個，至少四個等并且直到 至少10、15、20個或至少30個。干擾核糖核酸包含單一沉默元件的多個拷貝，即結合于一個 特定靶標序列內的一個特定靶片段的沉默元件的重復。干擾核糖核酸內的沉默元件還可以 包含與不同靶片段互補的不同核苷酸序列或由其組成。應該清楚的是，與結合于不同靶片 段的沉默元件組合的相同沉默元件的多個拷貝的組合亦在本發明的范圍內。
[0067] 本發明中為了實現鞘翅目昆蟲中特定靶標序列的下調，不同靶片段可以來源于一 種昆蟲中的單一靶標序列。在這種情況下，沉默元件在干擾核糖核酸中可以按靶片段在靶 標序列中存在的原始順序組合，或者如與靶標序列中靶片段的順序相比，沉默元件在干擾 核糖核酸的環境中可以打亂并按任何等級次序隨機地組合。
[0068] 可選擇地，不同靶片段代表著單一靶標序列，但是來源于不同昆蟲物種。
[0069] 可選擇地，不同靶片段可以來源于不同靶標序列。如果將干擾核糖核酸用于預防 和/或控制害蟲侵襲，那么優選的是，不同靶標序列是選自調控昆蟲的必需生物功能的基因 的組，這些生物功能包括但不限于存活、生長、發育、生殖以及致病性。靶標序列可以調控相 同或不同的生物途徑或過程。
[0070] 本發明中，由不同沉默元件靶向的不同基因來源于相同的昆蟲。這種方法可用來 實現針對單一昆蟲的增強的攻擊。具體地說，不同靶標序列可以在昆蟲生命周期的不同階 段，例如成熟的成蟲期、未成熟的幼蟲期以及卵期有差別地表達。因此，本發明的干擾核糖 核酸可以用于在昆蟲生命周期的一個以上階段中預防和/或控制昆蟲侵襲。可替代地，由不 同沉默元件靶向的不同基因來源于不同的昆蟲，因此，本發明的干擾核糖核酸還可以用于 同時預防和/或控制一種以上昆蟲的侵襲。
[0071] 本發明中沉默元件可以為干擾核糖核酸的一個連續區域或者可以通過接頭序列 的存在加以隔開。接頭序列可以包含不與任何靶片段或靶標序列互補的短的隨機核苷酸序 列。該接頭序列可以為條件性自切割RNA序列，優選的是pH敏感性接頭或疏水敏感性接頭。 該接頭還可以包含與內含子序列等效的核苷酸序列。該接頭序列的長度可以在1個堿基對 到約10000個堿基對的范圍內，其條件是該接頭不會削弱干擾核糖核酸下調基因表達的能 力。
[0072] 除了一個或多個沉默元件和任何接頭序列外，本發明的干擾核糖核酸還可以包含 至少一種另外的多核苷酸序列。該另外的多核苷酸序列選自（1)能夠保護干擾核糖核酸免 于RNA加工的序列；（2)影響干擾核糖核酸的穩定性的序列；（3)允許蛋白質結合以促進干擾 核糖核酸被昆蟲細胞攝入的序列；（4)促進大規模產生干擾核糖核酸的序列；（5)作為結合 于受體或結合于昆蟲細胞表面上的分子以促進攝入的適體的序列；或(6)催化昆蟲細胞中 干擾核糖核酸的加工并由此增強干擾核糖核酸的效力的序列。
[0073] 本發明的干擾核糖核酸的長度需要足以被昆蟲的細胞攝入并且使昆蟲的靶標序 列下調。長度的上限可以取決于（1)干擾核糖核酸被昆蟲細胞攝取的要求和(2)干擾核糖核 酸在昆蟲細胞中被加工以通過RNAi途徑介導基因沉默的要求，也可以通過生產方法和用于 遞送干擾核糖核酸到細胞中的配制品來制定長度。優選地，本發明的干擾核糖核酸的長度 將在17與10000個核苷酸之間，優選在50與5000個核苷酸之間或在100與2500個核苷酸之 間，更優選長度在80與2000個核苷酸之間。
[0074] 本發明該干擾核糖核酸可以包含DNA堿基、非天然堿基或者糖-磷酸骨架的非天然 骨架連接或修飾，例如以增強存儲期間的穩定性或增強對核酸酶降解的抗性。此外，該干擾 核糖核酸可以由本領域的普通技術人員通過手動或自動反應以化學方法或酶促方法產生。 可選擇地，該干擾核糖核酸可以由編碼其的多核苷酸轉錄。因此，本發明提供了編碼該干擾 核糖核酸中的任何一種分離的多核苷酸。
[0075]本發明的多核苷酸可以通過常規分子克隆技術插入到本領域中已知的DNA構建體 或載體中。該DNA構建體可以是重組DNA載體，例如細菌、病毒或酵母載體。該DNA構建體是一 種表達構建體并且該多核苷酸可操作地連接到至少一個能夠驅動多核苷酸序列表達的調 控序列。術語"調控序列"是指能夠影響可操作地連接的多核苷酸表達的任何核苷酸序列， 包括但不限于啟動子、增強子以及其它天然產生的或合成的轉錄激活元件。調控序列可以 位于該多核苷酸序列的5'或3'端。術語"可操作地連接"是指調控序列與多核苷酸序列之間 的功能性連接，該連接使得該調控序列驅動該多核苷酸的表達。可操作地連接的元件可以 是連續的或不連續的。
[0076]本發明中調控序列可以是一種啟動子，優選地，所述啟動子為植物中可表達的啟 動子，所述的"植物中可表達的啟動子"是指確保與其連接的該多核苷酸在植物細胞內進行 表達的啟動子。植物中可表達的啟動子可為組成型啟動子。指導植物內組成型表達的啟動 子的示例包括但不限于，來源于花椰菜花葉病毒的35S啟動子、玉米ubi啟動子、水稻G0S2基 因的啟動子等。備選地，植物中可表達的啟動子可為組織特異的啟動子，即該啟動子在植物 的一些組織內如在綠色組織中指導編碼序列的表達水平高于植物的其他組織(可通過常規 RNA試驗進行測定），如PEP羧化酶啟動子。備選地，植物中可表達的啟動子可為創傷誘導啟 動子。創傷誘導啟動子或指導創傷誘導的表達模式的啟動子是指當植物經受機械或由昆蟲 啃食引起的創傷時，啟動子調控下的該多核苷酸的表達較正常生長條件下有顯著提高。創 傷誘導啟動子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因（pinl和pinn)和 玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動子。
[0077] 可選地，一種或多種轉錄終止序列可以被合并到本發明的表達構建體中。術語"轉 錄終止序列"涵蓋在轉錄單元末端處的控制序列，它發送初級轉錄物的轉錄終止、3'加工以 及多聚腺苷酸化的信號。另外的調控元件包括但不限于轉錄或翻譯增強子，可以被合并到 表達的構建體中，例如，雙增強CaMV35S啟動子。
[0078] 本發明中用于產生任一種干擾核糖核酸的方法，包括以下步驟：（1)使編碼所述干 擾核糖核酸的多核苷酸或包含該多核苷酸的DNA構建體與不含細胞的組分接觸；（2)將編碼 所述干擾核糖核酸的多核苷酸或包含該多核苷酸的DNA構建體引入(如通過轉化、轉染或注 射)到細胞中。
