Ptprq基因突變體及其應用

Ptprq基因突變體及其應用
【專利摘要】本發明公開了PTPRQ基因突變體及其應用，具體涉及分離的編碼PTPRQ突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的方法，篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的系統，以及用于篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的試劑盒。其中，該分離的編碼PTPRQ突變體的核酸，與SEQ ID NO：1相比，具有c.3125A>G突變，或者c.5981A>G突變。通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患常染色體隱性非綜合型耳聾。
【專利說明】
PTPRQ基因突變體及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及PTPRQ基因突變體及其應用。具體地，本發明涉及分離編碼PTPRQ突 變體的核酸、分離的多肽、篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的系統、用于篩 選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的試劑盒、構建體、重組細胞以及構建藥物 篩選模型的方法。
【背景技術】
[0002] 耳聾（hearing loss ;deafness)是一類聽覺功能障礙性疾病的統稱。在世界范圍 內，耳聾是一種常見病、多發病。該病可由聽覺系統的傳音或感音功能障礙所致，也可能為 聽覺傳導通路中的聽神經或各級中樞發生病變所引起。其病因極其復雜多樣，諸如遺傳、感 染、外傷、藥物應用不當、免疫性疾病、生理機能退化、噪聲、化學物質中毒及心理因素等等 均可導致耳聾，其中遺傳因素占主導作用。調查顯示，在新生兒中先天性耳聾患者的發病率 約為1%。，其中多半與遺傳因素有關，這部分耳聾被稱作遺傳性耳聾（hereditary hearing loss，HHL)，是由染色體或基因功能異常而導致的耳聾。
[0003] 依據是否伴隨其他組織或器官的癥狀，可將遺傳性耳聾分為非綜合征型遺傳性 耳聾（nonsyndromic hereditary hearing loss，NSHHL)和綜合征型耳聾（syndromic hereditary hearing loss, SHHL)〇
[0004] 非綜合征型耳聾是指耳聾為發病個體唯一的癥狀，無其它遺傳損害性器官功能 障礙，在遺傳性耳聾中占70%左右。依據遺傳方式的不同，通常將其分為常染色體顯性 (autosomal dominant，DFNA)、常染色體隱性（autosomal recessive，DFNB)、性染色體連鎖 (sex-linked)及線粒體遺傳性（mitochondrial ;maternally inherited)耳聾。
[0005] 非綜合征型耳聾的分類中，常染色體隱性遺傳性耳聾約占75~85%，其中全球約 50%的患者都是由于GJB2基因突變致病的，屬于DFNB1亞型；剩余50%患者的耳聾是由其 他基因變異引發，這些基因中大部分只能解釋1~2個耳聾家系的發病。常染色體隱性遺 傳性耳聾的父母，每次生育，都有25%的概率生出一個患有耳聾的孩子，50%的概率生出攜 帶有耳聾致病位點的孩子，25 %的概率生出一個正常孩子。因此，一個耳聾家系中正常個體 是攜帶者的概率為2/3。
[0006] 目前，仍有但是仍有許多常染色體隱性非綜合型耳聾患者病因未明，因而，對常染 色體隱性非綜合型耳聾尤其是其致病基因的研究仍有待深入。

【發明內容】

[0007] 本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的 在于提出一種能夠有效篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的手段。
[0008] 本發明是基于發明人的下列工作完成的：
[0009] 發明人發現，目前的致病基因和致病突變挖掘的研究中，多使用全外顯子組測序 法。全外顯子組測序是是指利用序列捕獲技術將全基因組外顯子區域DNA捕捉并富集后進 行高通量測序的基因組分析方法，相對于基因組重測序成本較低，對研究已知基因的SNP、 Indel等具有較大的優勢，在致病新基因的發現研究中同樣發揮著重要作用。利用外顯子組 測序找出孟德爾遺傳病致病基因的案例很多，比如Sarah等人在2009年利用外顯子組測序 成功定位出mile綜合癥的基因 DHODH，找到米勒綜合癥的一個致病突變，這也是外顯子組 測序的首次成功應用；我國Wang等人利用外顯子組測序發現了小腦共濟失調的新的突變 基因 TGM6。外顯子測序技術是當前的熱點技術，極大地推動了疾病研究的進展。本發明針 對感音神經性耳聾的基因研究不明確、耳聾相關基因多、家系規模小等特點，外顯子組測序 技術是最有效的尋找致病基因的方法。
