一種褐飛虱基因NlABCB及其編碼產物與應用
【專利摘要】本發明公開了一種褐飛虱基因NlABCB及其編碼產物與應用，該基因NlABCB具有SEQIDNo.1的DNA序列。該序列由1468個核苷酸堿基組成，包含一個由459個核苷酸構成的完整的編碼框，編碼153個氨基酸殘基的小分子量蛋白。研究發現該基因與褐飛虱的消化取食、存活有關。構建L4440?NlABCB的dsRNA載體，轉化E.coli HT115后，經IPTG誘導，形成NlABCB?dsRNA,喂養褐飛虱取食含NlABCB?dsRNA人工飼料，發現褐飛虱的存活率明顯降低。本發明將在作物育種，生物農藥和轉基因動物培養中得到廣泛應用。
【專利說明】
一種褐飛虱基因 NIABCB及其編碼產物與應用
技術領域
[0001]本發明涉及生物技術領域，特別地，涉及一種褐飛虱基因 N1ABCB及其編碼產物與 應用。
【背景技術】
[0002] 水稻(Oryza sativa)是世界的主要糧食作物之一，全球超過一半人口都以水稻作 為主食。專家估計到了 2025年，世界水稻的產量要比現在增長60%才能夠滿足需要。我國是 水稻生產大國，水稻常年種植面積約3000萬公頃，占世界水稻種植總面積的1/4。因此，水稻 的種植安全與與我國經濟發展和人民生活密不可分。
[0003] 褐飛虱（Ni 1 apar vata 1 ugens Stil，BPH)屬同翅目飛虱科（Homop t era : Delphacidae)昆蟲，又稱褐稻虱。褐飛虱主要通過吸取水稻韌皮部的汁液，最先受到傷害是 水稻的葉鞘組織，同時會引起葉片枯黃，分蘗枯萎，所以營養物質的運輸受到阻斷，同時導 致水稻受到一系列的生理方面的影響，包括植株的發育，水稻的產量等。被害稻田常先在田 中間出現"黃塘"，后出現"冒穿"或"虱燒"，嚴重時造成大幅度減產甚至顆粒無收。褐飛虱取 食、產卵，造成大量傷口，有利于病菌侵入，會加重紋枯病和小球菌核病發生和危害。水稻的 傷口大時，稻株因體內汁液大量喪失而枯黃，飛虱在葉片或穗子上排出大量蜜露，還會影響 水稻光合作用，滋生霉菌，引起稻粒霉爛。當大量褐飛虱取食水稻時，水稻的生長發育受到 巨大影響，導致植株矮小；到了后期就會形成半枯穗，導致整個植株枯萎傾倒。同時褐飛虱 在取食韌皮部的同時，會作為傳播紋枯病和矮桿病毒的載體，如果此時晚稻處在孕穗到蠟 熟的階段，那么由于褐飛虱危害所造成的損失將會十分慘重。
[0004] RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指外源或內源的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)特異性地引起基因表達沉默的現象。高濃度的dsRNA才能保證靶標基因的連續 抑制，那么利用體外合成的dsRNA來喂養昆蟲成本相對昂貴。HT115菌株是RNaselll缺失體， RNaselll能降解細菌中絕大多數的dsRNA，那么利用基因工程菌大腸桿菌HT115表達dsRNA 是一個非常經濟的方法產生大量的dsRNA。除此而外，細菌喂養也是一種非中斷技術保持處 理動物的一致性。Timmons等是最早利用HT115生產的dsRNA喂食線蟲使其體內的革E1標基因 抑制表達。利用大腸桿菌表達dsRNA已在昆蟲桔小實繩(Bactrocera dorsalis)，甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua)中得以實現。因此，至今為止，國內外尚沒有克隆到褐飛虱的相關靶 標基因，可以通過人工喂養dsRNA沉默該基因而達到控制褐飛虱的目的。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種褐飛虱基因 N1ABCB及其編碼產 物與應用。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：