[0079] 本發明中，包含任一種本發明的干擾核糖核酸、任一種本發明的多核苷酸或包含 這些多核苷酸的DNA構建體的宿主細胞，可以是一種原核細胞，包括但不限于革蘭氏陽性和 革蘭氏陰性細菌細胞;或一種真核細胞，包括但不限于酵母細胞或植物細胞。優選地，所述 宿主細胞是一種細菌細胞或植物細胞。本發明的該多核苷酸或DNA構建體在宿主細胞中可 以作為染色體外元件存在或維持，或者可以穩定地合并到宿主細胞基因組中。
[0080] 本發明中，當干擾核糖核酸在宿主細胞中表達和/或被用于預防和/或控制宿主生 物體的昆蟲侵擾的情況下，優選的是干擾核糖核酸不展現出顯著的"脫祀"效應，即干擾核 糖核酸不影響宿主內非靶標序列的表達。優選地，沉默基因不展現與除靶標序列的既定靶 片段之外的核苷酸序列的顯著互補性。沉默元件顯示出與宿主細胞或生物體的任何基因的 小于30%，更優選小于20%，更優選小于10%并且甚至更優選小于5%的序列一致性。如果 宿主生物體的基因組序列數據是可得到的，那么人們可以使用標準的生物信息學工具交叉 檢驗與沉默元件的一致性。在有17個連續核苷酸的區域內，更優選在有18個或19個連續核 苷酸的區域內，并且最優選在有19個或20個或21個連續核苷酸的區域內，沉默元件與來自 宿主細胞或生物體的基因之間不存在序列一致性。
[0081] 本發明中用于預防和/或控制昆蟲侵擾的組合物包含至少一種干擾核糖核酸和任 選地至少一種合適的載體、賦形劑或稀釋劑，其中該干擾核糖核酸在被昆蟲攝入后起到下 調所述昆蟲內一種靶標序列表達的作用。該干擾核糖核酸包含至少一個沉默元件或由其組 成，并且所述沉默元件是包含退火的互補鏈的一個雙鏈RNA區域，其中一條鏈(正義鏈)包含 與靶標序列內的一個靶片段至少部分地互補的一個核苷酸序列。靶標序列包括但不限于調 控昆蟲存活、生長、發育、生殖以及致病性的基因。可選地，該組合物包含至少一個宿主細 胞，該宿主細胞包含至少一個干擾核糖核酸或編碼該干擾核糖核酸的DNA構建體以及任選 地至少一種合適的載體、賦形劑或稀釋劑，其中在該宿主細胞被昆蟲攝入后，該干擾核糖核 酸起到下調所述昆蟲內一種靶標序列表達的作用。
[0082]本發明的該組合物可以呈現施用給昆蟲的任何合適的物理形式。例如，該組合物 可以呈固體形式(粉末、球粒或誘餌）、液體形式(包括作為一種殺昆蟲噴霧劑)或凝膠形式。 該組合物可以是一種涂料、糊劑或粉末，它可以被施用到一種基質以便保護所述基質免遭 昆蟲的侵擾。該組合物可以用來保護對昆蟲侵襲或由昆蟲引起的損害敏感的任何基質或材 料。
[0083]賦形劑的性質和組合物的物理形式可以因所希望處理的基質的性質而改變。例 如，該組合物可以是一種液體，它被刷在或噴在有待處理的材料或基質之上或者印在有待 處理的材料或基質中；或是一種涂料或粉末，它被施用到有待處理的材料或基質上。
[0084] 本發明中，該組合物可以呈誘餌形式。該誘餌用來引誘昆蟲與該組合物接觸。在與 之接觸之后，該組合物隨后被昆蟲通過例如攝取而內化并且介導RNAi，從而殺死昆蟲。所述 誘餌可以包含一種食物，如一種基于蛋白質的食物，例如魚粉。硼酸也可以用作一種誘餌。 該誘餌可以取決于所靶向的物種。還可以使用一種引誘劑，例如，該引誘劑可以是一種信息 素，如一種雄性或雌性信息素。引誘劑起到引誘昆蟲接觸組合物的作用，并且可以被靶向一 種特定的昆蟲或可以吸引整個范圍內的昆蟲，增加這些被引誘的昆蟲與本發明所述組合物 的接觸機會，從而起到殺死大量昆蟲的目的。誘餌可以呈任何合適的形式，如固體、糊劑、球 粒或粉末形式。
[0085] 誘餌還可以被昆蟲帶回到群落。然后誘餌可以充當該群落其他成員的食物來源， 從而提供了對大量昆蟲和潛在的整個昆蟲群落的一種有效控制。誘餌還可以被提供在一個 合適的"殼體"或"捕獲器"中。
[0086] 另外，與昆蟲接觸的組合物可以保留在昆蟲的表皮上。當清潔時，無論是一只單獨 的昆蟲清潔自身或是昆蟲彼此清潔，這些組合物都可以被攝取并且可以由此介導它們在昆 蟲中的作用。這需要該組合物足夠地穩定以使得即使暴露于外部環境條件一段時間（如數 天)后，干擾核糖核酸仍保持完整并且能夠介導RNAi。
[0087] 本發明中該組合物可以呈一種噴霧劑形式提供。因此，人類使用者可以直接用該 組合物噴昆蟲。該組合物然后被昆蟲內化，在昆蟲體內，它可以介導RNA干擾，從而控制昆 蟲。噴霧劑優選的是一種加壓/霧化噴霧劑或一種栗式噴霧劑。這些顆粒可以具有合適的大 小以使得它們粘附在昆蟲上，例如粘附在外骨骼上，并且可以從那里被吸收。
[0088] 本發明中該組合物的載體是一種帶靜電的粉末或顆粒，它粘附在昆蟲上。可選地， 該組合物的載體可以包含磁性顆粒，這些顆粒粘附在昆蟲表皮上。可選地，該組合物的載體 包括金屬顆粒，這些顆粒最初是未磁化的但能夠在經歷了由昆蟲身體所提供的電場時變得 磁性地極化。優選地，該組合物合并入一種載體，該載體增加了昆蟲中干擾RNA的攝入。這種 載體可以是一種基于脂質的載體，優選地包含以下各項中的一種或多種:水包油型乳液、膠 束、膽固醇、脂多胺以及脂質體。促進本發明構建體攝入的其它試劑是本領域技術人員眾所 周知的并且包括聚陽離子、右旋糖酐以及陽離子脂質，如CS096、CS102等。可選地，該組合物 的載體是一種核酸凝聚劑，優選的核酸凝聚劑包括亞精胺或硫酸魚精蛋白或其衍生物。
[0089] 在本發明的該組合物適用于預防和/或控制植物的昆蟲侵襲的情況下，該組合物 可以包含一種農業上合適的載體。這種載體可以是有待處理的植物可以耐受的任何材料， 這種材料不會對環境或其中的其它生物體造成不當的損害并且它允許干擾核糖核酸針對 昆蟲保持有效。具體地說，本發明的該組合物可以根據生物殺蟲劑行業中所用的常規農業 實踐進行配制以遞送給植物。該組合物可以包含能夠執行其他功能的另外組分，這些功能 包括但不限于（1)增強或促進昆蟲細胞對干擾核糖核酸的攝入和(2)使該組合物的活性組 分穩定。在包含干擾核糖核酸的組合物中所含的這類另外組分可以是酵母tRNA或酵母總 RNA〇