[0010] 因而，發明人針對自行收集的一個常染色體隱性非綜合型耳聾（ARNSHL，也稱"常 染色體隱性非綜合型聽力缺失"）患者家系，通過外顯子組測序、連鎖分析聯合Sanger測 序驗證的方法進行致病突變挖掘和驗證，最終確定了常染色體隱性非綜合型耳聾的2個 新的致病突變位點--PTPRQ基因的c. 3125A>G突變和c. 5981A>G突變，且c. 3125A>G和 c. 5981A>G的復合雜合突變導致常染色體隱性非綜合型耳聾的發生。
[0011] 進而，根據本發明的第一方面，本發明提出了一種分離的編碼PTPRQ突變體的 核酸。根據本發明的實施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有c. 3125A>G突變，或者 c. 5981A>G突變。根據本發明的實施例，發明人確定了 PTPRQ基因的突變體，這些新突變體 與常染色體隱性非綜合型耳聾的發病密切相關，從而通過檢測這些突變體在生物樣品中是 否同時存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患常染色體隱性非綜合型耳聾。
[0012] 根據本發明的第二方面，本發明提出了一種分離的多肽。根據本發明的實施例，與 SEQ ID N0:2相比，所述分離的多肽具有P.D1042G突變，或者P.E1994G突變。通過檢測生 物樣品中是否同時表達上述多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易患常染色體隱性非綜合 型耳聾。
[0013] 根據本發明的第三方面，本發明提出了一種篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾 的生物樣品的系統。根據本發明的實施例，該系統包括：核酸提取裝置，所述核酸提取裝置 用于從所述生物樣品提取核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核 酸提取裝置相連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；判斷 裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核酸序列或 其互補序列，與SEQ ID N0:1相比，是否具有c. 3125A>G和c. 5981A>G的復合雜合突變，判 斷所述生物樣品是否易患常染色體隱性非綜合型耳聾。利用該系統，能夠有效地篩選易患 常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品。
[0014] 根據本發明的第四方面，本發明提出了一種用于篩選易患常染色體隱性非綜合型 耳聾的生物樣品的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒含有：適于檢測與SEQ ID N0 :1 相比具有c. 3125A>G突變的PTPRQ基因突變體，以及與SEQ ID N0:1相比具有c. 5981A>G 突變的PTPRQ基因突變體的試劑。利用根據本發明的實施例的試劑盒，能夠有效地篩選易 患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品。
[0015] 根據本發明的第五方面，本發明還提出了一種構建體。根據本發明的實施例，該構 建體包含前面所述的分離的編碼PTPRQ突變體的核酸。需要說明的是，"構建體包含前面所 述的分離的編碼PTPRQ突變體的核酸"表示，本發明的構建體包含與SEQ ID NO : 1相比具 有c. 1229delT突變的PTPRQ基因突變體的核酸序列，或者包含與SEQ ID N0 :1相比具有 c. 5840C>G突變的PTPRQ基因突變體的核酸序列，或者同時包含上述兩種PTPRQ基因突變體 的核酸序列。由此，利用本發明的構建體轉化受體細胞獲得的重組細胞，能夠有效地用于篩 選治療常染色體隱性非綜合型耳聾的藥物。
[0016] 根據本發明的第六方面，本發明還提出了一種重組細胞。根據本發明的實施例，該 重組細胞是通過前面所述的構建體轉化受體細胞而獲得的。根據本發明的一些實施例，利 用本發明的重組細胞，能夠有效地篩選治療常染色體隱性非綜合型耳聾的藥物。