[0007] 一種褐飛虱基因 N1ABCB，它具有SEQ ID No.l的DNA序列。
[0008] 一種所述基因 N1ABCB的編碼蛋白，它包含SEQ ID No.2的氨基酸序列的蛋白質，或 者是將SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或者添加 且具有與SEQ ID No.2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白質。
[0009] 一種所述褐飛虱基因 N1ABCB在人工喂養中的應用。
[0010] 一種所述褐飛虱基因 N1ABCB在作物育種中的應用。
[0011] 一種所述褐飛虱基因 N1ABCB在轉基因動物培養中的應用。
[0012] 一種所述褐飛虱基因 N1ABCB在生物農藥中的應用。
[0013] 本發明的有益效果是，通過對褐飛虱中腸轉錄組分析，并結合褐飛虱基因組數據 庫獲得了N1ABCB基因全長；構建L4440-N1ABCB的dsRNA載體，轉化E. co 1 i HT115后，經IPTG 誘導，形成NIABCB-dsRNA，喂養褐飛虱取食含NIABCB-dsRNA的人工飼料，分析N1ABCB基因在 RNAi沉默后，褐飛虱中N1ABCB mRNA的表達水平及相應死亡率。該基因的分離克隆，對于作 物的抗蟲育種，轉基因褐飛虱動物培養，尤其對水稻的生物防治如生物農藥的生產中將起 到重要的促進作用。
【附圖說明】
[0014] 圖l是RACE獲得的褐飛虱NlABCB基因電泳圖，圖中M為DL2000 DNAMarker，l-2泳 道為N1ABCB基因的5 ' cDNA片段和3 ' cDNA片段。
[0015] 圖2是L4440載體圖。
[0016] 圖3是L4440-NlABCB-dsRNA的電泳圖，圖中Μ為Markerlll，1-2泳道為L4440和 L4440-NlABCB-dsRNA。
[0017] 圖4是是褐飛虱取食NIABCB-dsRNA后對其mRNA表達水平的抑制作用柱狀圖。
[0018] 圖5是褐飛虱取食NIABCB-dsRNA后對其存活率的影響圖。
【具體實施方式】
[0019] 本發明通過構建褐飛虱中腸轉錄組文庫進行高通量測序的方法獲得轉錄組數據， 在此基礎上獲得N1ABCB基因片段，以該基因序列為模板設計RACE引物。以提取的總RNA為模 板，使用RACE試劑盒分別合成5'和3'RACE cDNA。獲得N1ABCB CDS全長序列并連接到pMD19- T克隆載體，轉化入大腸桿菌感受態細胞(ToplO)，搖菌，測序。隨后在N1ABCB CDS序列中選 取450bp長度的片段設計合成L4440-N1ABCB，轉化E.coli HT115后，經IPTG誘導，形成 NIABCB-dsRNA，喂養褐飛虱取食含NIABCB-dsRNA的人工飼料，并用人工喂養對目的基因進 行RNAi，檢測其對目的基因 mRNA表達水平抑制效果及對褐飛虱死亡率的影響。對該基因的 分離和克隆以及生物學功能的分析，對于轉基因褐飛虱動物培養，水稻抗褐飛虱育種，以及 對采用生物農藥抗蟲起到重要的促進作用。
[0020] 實現本發明的具體技術步驟如下：
[0021] 1、N1ABCB基因的分離和序列分析
[0022]利用對褐飛虱中腸轉錄組測序的方法，獲得表達基因數據庫，并篩選到N1ABCB基 因。測序分析發現此轉錄組序列并沒有覆蓋該基因的完整編碼區。為了獲得該片段的完整 編碼區序列，我們比對褐飛虱基因組數據庫初步得到N1ABCB基因序列。以提取的總RNA為模 板，使用RACE試劑盒分別合成5'和3'RACE cDNA。獲得N1ABCB CDS全長序列并連接到pMD19- T克隆載體，轉化入大腸桿菌感受態細胞(ToplO)，搖菌，挑取4個克隆送北京擎科公司測序， 每個分別測2次。測序結果，用NCBI Blast(http://www.ncbi .nlm.nih. gov/BLAST/)進行序 列比對分析。獲得N1ABCB基因 DNA序列，見序列表SEQ ID No.l表示的序列和褐飛虱N1ABCB 基因電泳圖1。根據該序列的開放閱讀框(0RF)，推算出該基因編碼蛋白的氨基酸序列，如 SEQ ID No. 2所示。該序列由1468個核苷酸堿基組成，包含一個由459個核苷酸構成的完整 的編碼框，編碼153個氨基酸殘基的小分子量蛋白。