[0090] 該組合物可以被配制用于直接施用或配制為在使用之前需要稀釋的初級組合物 的濃縮形式。可選地，該組合物可以按試劑盒形式供應，該試劑盒包含在一個容器中的干擾 核糖核酸或者包含/表達干擾核糖核酸的宿主細胞以及在一個單獨的容器中的用于該RNA 或宿主細胞的合適的稀釋劑或載體。在本發明的應用中，該組合物可以被施用到處于植物 發育的任何階段的植物或植物的任何部分，例如在植物于田地中培養期間，將組合物施用 給植物的地上部分；當植物種子在存儲時或在將其種植到土壤中之后，將組合物施用給植 物種子。總而言之，在植物生長的早期獲得對昆蟲的良好控制是重要的，因為這是植物可能 受到昆蟲最嚴重損害的時期。
[0091] 本發明中，可以通過不同的技術將該組合物施用到昆蟲的環境中，這些技術包括 但不限于噴霧、霧化、撒粉、散布、傾注、涂布種子、種子處理、引入到土壤中以及引入到灌溉 水中。在處理對昆蟲侵擾敏感的植物時，可以在出現昆蟲之前（出于預防的目的）或在昆蟲 侵擾的跡象開始出現之后（出于控制的目的），將該組合物遞送給植物或植物的一部分。
[0092] 本發明的該組合物可以被配制成包含至少一種另外的活性劑。因此，該組合物可 以按一種"分多部分的試劑盒"形式提供，試劑盒包括在一個容器中的含干擾核糖核酸的組 合物和在一個單獨的容器中的一種或多種合適的活性成分，例如化學或生物殺蟲劑。可選 地，該組合物可以按一種混合物形式提供，該混合物是穩定的并且彼此聯合使用。
[0093] 可以按一種互補方式作用于本發明的干擾核糖核酸的合適的活性成分包括但不 限于以下各項：毒死蜱、丙烯菊酯、芐呋菊酯、四溴乙基、二甲醇-環丙烷甲酸(總體上被包括 在液體組合物中）；以及氟蟻腙、阿維菌素、毒死蜱、氟蟲胺、烯蟲乙酯、氟蟲腈(GABA受體）、 氨基甲酸異丙基苯基甲酯、茚蟲威、多氟脲(幾丁質合成抑制劑）、炔咪菊酯、阿巴美丁 (谷氨 酸酯門控的氯離子通道）、吡蟲啉（乙酰膽堿受體）（總體上被包括在誘餌組合物中）。優選 地，就健康和環境考慮來說，已知活性成分是一種殺昆蟲劑，如氟蟻腙和阿維菌素。
[0094] 本發明中該組合物可以被配制成包含至少一種另外的農藝學試劑，例如一種除草 劑或一種另外的殺蟲劑。"另外的殺蟲劑"或"第二殺蟲劑"是指除了該組合物的第一或原始 干擾RNA分子以外的一種殺蟲劑。可選地，本發明的該組合物可以與至少一種其它農藝學試 劑(例如一種除草劑或一種第二殺蟲劑)組合遞送。該組合物可以與一種除草劑組合提供， 該除草劑選自本領域中已知的任何除草劑，例如草甘膦、咪唑啉酮、磺脲以及溴苯腈。該組 合物還可以與至少一種另外的殺蟲劑組合提供，該另外的殺蟲劑可以選自本領域中已知的 任何殺蟲劑和/或可以包含一種干擾核糖核酸，該干擾核糖核酸在被一種昆蟲攝入后起到 下調所述昆蟲中的一種靶標序列表達的作用。靶害蟲是一種昆蟲并且干擾核糖核酸是選自 本發明干擾核糖核酸中的任何一個。該另外的殺蟲劑包含一種干擾核糖核酸，它起到下調 任何靶害蟲中一種已知基因表達的作用。該組合物原始干擾核糖核酸和第二或另外的殺蟲 劑可以靶向相同的或不同的昆蟲。例如，原始干擾核糖核酸和第二殺蟲劑可以靶向不同的 昆蟲或可以靶向不同科或綱的昆蟲，例如真菌或線蟲或昆蟲。本領域的普通技術人員應清 楚如何測試干擾核糖核酸與其它農藝學試劑組合的協同效應。優選地，該組合物包含一種 第一干擾核糖核酸和一種或多種另外的殺蟲劑，每一種都對相同的昆蟲具有毒性，其中這 一種或多種另外的殺蟲劑選自馬鈴薯塊莖特異蛋白、蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌 殺蟲蛋白、光桿狀菌殺蟲蛋白、側孢芽孢桿菌殺蟲蛋白、球形芽孢桿菌殺蟲蛋白以及木質 素。不同組分可以同時或依次遞送到有待處理的區域或生物體。
[0095] RNAi是基于昆蟲體內自身的一些RNAi途徑當中的酶來起反應的。已經被證實的 是，在一些生物中由于不具有將雙鏈RNA吸收入細胞內的能力，或者是將雙鏈RNA剪切成為 siRNA的能力，或者是缺乏能夠讓siRNA特異性結合到目標基因上的能力，而導致在這些生 物體內不能產生RNAi反應。
[0096] 本發明用于預防和/或控制昆蟲侵襲的方法包括使昆蟲與有效量的至少一種干擾 核糖核酸接觸，其中該干擾核糖核酸在被所述昆蟲攝入后起到下調必需的昆蟲靶標序列表 達的作用。該必需的靶標序列可以是涉及于調控昆蟲引發或維持侵擾所需的必需生物過程 的任何昆蟲的基因，該生物過程包括但不限于存活、生長、發育、生殖以及致病性。
[0097] 本發明用于預防和/控制作物植物田地中的昆蟲侵襲的方法包括在所述植物中表 達有效量的該干擾核糖核酸，在該方法用于控制昆蟲侵襲的情況下，術語"有效量"是指對 昆蟲產生一種表型作用以使得侵擾宿主生物體的昆蟲數目減少和/或由該昆蟲引起的損害 量降低所需要的干擾核糖核酸的量或濃度。表型作用可以為昆蟲的死亡并且使用干擾RNA 實現了與對照昆蟲相比，至少20 %、30 %、40 %，優選至少50 %、60 %、70 %，更優選至少80 % 或90%的昆蟲死亡率。表型作用還可以包括但不限于妨礙昆蟲生長、攝食停止以及減少產 卵。因此，與對照昆蟲相比，侵襲宿主生物體的昆蟲的總數目可以減少至少20%、30%、 40 %，優選至少50 %、60 %、70 %，更優選至少80 %或90 %。可選地，與對照昆蟲相比，由昆蟲 引起的損害可以降低至少20 %、30 %、40 %，優選至少50 %、60 %、70 %，更優選至少80 %或 90 %。因此，本發明可以用于實現至少20 %、30 %、40 %，優選至少50 %、60 %、70 %，更優選 至少80 %或90 %的昆蟲控制。
[0098] 本發明的方法和組合物可以用于通過在害蟲的食物中提供本發明一種或多種包 含dsRNA分子的組合物，在任何害蟲宿主、害蟲共生體或害蟲存在的環境內部或表面上限制 或消除鞘翅目害蟲的侵襲，優選為褐足角胸葉甲。該方法對于防止昆蟲攻擊植物特別有益， 害蟲限定為消化系統的pH為大約4.5至大約9.5,大約5至大約9,大約6至大約7以及大約 ρΗ7·0〇