[0017] 根據本發明的第七方面，本發明還提出了一種構建藥物篩選模型的方法。根據本 發明的實施例，該方法包括：使動物的至少一部分細胞同時表達與SEQ ID N0 :1相比具有 c. 3125A>G突變的核酸，以及與SEQ ID N0:1相比具有c. 5981A>G突變的核酸。由此，利用 本發明的藥物篩選模型，能夠有效地篩選治療常染色體隱性非綜合型耳聾的藥物。
[0018] 需要說明的是，本發明發現的常染色體隱性非綜合型耳聾致病基因 PTPRQ的兩個 新的致病位點，該突變位點可以用于早期篩查常染色體隱性非綜合型耳聾致病突變攜帶 者，進而在攜帶者發病之前進行早期干預治療；也可用于常染色體隱性非綜合型耳聾患者 的分子診斷及與相關疾病的的鑒別診斷，并且快速、準確、高效、簡便、早期診斷率高，檢測 結果可以為常染色體隱性非綜合型耳聾的早期診斷、鑒別診斷及開發常染色體隱性非綜合 型耳聾治療藥物提供科學依據。
[0019] 本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0020] 本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中：
[0021] 圖1顯示了根據本發明實施例的篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣 品的系統及其組成部分的示意圖，其中，
[0022] 圖II為根據本發明實施例的篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的 系統的不意圖，
[0023] 圖III為根據本發明實施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0024] 圖1III為根據本發明實施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0025] 圖2顯示了根據本發明的一個實施例的ARNSHL患者家系的家系圖；
[0026] 圖3顯示了根據本發明的一個實施例，圖2所示ARNSHL患者家系中兩個患者的純 音測聽結果；以及
[0027] 圖4顯示了根據本發明的一個實施例，圖2所示ARNSHL患者家系中所有家系成員 的PTPRQ基因 c. 3125A>G、c. 5981A>G突變位點的代表性Sanger測序驗證峰圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面詳細描述本發明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅 用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0029] PTPRQ基因突變體
[0030] 需要說明的是，本發明利用全外顯子測序技術對一個常染色體隱性非綜合型聽力 缺失（ARNSHL)家系中的4個樣本（兩個患病兩個正常）進行測序，同時利用328隨機選取 的家系外正常人作為對照對變異進行擴展分析。分析發現，在328個正常對照樣本中，僅 有2個樣本具有c. 3125A>G突變，而c. 5981A>G突變在這些樣本中均不存在。由此可證實 PTPRQ基因突變可以導致常染色體隱性耳聾：PTPRQ c. 3125A>G p.D1042G(母親的等位基 因）和c. 5981A>G p. E1994G(父親的等位基因）復合雜合突變是引起常染色體隱性非綜合 型耳聾（ARNSHL)的突變。
[0031] 因而，根據本發明的第一方面，本發明提出了一種分離的編碼PTPRQ突變體的 核酸。根據本發明的實施例，與SEQ ID N0:1相比，所述核酸具有c. 3125A>G突變，或者 c. 5981A>G突變。在本文中所使用的表達方式"編碼PTPRQ突變體的核酸"，是指與編碼 PTPRQ突變體的基因相對應的核酸物質，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與 PTPRQ突變體的編碼基因相對應的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不 限于DNA、RNA或cDNA。根據本發明的一個具體示例，前面所述的編碼PTPRQ突變體的核 酸為DNA。根據本發明的實施例，發明人確定了 PTPRQ基因的新突變體，這些突變體與常染 色體隱性非綜合型耳聾的發病密切相關，從而通過檢測上述突變體在生物樣品中是否同時 存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患常染色體隱性非綜合型耳聾，也可以通過檢測這 些突變體在生物體中是否同時存在，有效地預測生物體是否易患常染色體隱性非綜合型耳 聾。