[0023] 2、褐飛虱L4440-NlABCB-dsRNA的表達及其RNAi效果
[0024]以褐飛虱cDNA為模板，擴增褐飛虱N1ABCB基因片段。由于L4440載體（圖2)包含兩 個相向排列的T7啟動子，經IPTG誘導，分別轉錄出（+ )和(-)ssRNA，然后形成dsRNAAlABCB 基因雙酶切連入L4440載體后，轉入菌株HT115后，便可表達dsRNA(圖3)。分別讓褐飛虱取食 NIABCB-dsRNA進行RNAi。首先檢測褐飛虱取食dsRNA后，對其體內N1ABCB mRNA表達水平的 影響。結果發現:褐飛虱取食dsRNA后，第二天抑制了25%，第四天抑制達到48%。因此，褐飛 虱人工喂養取食dsRNA的方法的確可以誘導靶基因 RNAi，使靶基因表達被持續抑制，效果顯 著（圖4)。同時，褐飛虱取食dsRNA后，檢測N1ABCB基因沉默后對其的致死效果，結果發現:對 照組和試驗組1天、2天、3天、4天的存活率分別為88.77 %和86.67%、76.9 %和70.78%、 65.75 %和55.67 %、56.72 %和46.69 %。取食NIABCB-dsRNA后，其存活率顯著低于對照組。 因此N1ABCB基因可以進一步應用于褐飛虱抗蟲（圖5)。
[0025]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明范圍。
[0026] 實施例1 :N1ABCB基因的獲得和序列分析
[0027] 1)使用總RNA提取試劑盒RNAiso P1 us提取褐飛虱總RNA。以提取的總RNA為模板， 使用RACE試劑盒分別合成5'和3'RACE cDNA。
[0028] 2)0uter PCR反應程序為：94°C預變性3min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸 2min，20個循環后72°C再延伸1 Omin。Inner PCR反應程序與以上程序一樣，只是改為30個循 環。
[0029] 3)PCR產物通過克隆入Takara公司pMD19-T載體獲得pMD19-NlABCB載體，轉入 ToplO大腸桿菌，將含PMD19-N1ABCB載體的ToplO菌液送北京擎科公司測序。用NCBI Blast (http: //www· ncbi · nlm· nih · gov/BLAST/)進行序列比對分析，獲得序列表中的序列SEQ ID No.l。將此cDNA的基因命名為N1ABCB。
[0030] 實施例2:褐飛虱L4440-NlABCB-dsRNA的表達及其RNAi效果
[0031] 第一步:褐飛虱L4440-N1ABCB原核表達載體
[0032] 1)片段的擴增
[0033] 挑選高表達N1ABCB序列設計引物，上游引物加入Nco I位點，上游引物加入Sma I 位點。以褐飛虱cDNA為模板進行目的基因擴增，利用高保真酶K0D PLUS在25yL反應體系中 進行擴增。反應條件如下：94°C預變性2min，然后以28個循環進行PCR擴增(94°C 15s，55°C 30s，68°C 30s)擴增產物用PCR純化試劑盒(碧云天，中國）純化后，利用普通Taq進行加 A反 應，連接轉化及陽性克隆鑒定，將測序正確的片段質粒用Nco I和Sma I雙酶切后，切膠純化 回收，放入4 °C備用。
[0034] 2)表達載體L4440雙酶切
[0035]將L4440質粒轉化E.coli HT115菌株后劃線培養(含氨芐和四環素 LB固體培養基） 過夜，挑取單菌落于含氨芐和四環素 LB液體培養基37° 200rpm振蕩培養過夜，提取質粒，Nco I和Sma I雙酶切切膠純化回收。