[0099] 本發明的核苷酸序列可以包含被"間隔序列"分離開的反向重復。間隔序列可以是 包含下述任何核苷酸序列的區域，如果需要的話，所述核苷酸序列能促進每段重復之間二 級結構形成。間隔序列是用于mRNA的正義或反義編碼序列的一部分。或者，間隔序列可以包 含能與核酸分子共價連接的核苷酸或其同源物的任何組合。間隔序列可包含長度為至少大 約10-100個核苷酸的核苷酸序列，或者長度為至少大約100-200個核苷酸，長度為至少大約 200-400個核苷酸，或者長度為至少大約400-500個核苷酸。
[0100] 本發明中將該干擾核糖核酸"引入"植株時，其表示可通過直接轉化的方法發生， 所述方法例如對植物組織的農桿菌介導的轉化、微粒發射轟擊、電穿孔等;或者可通過將具 有異源核苷酸序列的植株與另一植株雜交來進行，使得后代具有并入它們基因組的核苷酸 序列。此類育種技術是本領域技術人員公知的。
[0101] 本發明提供了一種用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法，具有以下優點：
[0102] 1、本發明首次公開了用于控制鞘翅目昆蟲害蟲褐足角胸葉甲的靶標序列，同時驗 證了基于這個靶標序列獲得的核酸抑制物可直接用于控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲。
[0103] 2、高度特異。本發明用于控制鞘翅目昆蟲害蟲褐足角胸葉甲的靶片段不影響宿主 內的非靶標序列的表達。
[0104] 3、避免產生抗性。本發明提供了用于控制鞘翅目昆蟲害蟲褐足角胸葉甲的靶標序 列，不定期的替換靶標序列或者混用靶標序列可避免褐足角胸葉甲產生抗性。
[0105] 4、本發明利用的RNAi技術具有高效性和特異性，可將獲得的dsRNA直接應用于田 間控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲，方便且成本低，環境兼容性好。
[0106] 下面通過附圖和實施例，對本發明的技術方案做進一步的詳細描述。
【附圖說明】
[0107] 圖1為本發明用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方法的重組表達載體 DBN110017載體示意圖。
【具體實施方式】
[0108] 下面通過具體實施例進一步說明本發明用于控制昆蟲侵襲的核苷酸序列及其方 法的技術方案。
[0109] 第一實施例、褐足角胸葉甲靶標序列的確定
[0110] 通過全轉錄組測序，獲得褐足角胸葉甲的幼蟲和成蟲的轉錄組，從各個代謝途徑 中篩選出來自褐足角胸葉甲5個候選基因的7個靶標序列，具體信息如表1所示：
[0111] 表1、褐足角胸葉甲5個候選基因的具體信息表
[0112]
[0113] 第二實施例、植物表達載體的構建
[0114] 按照花椰菜花葉病毒35S啟動子-靶標序列正義鏈-間隔序列-靶標序列反義鏈聯 接在一起，并和能賦予潮霉素選擇的標記基因 Hpt形成表達載體。
[0115] 正義引物兩端分別帶有EcoR I和Hindm酶切位點，反義引物兩端分別帶有Xho I 和Sac頂每切位點，間隔序列引物兩端分別帶有Hindm和Sac頂每切位點。
[0116] 將含有正義鏈的重組克隆載體經EcoR I和Hindm雙酶切，并回收正義鏈片段。將 重組表達載體DBNBC-01做同樣的雙酶切回收線性化的質粒，與目的片段rl連接，得到重組 表達載體DBNBC-01 -r 1。將重組表達載體DBNBC-01 -r 1經Xho I和Sac I雙酶切，并回收線性 化質粒。將含有反義鏈的重組克隆載體經Xho I和Sac I雙酶切，并回收反義鏈片段。將雙酶 切后的重組表達載體DBNBC-01-rl與反義鏈片段進行連接，得到重組表達載體DBNBC-01- rlX2。將重組表達載體DBNBC-01-rlX2和帶有間隔序列的puc-Spacer分別用Hindm和Sac I 雙酶切，回收間隔序列和線性化的DBNBC-01-rlX2,并將兩者連接，構建成含有花椰菜花葉 病毒35S啟動子-靶標序列正義鏈-間隔序列-靶標序列反義鏈的重組表達載體DBN11QQ17。利 用常規的酶切方法構建載體是本領域技術人員所熟知的，重組表達載體DBN11QQ17的載體示 意圖如圖1所示(Kan:卡那霉素基因；RB:右邊界;prCaMV35S:花椰菜花葉病毒35S(SEQ ID N0:15);rl(SEQIDN0:3):靶標序列l的核苷酸序列（SEQIDN0 :l)+間隔序列+靶標序列l 的反向互補核苷酸序列；tNos:胭脂堿合成酶基因的終止子(SEQ ID N0:16);Hpt:潮霉素磷 酸轉移酶基因 （SEQ ID N0:17);LB:左邊界）。
[0117] 將重組表達載體DBNnoon用熱激方法轉化大腸桿菌T1感受態細胞，其熱激條件為： 50μ1大腸桿菌T1感受態細胞、?ομL質粒DNA(重組表達載體DBN110017)，42°C水浴30秒;37°C 振蕩培養1小時（l〇〇rpm轉速下搖床搖動）；然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體 平板(胰蛋白胨1(^/1，酵母提取物58/1，他(：11(^/1，瓊脂158/1，用他0!1調?!1至7.5)上于溫 度37 °C條件下培養12小時，挑取白色菌落，在LB液體培養基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調pH至7 · 5)中于溫度37 °C條件下培養過夜。堿 法提取其質粒。將提取的質粒用PCR進行測序鑒定，結果表明重組表達載體DBN11Q(m構建正 確。