[0032] 對于本發明說明書和權利要求書中，提及核酸，本領域技術人員應當理解，實際包 括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權利要求書中，雖然多數情況 下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如，提及SEQ ID N0 :1，實際 包括其互補序列。本領域技術人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之亦然。
[0033] 這些編碼PTPRQ突變體的核酸，是本申請的發明人通過外顯子組測序、連鎖分析 聯合Sanger測序驗證的方法確定的常染色體隱性非綜合型耳聾的致病基因 PTPRQ的新的 致病突變。這些致病突變位點在現有技術中并未被提到。
[0034] 其中，野生型PTPRQ基因的cDNA具有如下所示的核苷酸序列（使用的是RefSeq 的轉錄本，編號為ΝΜ_〇〇1145026·1):
[0035] ATGGATTTTCTTATCATTTTTCTTTTACTTTTTATTGGGACTTCAGAGACACAGGTTGATGTTTCCAAT GTCGTTCCTGGTACTAGGTACGATATAACCATCTCTTCAATTTCTACAACATACACCTCACCTGTTACTAGAATAGT GACAACAAATGTAACAAAACCAGGGCCTCCAGTCTTCCTAGCCGGGGAAAGAGTCGGATCTGCTGGGATTCTTCTGT CTTGGAATACACCACCTAATCCAAATGGAAGGATTATATCTTACATTGTCAAATATAAGGAAGTTTGTCCGTGGATG CAAACAGTATATACACAAGTCAGATCAAAGCCAGACAGTCTGGAAGTTCTTCTTACTAATCTTAATCCTGGAACAAC ATATGAAATTAAGGTTGCTGCTGAAAACAGTGCTGGCATTGGAGTGTTTAGTGATCCATTTCTCTTCCAAACTGCAG AAAGTGCTCCAGGAAAAGTGGTGAATCTCACAGTTGAGGCCTACAACGCTTCAGCAGTTAAGCTGATTTGGTATTTA CCTCGGCAACCAAATGGCAAAATTACCAGCTTCAAGATTAGTGTCAAGCATGCCAGAAGTGGGATAGTAGTGAAAGA TGTCTCAATCAGAGTAGAGGACATTTTGACTGGGAAATTGCCAGAATGCAATGAGAATAGTGAATCTTTTTTATGGA GTACAGCCAGCCCTTCTCCAACCCTTGGTAGAGTTACACCTCCATCGCGTACCACACATTCATCAAGCACGTTGACA CAGAATGAGATCAGCTCTGTGTGGAAAGAGCCTATCAGTTTTGTAGTGACACACTTGAGACCTTATACAACATATCT TTTTGAAGTTTCAGCTGCTACAACTGAAGCAGGTTATATTGATAGTACGATTGTCAGAACACCAGAATCAGTGCCTG 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[0036] MDFLIIFLLLFIGTSETQVDVSNVVPGTRYDITISSISTTYTSPVTRIVTTNVTKPGPPVFLAGERVGS AGILLSWNTPPNPNGRIISYIVKYKEVCPWMQTVYTQVRSKPDSLEVLLTNLNPGTTYEIKVAAENSAGIGVFSDPF LFQTAESAPGKVVNLTVEAYNASAVKLIWYLPRQPNGKITSFKISVKHARSGIVVKDVSIRVEDILTGKLPECNENS ESFLWSTASPSPTLGRVTPPSRTTHSSSTLTQNEISSVWKEPISFVVTHLRPYTTYLFEVSAATTEAGYIDSTIVRT PESVPEGPPQNCVTGNITGKSFSILffDPPTIVTGKFSYRVELYGPSGRILDNSTKDLKFAFTNLTPFTMYDVYIAAE TSAGTGPKSNISVFTPPDVPGAVFDLQLAEVESTQVRITWKKPRQPNGIINQYRVKVLVPETGIILENTLLTGNNEY INDPMAPEIVNIVEPMVGLYEGSAEMSSDLHSLATFIYNSHPDKNFPARNRAEDQTSPVVTTRNQYITDIAAEQLSY VIRRLVPFTEHMISVSAFTIMGEGPPTVLSVRTRQQVPSSIKIINYKNISSSSILLYWDPPEYPNGKITHYTIYAME