[0036] 3)褐飛虱N1ABCB片段和表達載體L4440的連接反應體系：雙酶切線性L4440質粒，5 Μ1;雙酶切N1ABCB片段，3yL; 10 X連接緩沖液，1.2yL; T4DNA連接酶，lyL;雙蒸水，1.8yL; 4° 連接過夜。
[0037] 4)連接產物轉化E.coli HT115(DE3)
[0038] 第二步:原核表達褐飛虱L4440-NlABCB-dsRNA和dsRNA的提取。
[0039] 1) dsRNA的誘導
[0040]取鑒定為E.coli HT115(DE3)陽性克隆的菌種于含氨芐和四環素的LB固體平板劃 線，挑取單菌落于(含lOOyg/mL Amp、50yg/mL Tet)50ml LB液體培養基中，37°200rpm振蕩 培養過夜。次日按1:100體積取lml至含同樣抗生素的100ml LB液體培養基繼續培養2小時， 加入100yL的IPTG(終濃度為lmmol/L)誘導3h后，用Trizol法提取dsRNA。
[0041 ] 2) dsRNA 的提取
[0042] 各取lmL培養的菌液，4°C，8000離心力離心5min，棄上清。然后加入lml TRIZ0L試 劑，旋禍劇烈振蕩lmin將菌體溶解，室溫下靜置5min。隨之加入200yL氯仿，用力振蕩20sec， 室溫孵育l〇min，4°C，8000離心力離心15min。將上清轉移到一個新的Eppendorf管中。加入 500yL異丙醇，混合均勻，置于-20°放置30分鐘。4°C，8000離心力離心15min。棄上清，溶液中 加入500μ1 70%的乙醇沖洗沉淀3次(RNase Free dH20配制），4°C，8000離心力離心5min， 棄上清，室溫干燥。干燥RNA 5min，沉淀溶于30yL含10mmol/L Tris(pH = 7.5)，lmmol/L EDTA(TE)緩沖液中。
[0043] 第三步:人工喂養htL N1ABCB對褐飛虱N1ABCB mRNA表達及死亡率的影響
[0044] 將按上述誘導表達好的L4440-NlABCB-dsRNA的大腸桿菌htLNIABCB，在室溫條件 下富集菌體，按照250:1的比例添加 ddH20溶解富集的菌體，充分混勻。
[0045]挑選大小一致的褐飛虱三齡幼蟲，放入直徑3cm離心管中，人工飼料用雙層封口膜 包住，離心管用黑布遮住，褐飛虱因趨光性到管口取食人工飼料，每l〇〇ul人工飼料添加 20ul菌液。每組挑選10頭，設置無菌液為對照，每天定時更換飼料和菌液，喂養4天，提取總 RNA，定量分析mRNA的表達水平，同時統計存活率。
[0046]
【主權項】
1. 一種褐飛虱基因 N1ABCB，其特征在于，它具有SEQ ID No.l的DNA序列。2. -種權利要求1所述褐飛虱基因 N1ABCB的編碼蛋白，其特征在于，它包含SEQ ID No. 2的氨基酸序列的蛋白質，或者是將SEQ ID No. 2的氨基酸殘基序列經過一個或多個 氨基酸殘基的取代、缺失或者添加且具有與SEQ ID No.2的氨基酸殘基序列相同活性的由 SEQ ID No.2衍生的蛋白質。3. -種權利要求1所述褐飛虱基因 N1ABCB在人工喂養中的應用。4. 一種權利要求1所述褐飛虱基因 N1ABCB在作物育種中的應用。5. -種權利要求1所述褐飛虱基因 N1ABCB在轉基因動物培養中的應用。6. -種權利要求1所述褐飛虱基因 N1ABCB在生物農藥中的應用。
【文檔編號】C07K14/435GK105838721SQ201610227151
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月13日
【發明人】游艾青, 閘雯俊, 周雷, 李三和, 楊國才, 陳志軍, 劉凱, 徐華山, 李培德
【申請人】湖北省農業科學院糧食作物研究所