[0118] 按照上述方法構建重組表達載體DBN110018(r2(SEQ ID N0:4):靶標序列2的核苷 酸序列（SEQ ID N0:2) +間隔序列+靶標序列2的反向互補核苷酸序列）、DBN100999(r3(SEQ ID N0:7):靶標序列3的核苷酸序列（SEQ ID N0:5)+間隔序列+靶標序列3的反向互補核苷 酸序列）、DBN110000(r4(SEQ ID N0:8):靶標序列4的核苷酸序列（SEQ ID N0:6)+間隔序列 +靶標序列4的反向互補核苷酸序列）、DBN110013(r5(SEQIDN0:10):靶標序列5的核苷酸 序列（SEQ ID N0:9)+間隔序列+靶標序列5的反向互補核苷酸序列）、DBN110016(r6(SEQ ID NO: 12):靶標序列6的核苷酸序列（SEQ ID NO: 11)+間隔序列+靶標序列6的反向互補核苷酸 序列）和DBN110041(r7(SEQIDN0:14):靶標序列7的核苷酸序列（SEQIDN0 :13)+間隔序 列+靶標序列7的反向互補核苷酸序列），將重組表達載體DBN110018、DBN100999、 DBN110000、DBN110013、DBN110016和DBN110041用熱激方法轉化大腸桿菌T1感受態細胞，并 堿法提取其質粒。對質粒進行PCR鑒定，并將PCR產物進行測序鑒定，確定重組表達載體 08價10018、08價00999、08價10000、08價10013、08價10016和08機10041構建正確。
[0119] 第三實施例、重組表達載體轉化農桿菌
[0120] 對己經構建正確的重組表達載體 DBN110017、DBN110018、DBN100999、DBN110000、 DBN110013、DBN110016 和 DBN110041 用液氮法轉化到農桿菌 LBA4404( Invitrogen，Chicago， USA，CAT: 18313-015)中，其轉化條件為：100yL農桿菌LBA4404、3yL質粒DNA(重組表達載 體）；置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘;將轉化后的農桿菌LBA4404接種于LB試管中于 溫度28°C、轉速為200rpm條件下培養2小時，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/ L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長出陽性單克隆，挑取單克隆培養并提取其質 粒，用限制性內切酶EcoRI和Xho I對重組表達載體DBN110017、DBN110018、DBN100999、 08附10000、08附10013、08附10016和08附10041酶切后進行酶切驗證，結果表明重組表達載 體 08附10017、08價10018、08附00999、08附10000、08附10013、08價10016和08附10041結構 完全正確。
[0121]第四實施例、獲得轉基因玉米植株
[0122]按照常規采用的農桿菌侵染法，將無菌培養的玉米品種綜31(Z31)的幼胚與第三 實施例所述的農桿菌共培養，以將第二實施例中構建的重組表達載體DBN110017、 08附10018、08附00999、08價10000、08附10013、08附10016和08附10041中的1'-0嫩（包括『1 至r7核苷酸序列、花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子序列、Hpt基因和tNos終止子序列)轉入 到玉米染色體組中，獲得了轉入r 1核苷酸序列的玉米植株、轉入r2核苷酸序列的玉米植株、 轉入r3核苷酸序列的玉米植株、轉入r4核苷酸序列的玉米植株、轉入r5核苷酸序列的玉米 植株、轉入r6核苷酸序列的玉米植株和轉入r7核苷酸序列的玉米植株；同時以野生型玉米 植株作為對照。
[0123 ]對于農桿菌介導的玉米轉化，簡要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農桿菌懸浮 液接觸幼胚，其中農桿菌能夠將rl核苷酸序列、r2核苷酸序列、r3核苷酸序列、r4核苷酸序 列、r5核苷酸序列、r6核苷酸序列、r7核苷酸序列傳遞至幼胚之一的至少一個細胞(步驟1: 侵染步驟）。在此步驟中，幼胚優選地浸入農桿菌懸浮液(〇D66Q = 0.4-0.6，侵染培養基(MS鹽 4.3g/L、MS 維他命、干酪素 300mg/L、鹿糖 68 · 5g/L、葡萄糖 36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2， 4-二氯苯氧乙酸（2,4-0)111^/1，？!15.3))中以啟動接種。幼胚與農桿菌共培養一段時期（3 天）（步驟2:共培養步驟）。優選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他 命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸 (2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養。在此共培養階段后，可以有一個選擇性的"恢復" 步驟。在"恢復"步驟中，恢復培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2， 4-二氯苯氧乙酸（2,4-D) lmg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)中至少存在一種己知抑制農桿菌生 長的抗生素(頭孢霉素），不添加植物轉化體的選擇劑(步驟3:恢復步驟）。優選地，幼胚在有 抗生素但沒有選擇劑的固體培養基上培養，以消除農桿菌并為侵染細胞提供恢復期。接著， 接種的幼胚在含選擇劑(潮霉素）的培養基上培養并選擇生長著的轉化愈傷組織(步驟4:選 擇步驟）。優選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養基（MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪素 300mg/L、鹿糖30g/L、潮霉素50mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸（2，4-D) lmg/L、植物凝膠3g/L， pH5.8)上培養，導致轉化的細胞選擇性生長。然后，愈傷組織再生成植物（步驟5:再生步 驟），優選地，在含選擇劑的培養基上生長的愈傷組織在固體培養基(MS分化培養基和MS生 根培養基)上培養以再生植物。