LDTNRAFQITTIDNSFLITGLKKYTKYKMRVAASTHVGESSLSEENDIFVRTSEDEPESSPQDVEVIDVTADEIRLK WSPPEKPNGIIIAYEVLYKNIDTLYMKNTSTTDIILRNLRPHTLYNISVRSYTRFGHGNQVSSLLSVRTSETVPDSA PENITYKNISSGEIELSFLPPSSPNGIIQKYTIYLKRSNGNEERTINTTSLTQNIKVLKKYTQYIIEVSASTLKGEG VRSAPISILTEEDAPDSPPQDFSVKQLSGVTVKLSffQPPLEPNG11LYYTVYVWNRSSLKTINVTET SLELSDLDYN VEYSAYVTASTRF⑶GKTRSNIISFQTPEGAPSDPPKDVYYANLSSSSIILFWTPPSKPNGIIQYYSVYYRNTSGTF MQNFTLHEVTNDFDNMTVSTIIDKLTIFSYYTFWLTASTSVGNGNKSSDIIEVYTDQDIPEGFVGNLTYESISSTAI NVSWVPPAQPNGLVFYYVSLILQQTPRHVRPPLVTYERSIYFDNLEKYTDYILKITPSTEKGFSDTYTAQLYIKTEE DVPETSPIINTFKNLSSTSVLLSWDPPVKPNGAIISYDLTLQGPNENYSFITSDNYIILEELSPFTLYSFFAAARTR KGLGPSSILFFYTDESVPLAPPQNLTLINCTSDFVWLKWSPSPLPGGIVKVYSFKIHEHETDTIYYKNISGFKTEAK LVGLEPVSTYSIRVSAFTKVGNGNQFSNVVKFTTQESVPDVVQNMQCMATSWQSVLVKffDPPKKANGIITQYMVTVE RNSTKVSPQDHMYTFIKLLANTSYVFKVRASTSAGE⑶ESTCHVSTLPETVPSVPTNIAFSDVQSTSATLTWIRPDT ILGYFQNYKITTQLRAQKCKEWESEECVEYQKIQYLYEAHLTEETVYGLKKFRWYRFQVAASTNAGYGNASNWISTK TLPGPPDGPPENVHVVATSPFSISISWSEPAVITGPTCYLIDVKSVDNDEFNISFIKSNEENKTIEIKDLEIFTRYS VVITAFTGNISAAYVEGKSSAEMIVTTLESAPKDPPNNMTFQKIPDEVTKFQLTFLPPSQPNGNIQVYQALVYREDD PTAVQIHNLSIIQKTNTFVIAMLEGLKGGHTYNISVYAVNSAGAGPKVPMRITMDIKAPARPKTKPTPIYDATGKLL VTSTTITIRMPICYYSDDHGPIKNVQVLVTETGAQHDGNVTKWYDAYFNKARPYFTNEGFPNPPCTEGKTKFSGNEE IYIIGADNACMIPGNEDKICNGPLKPKKQYLFKFRATNIMGQFTDSDYSDPVKTLGEGLSERTVEIILSVTLCILSI ILLGTAIFAFARIRQKQKEGGTYSPQDAEIIDTKLKLDQLITVADLELKDERLTRLLSYRKSIKPISKKSFLQHVEE LCTNNNLKFQEEFSELPKFLQDLSSTDADLPWNRAKNRFPNIKPYNNNRVKLIADASVPGSDYINASYISGYLCPNE FIATQGPLPGTVGDFWRMVWETRAKTLVMLTQCFEKGRIRCHQYffPEDNKPVTVFGDIVITKLMEDVQIDWTIRDLK IERHGDCMTVRQCNFTAWPEHGVPENSAPLIHFVKLVRASRAHDTTPMIVHCSAGVGRTGVFIALDHLTQHINDHDF VDIYGLVAELRSERMCMVQNLAQYIFLHQCILDLLSNKGSNQPICFVNYSALQKMDSLDAME⑶VELEWEETTM(S EQ ID NO ：2)〇
[0037] 發明人發現的兩種PTPRQ基因突變體，其中之一與SEQ ID N0:1相比，具有 c. 3125A>G突變，即相對于野生型PTPRQ基因，該PTPRQ基因突變體的cDNA中第3125位堿 基A突變為G，由此，其所編碼的產物與野生型PTPRQ(SEQ ID N0:2)相比，具有P.D1042G突 變，即該突變是由于c. 3125A>G突變而引起的錯義突變，導致第1042位氨基酸天冬氨酸突 變為甘氨酸。
[0038] 而另一種PTPRQ基因突變體，其與SEQ ID N0 :1相比，具有c. 5981A>G突變，即相 對于野生型PTPRQ基因，該PTPRQ基因突變體的cDNA中第5981位堿基A突變為G，由此，其 所編碼的產物與野生型PTPRQ(SEQ ID NO :2)相比，具有P.E1994G的錯義突變，即其第1994 位氨基酸從谷氨酸突變為甘氨酸。