[0124] 篩選得到的抗性愈傷組織轉移到所述MS分化培養基(MS鹽4.3g/L、MS維他命、干酪 素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、潮霉素50mg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25°C 下培養分化。分化出來的小苗轉移到所述MS生根培養基(MS鹽2.15g/L、MS維他命、干酪素 300mg/L、鹿糖30g/L、吲噪-3-乙酸lmg/L、植物凝膠3g/L，pH5.8)上，25°C下培養至約10cm 高，移至溫室培養至結實。在溫室中，每天于28 °C下培養16小時，再于20 °C下培養8小時。
[0125] 第五實施例、用TaqMan驗證轉基因玉米植株
[0126]分別取轉入rl核苷酸序列的玉米植株、轉入r2核苷酸序列的玉米植株、轉入r3核 苷酸序列的玉米植株、轉入r4核苷酸序列的玉米植株、轉入r5核苷酸序列的玉米植株、轉入 r6核苷酸序列的玉米植株和轉入r7核苷酸序列的玉米植株的葉片約100mg作為樣品，分別 用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因組DNA，通過Taqman探針焚光定量PCR方法 檢測Hpt基因的拷貝數以確定rl至r7核苷酸序列的拷貝數。同時以野生型玉米植株作為對 照，按照上述方法進行檢測分析。實驗設3次重復，取平均值。
[0127] 檢測Hpt基因拷貝數的具體方法如下：
[0128] 步驟501、分別取轉入rl核苷酸序列的玉米植株、轉入r2核苷酸序列的玉米植株、 轉入r3核苷酸序列的玉米植株、轉入r4核苷酸序列的玉米植株、轉入r5核苷酸序列的玉米 植株、轉入r6核苷酸序列的玉米植株、轉入r7核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的 葉片各100mg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個樣品取3個重復；
[0129] 步驟502、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA，具體 方法參考其廣品說明書；
[0130] 步驟503、用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)測定上述樣品的基因組DNA濃 度；
[0131] 步驟504、調整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80- 100ng/yL；
[0132] 步驟505、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數，以經過鑒定已知 拷貝數的樣品作為標準品，以野生型玉米植株的樣品作為對照，每個樣品3個重復，取其平 均值;焚光定量PCR引物和探針序列分別是：
[0133] 以下引物和探針用來檢測Hpt核苷酸序列：
[0134] 引物1:CAGGGTGTCACGTTGCAAGA如序列表中SEQIDN0:18所示 ；
[0135] 引物2:CCGCTCGTCTGGCTAAGATC如序列表中SEQIDN0:19所示 ；
[0136] 探針1:TGCCTGAAACCGAACTGCCCGCTG如序列表中SEQIDN0:20所示 ；
[0137] PCR反應體系為：
[0138] Jump Start? Taq ReadyMix? (Sigma) 10μ1 5〇x引物/探針混合物 ΙμΙ
[0139] 基因組 DNA 3μ1 水（ddH20) 6μ1
[0140] 所述50X引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45μ1，100μΜ濃度的探針50μ 1和860μ1 1 ΧΤΕ緩沖液，并且在4°C，貯藏在琥珀試管中。
[0141] PCR反應條件為： 步驟 溫度 時間 511 95"C 5 分鐘
[0142] 512 95 X〕 30 秒 513 60 °C 1 分鐘 514 回到步驟512，重復40次
[0143] 利用SDS2·3軟件(Applied Biosystems)分析數據。
[0144] 通過分析Hpt基因拷貝數的實驗結果，進而證實rl至r7核苷酸序列均己整合到所 檢測的玉米植株的染色體組中，而且轉入rl核苷酸序列的玉米植株、轉入r2核苷酸序列的 玉米植株、轉入r3核苷酸序列的玉米植株、轉入r4核苷酸序列的玉米植株、轉入r5核苷酸序 列的玉米植株、轉入r6核苷酸序列的玉米植株和轉入r7核苷酸序列的玉米植株均獲得了單 拷貝的轉基因玉米植株。
[0145] 第六實施例、鑒定轉基因玉米花絲對褐足角胸葉甲的殺蟲效果
[0146] 將轉入rl核苷酸序列的玉米植株、轉入r2核苷酸序列的玉米植株、轉入r3核苷酸 序列的玉米植株、轉入r4核苷酸序列的玉米植株、轉入r5核苷酸序列的玉米植株、轉入r6核 苷酸序列的玉米植株和轉入r7核苷酸序列的玉米植株的花絲對褐足角胸葉甲幼蟲進行抗 蟲效果檢測。
[0147] 步驟601、選用經taqman鑒定為陽性單拷貝的DBN110017玉米轉化事件(r 1)5個，陽 性單拷貝的DBN110018玉米轉化事件(r2)5個，陽性單拷貝的DBN100999玉米轉化事件(r3)3 個，陽性單拷貝的DBN110000玉米轉化事件(r4) 3個，陽性單拷貝的DBN110013玉米轉化事件 (r5)5個，陽性單拷貝的DBN110016玉米轉化事件(r6)4個，陽性單拷貝的DBN110041玉米轉 化事件(r7) 5個，經taqman鑒定為陰性的玉米轉化事件(NGM1) 3個，每個轉化事件選取3-5個 株系，每一株系選取5棵苗；同時以野生型玉米植株作為對照(CK1);在溫室中種植至抽出雌 穗；
[0148] 步驟602、取步驟601中所述材料，待玉米抽出花絲后，每棵苗上取一小束長約3cm 剛抽出的綠色花絲15根，放入1.5mL離心管中，離心管壁上標記相對應的材料編號；
[0149] 步驟603、每個離心管中放入20頭孵化時間不超過24小時的初孵褐足角胸葉甲幼 蟲，并蓋緊蓋子，離心管蓋上用昆蟲針扎至少一個小孔便于管內透氣；