[0039] 本發明公開了已知耳聾基因 PTPRQ的兩種新突變，首次證實了 PTPRQ基因的 c. 3125A>G和c. 5981A>G的復合雜合突變導致患者出現常染色體隱性非綜合型耳聾的癥 狀，即其為常染色體隱性遺傳性耳聾的分子病因。
[0040] 根據本發明的第二方面，本發明提出了一種分離的多肽。根據本發明的實施例， 與野生型PTPRQ相比，該述分離的多肽具有p. D1042G突變，或者p. E1994G突變。根據本 發明的一些具體示例，具有P. D1042G突變的多肽是由前述分離的編碼具有c. 3125A>G突 變的PTPRQ基因突變體的核酸編碼的，具有p. E1994G突變的多肽是由前述分離的編碼具有 c. 5981A>G突變的PTPRQ基因突變體的核酸編碼的。通過檢測生物樣品中是否同時表達上 述多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易患常染色體隱性非綜合型耳聾，也可以通過檢測 這些多肽在生物體中是否同時存在，有效地預測生物體是否易患常染色體隱性非綜合型耳 聾。
[0041] 篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的系統和試劑盒
[0042] 根據本發明的第三方面，本發明提出了一種能夠有效實施上述篩選易患常染色體 隱性非綜合型耳聾的生物樣品的方法的系統。
[0043] 參考圖1，根據本發明的實施例，該篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣 品的系統1000包括核酸提取裝置100、核酸序列確定裝置200以及判斷裝置300。
[0044] 根據本發明的實施例，核酸提取裝置100用于從生物樣品提取核酸樣本。根據本 發明的實施例，生物樣品的類型并不受特別限制，只要從該生物樣品中能夠提取到反映生 物樣品PTPRQ是否存在突變的核酸樣本即可。根據本發明的實施例，生物樣品可以為選自 人體血液、皮膚、皮下組織的至少一種，優選外周血。由此，可以方便地進行取樣和檢測，從 而能夠進一步提高篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的效率。根據本發明的 實施例，這里所使用的術語"核酸樣本"應做廣義理解，其可以是任何能夠反映生物樣品中 PTPRQ是否存在突變的樣本，例如可以是從生物樣品中直接提取的全基因組DNA，也可以是 該全基因組中包含PTPRQ編碼序列的一部分，可以是從生物樣品中提取的總RNA，也可以是 從生物樣品中提取的mRNA。根據本發明的一個實施例，所述核酸樣本為全基因組DNA。由 此，可以擴大生物樣品的來源范圍，并且可以同時對生物樣品的多種信息進行確定，從而能 夠提高篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的效率。另外，根據本發明的實施 例，核酸樣本的類型并不受特別限制，對于采用RNA作為核酸樣本，則核酸提取裝置進一步 包括RNA提取單元101和反轉錄單元102,其中，提取單元101用于從生物樣品提取RNA樣 本，反轉錄單元102與RNA提取單元101相連，用于對RNA樣本進行反轉錄反應，以便獲得 cDNA樣本，所得到的cDNA樣本構成核酸樣本。由此，可以進一步提高利用RNA作為核酸樣 本篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的效率。
[0045] 根據本發明的實施例，核酸序列確定裝置200與核酸提取裝置100相連，用于對核 酸樣本進行分析，以便確定核酸樣本的核酸序列。根據本發明的實施例，確定所得到核酸樣 本的核酸序列的方法和設備并不受特別限制。根據本發明的具體實施例，可以采用測序的 方法確定核酸樣本的核酸序列。由此，根據本發明的一個實施例，所述核酸序列確定裝置 200可以進一步包括：文庫構建單元201以及測序單元202。文庫構建單元201用于針對核 酸樣本，構建核酸測序文庫；測序單元202與文庫構建單元201相連，用于對核酸測序文庫 進行測序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果。
[0046] 關于針對核酸樣本，構建測序文庫的方法和流程，本領域技術人員可以根據不 同的測序平臺進行適當選擇，關于流程的細節，可以參見測序儀器的廠商例如Illumina 公司所提供的規程，例如參見Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361;Feb 2010)或 Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063;Feb 2010)，通過參照將其并入本文。根據本發明的實施例，從生物樣品提取核酸樣本的方法和 設備，也不受特別限制，可以采用商品化的核酸提取試劑盒進行。