[0150] 步驟604、將裝有褐足角胸葉甲幼蟲和相應花絲材料的離心管放入離心管盒中，將 離心管盒放入底部鋪有濕紗布的生測盒中并將生測盒放置于黑暗環境下；
[0151] 步驟605、從接蟲第2天開始，每隔一天取出離心管內的幼蟲，并將存活的幼蟲挑入 新準備的裝有相應花絲材料的離心管中，并記錄每管的幼蟲存活數，連續觀察并記錄12天， 每個轉化事件以5個株系為平均水平，每個載體以5個轉化事件為平均存活數水平，實驗結 果如表2所示。
[0152] 表2、玉米轉化事件花絲飼喂褐足角胸葉甲的實驗結果
[0153]
ι_u I」 衣zh'、j大視術衣叨：找乂、r丄f次甘κ/卞，[j h'、j衛但杯/ρμ找乂、rzf次甘κ/卞，[j h'、j衛 植株對褐足角胸葉甲均具有較好的抑制效果(極顯著，P-value分別為0.004和0.008)，10天 時對褐足角胸葉甲的致死率可高達80 %左右;而轉入其它核苷酸序列的玉米植株對褐足角 胸葉甲并未造成顯著致死效果，與對照之間進行單因素方差分析結果如表3所示：
[0155]表3、褐足角胸葉甲在生測后各天的存活率方差分析結果
[0156]
[0157] 表3的結果表明：DBN110017和DBN110018對褐足角胸葉甲的致死效果最顯著，p- value均小于0.01而其它載體對于褐足角胸葉甲的致死效果的p-value未達到0.01的水平； 即轉入rl核苷酸序列的玉米植株和轉入r2核苷酸序列的玉米植株對褐足角胸葉甲的致死 效果最顯著。
[0158] 第七實施例、鑒定轉基因玉米嫩葉對褐足角胸葉甲的殺蟲效果
[0159] 將轉入rl核苷酸序列的玉米植株、轉入r2核苷酸序列的玉米植株、轉入r3核苷酸 序列的玉米植株、轉入r4核苷酸序列的玉米植株、轉入r5核苷酸序列的玉米植株、轉入r6核 苷酸序列的玉米植株和轉入r7核苷酸序列的玉米植株的嫩葉對褐足角胸葉甲成蟲進行抗 蟲效果檢測。
[0160] 步驟701、選用經taqman鑒定為陽性單拷貝的DBN110017玉米轉化事件(r 1) 5個，陽 性單拷貝的DBN110018玉米轉化事件(r2)5個，陽性單拷貝的DBN100999玉米轉化事件(r3)3 個，陽性單拷貝的DBN110000玉米轉化事件(r4)4個，陽性單拷貝的DBN110013玉米轉化事件 (r5)3個，陽性單拷貝的DBN110016玉米轉化事件(r6)5個，經taqman鑒定為陰性的玉米轉化 事件(NGM2) 3個，每個轉化事件選取3-5個株系，每一株系選取5棵苗；同時以野生型玉米植 株作為對照(CK2);在溫室中種植至V3-V5期；
[0161] 步驟702、取步驟701中所述材料，每棵苗上取約10 X 2cm帶有葉脈的玉米葉片一 塊，用濕潤的棉花包住葉片基部約2cm的區域；
[0162] 步驟703、用吸蟲器吸取褐足角胸葉甲成蟲15-20頭，放入生測杯中；
[0163] 步驟704、放置成蟲后，迅速將包好的玉米葉片從生測杯頂部小孔中放入，調整濕 棉花位置至小孔被蓋住，以防止成蟲逃逸，在上述生測杯杯身上粘貼相應材料的標簽；
[0164] 步驟705、每隔一天更換一次葉片，具體為:將原葉片從生測杯頂部小孔中取出，用 紙蓋住小孔以避免成蟲逃逸，輕晃杯身至活蟲飛起，死亡昆蟲會停滯在杯底，記錄每個杯子 中停滯的昆蟲數量，記錄完成后，將替換葉片放入杯中。實驗結果如表4。
[0165] 表4、玉米轉化事件葉片飼喂褐足角胸葉甲的實驗結果
[0166]
[0167] 表4的實驗結果表明：轉入rl核苷酸序列的玉米植株和轉入r2核苷酸序列的玉米 植株對褐足角胸葉甲均具有較好的抑制效果(極顯著，P-value分別為0.02和0.04)，10天時 對褐足角胸葉甲的致死率可高達80 %左右;而轉入其它核苷酸序列的玉米植株對褐足角胸 葉甲并未造成顯著致死效果。
[0168] 綜上所述，本發明首次公開了7個用于控制鞘翅目昆蟲害蟲褐足角胸葉甲的靶標 序列，并利用RNAi技術獲得了轉基因植物，所述轉基因植物是通過導入由褐足角胸葉甲靶 標序列形成的dsRNA序列，來控制褐足角胸葉甲的侵襲，特別是靶標序列1和靶標序列2,高 效且特異，避免褐足角胸葉甲產生抗性，同時環境兼容性好，方便且成本低。
[0169] 最后所應說明的是，以上實施例僅用說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照 較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的 技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1. 一種分離的多核苷酸序列，其特征在于，包括： (a) SEQ ID NO: 1或2所示的多核苷酸序列;或 (b) 在嚴格條件下與(a)限定的多核苷酸序列雜交的多核苷酸序列;或 (c) 與(a)限定的多核苷酸序列具有80%以上同一性的多核苷酸序列;或 (d) (a)限定的多核苷酸序列的至少19個連續核苷酸的多核苷酸序列，其中鞘翅目昆蟲 害蟲攝取包含與所述多核苷酸序列互補的至少一條鏈的雙鏈RNA，抑制所述鞘翅目昆蟲害 蟲的生長;或 (e) 上述(a)、（b)、（c)或(d)限定的多核苷酸序列的互補序列。2. 根據權利要求1所述多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列還包括權利要求 1所述多核苷酸序列的互補序列。3. 根據權利要求1或2所述多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列還包括間隔 序列。4. 根據權利要求3所述多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列為SEQ ID N0:3 或SEQ ID NO:4。5. -種表達盒，其特征在于，包含在有效連接的調控序列調控下的權利要求1-4任一項 所述多核苷酸序列。6. -種包含權利要求1-4任一項所述多核苷酸序列或權利要求5所述表達盒的重組載 體。7. -種權利要求1-4任一項所述多核苷酸序列用于干擾鞘翅目昆蟲害蟲靶標序列表達 或抑制鞘翅目昆蟲害蟲生長的用途。8. -種干擾核糖核酸序列，其特征在于，所述干擾核糖核酸序列在被鞘翅目昆蟲害蟲 攝入后起到下調所述鞘翅目昆蟲害蟲中至少一種靶標序列表達的作用，其中所述干擾核糖 核酸序列包含至少一個沉默元件，其中所述沉默元件是包含退火的互補鏈的一個雙鏈RNA 區域，其中一條鏈包含與所述靶標序列內的一個靶標片段至少部分地互補的一個核苷酸序 列或由其組成，所述靶標序列包含權利要求1所述多核苷酸序列。9. 根據權利要求8所述干擾核糖核酸序列，其特征在于，所述沉默元件包含與所述靶標 序列內的一個靶標片段互補至少部分地互補的一個至少19個連續核苷酸的序列或由其組 成。10. 根據權利要求8或9所述干擾核糖核酸序列，其特征在于，所述干擾核糖核酸序列包 含至少兩個沉默元件，每一個所述沉默元件包含與所述靶標序列內的一個靶標片段至少部 分地互補的一個核苷酸序列或由其組成。11. 根據權利要求10所述干擾核糖核酸序列，其特征在于，所述沉默元件各自包含與一 個不同的靶標片段互補的一個不同的核苷酸序列或由其組成。12. 根據權利要求11所述干擾核糖核酸序列，其特征在于，所述不同的靶標片段來源于 單一靶標序列或來源于不同的靶標序列。13. 根據權利要求12所述干擾核糖核酸序列，其特征在于，所述不同的靶標序列來源于 相同的鞘翅目昆蟲害蟲或不同的鞘翅目昆蟲害蟲。14. 根據權利要求13所述干擾核糖核酸序列，其特征在于，所述鞘翅目昆蟲害蟲為褐足 角胸葉甲。15. 根據權利要求8-14任一項所述干擾核糖核酸序列，其特征在于，所述干擾核糖核酸 序列還包括間隔序列。16. 根據權利要求15所述干擾核糖核酸序列，其特征在于，所述干擾核糖核酸序列為 SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4。17. -種控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的組合物，其特征在于，包含至少一種權利要求8-16 任一項所述干擾核糖核酸序列和至少一種合適的載體、賦形劑或稀釋劑。18. 根據權利要求17所述控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的組合物，其特征在于，所述組合物 包含一種表達或能夠表達所述干擾核糖核酸序列的宿主細胞。19. 根據權利要求18所述控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的組合物，其特征在于，所述宿主細 胞是細菌細胞。20. 根據權利要求17-19任一項所述控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的組合物，其特征在于， 所述組合物是固體、液體或凝膠。21. 根據權利要求20所述控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的組合物，其特征在于，所述組合物 是殺蟲噴霧劑。22. 根據權利要求17-21任一項所述控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的組合物，其特征在于， 所述組合物還包含至少一種殺蟲劑，所述殺蟲劑為化學殺蟲劑、馬鈴薯塊莖特異蛋白、蘇云 金芽孢桿菌殺蟲蛋白、致病桿菌殺蟲蛋白、光桿狀菌殺蟲蛋白、側孢芽孢桿菌殺蟲蛋白或球 形芽孢桿菌殺蟲蛋白。23. -種權利要求17-22任一項所述控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的組合物用于預防和/或 控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的用途。24. -種控制鞘翅目昆蟲害蟲侵襲的方法，其特征在于，包括使鞘翅目昆蟲害蟲與有效 量的至少一種權利要求8-16任一項所述干擾核糖核酸序列接觸。25. -種產生控制鞘翅目昆蟲害蟲的植物的方法，其特征在于，包括將權利要求1-4任 一項所述多核苷酸序列或權利要求5所述表達盒或權利要求6所述重組載體導入植物。26. -種用于保護植物免受由鞘翅目昆蟲害蟲引起的損傷的方法，其特征在于，包括將 權利要求1-4任一項所述多核苷酸序列或權利要求5所述表達盒或權利要求6所述重組載體 導入植物，導入后的植物在被鞘翅目昆蟲害蟲攝食后起到抑制所述鞘翅目昆蟲害蟲的生長 的作用。27. 根據權利要求25或26所述方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、谷子、高粱或 香蕉。28. 根據權利要求25-27任一項所述方法，其特征在于，所述鞘翅目昆蟲害蟲為褐足角 胸葉甲。29. -種蛋白質，其特征在于，包括： (a) 具有SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列組成的蛋白質;或 (b) 在(a)中的氨基酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有控 制鞘翅目昆蟲害蟲生長活性的由（a)衍生的蛋白質。30. -種基因，其特征在于，包括： (a) 編碼權利要求1所述蛋白質的核苷酸序列;或 (b) 在嚴格條件下與（a)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有控制鞘翅目昆蟲害蟲生長 活性的蛋白質的核苷酸序列;或 (C)如SEQ ID N0:22所示的核苷酸序列。31. -種表達盒，其特征在于，包含在有效連接的調控序列調控下的權利要求30所述控 制鞘翅目昆蟲害蟲生長的基因。32. -種包含權利要求30所述控制鞘翅目昆蟲害蟲生長的基因或權利要求31所述表達 盒的DNA構建體。33. -種包含權利要求32所述DNA構建體的重組載體。
【文檔編號】A01H5/00GK105838727SQ201610185073
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月29日
【發明人】張欣馨, 楊淑靖, 張愛紅
【申請人】北京大北農科技集團股份有限公司, 北京大北農生物技術有限公司