[0047] 需要說明的是，在這里所使用的術語"核酸序列"應作廣義理解，其可以是在對核 酸樣本進行測序得到的測序數據進行組裝后得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采 用通過對核酸樣本進行測序所得到的測序數據（reads)作為核酸序列，只要這些核酸序列 中含有對應PTPRQ的編碼序列即可。
[0048] 另外，根據本發明的實施例，可以對核酸樣本進行篩選，富集PTPRQ外顯子，該篩 選富集可以在構建測序文庫之前，構建測序文庫過程中，或者構建測序文庫之后進行。由 此，文庫構建單元201可以進一步包括PCR擴增模塊（圖中未示出），在該PCR擴增模塊中 設置有PTPRQ外顯子特異性引物，以便利用PTPRQ外顯子特異性引物，對所述核酸樣本進行 PCR擴增。由此，可以通過PCR擴增，富集PTPRQ外顯子，從而能夠進一步提高篩選易患常 染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的效率。根據本發明的具體實施例，針對c. 3125A>G 突變，所述PTPRQ基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :3-4所示的核苷酸序列；針對 c. 5981A>G突變，所述PTPRQ基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :5-6所示的核苷酸 序列：
[0049]

[0050] 發明人驚奇地發現，通過采用上述引物，可以在PCR反應體系中顯著有效地完成 對PTPRQ外顯子的擴增。需要說明的是，這些SEQ ID N0:3-6所示的核苷酸序列是本發明 的發明人在付出了艱苦的勞動后，意外獲得的。
[0051] 根據本發明的實施例，可以用于進行測序的設備并不受特別限制。根據本發明的 實施例，可以采用第二代測序平臺，也可以采用第三代以及第四代或者更先進的測序平臺。 根據本發明的具體示例，測序單元202可以為選自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測序裝 置的至少一種。由此，結合最新的測序技術，針對單個位點可以達到較高的測序深度，檢測 靈敏度和準確性大大提高，因而能夠利用這些測序裝置的高通量、深度測序的特點，進一步 提高對核酸樣本進行檢測分析的效率。從而，提高后續對測序數據進行分析時的精確性和 準確度。
[0052] 根據本發明的實施例，判斷裝置300與核酸序列確定裝置200相連，適于將核酸樣 本的核酸序列進行比對，以便基于核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0 :1的區別判斷生物樣 品是否易患常染色體隱性非綜合型耳聾。由此，利用該系統，能夠有效地篩選易患常染色體 隱性非綜合型耳聾的生物樣品。
[0053] 具體地，基于核酸樣本的核酸序列或其互補序列，與SEQ ID N0 :1相比，是否具有 c. 3125A>G和c. 5981A>G的復合雜合突變，判斷生物樣品是否易患常染色體隱性非綜合型 耳聾。如前所述，根據本發明的一個實施例，核酸樣本的核酸序列與SEQ ID N0 :1相比，具 有c. 3125A>G和c. 5981A>G的復合雜合突變，是生物樣品易患常染色體隱性非綜合型耳聾 的指示。根據本發明的實施例，對核酸序列與SEQ ID N0 :1進行比對的設備并不受特別限 制，可以采用任意常規的軟件進行操作，根據本發明的具體實例，可以采用SOAP軟件進行 比對。
[0054] 根據本發明的第四方面，本發明提出了一種用于篩選易患常染色體隱性非綜合型 耳聾的生物樣品的試劑盒。根據本發明的實施例，該用于篩選易患常染色體隱性非綜合型 耳聾的生物樣品的試劑盒包括：適于檢測與SEQ ID N0 :1相比具有c. 3125A>G突變的PTPRQ 基因突變體，以及與SEQ ID N0:1相比具有c. 5981A>G突變的PTPRQ基因突變體的試劑。 利用根據本發明實施例的試劑盒，通過篩選同時存在上述兩種PTPRQ基因突變體的生物樣 品，能夠有效地篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品。在本文中，所使用的術語 "適于檢測與SEQ ID N0:1相比具有c. 3125A>G突變的PTPRQ基因突變體，以及與SEQ ID NO :1相比具有c. 5981A>G突變的PTPRQ基因突變體的試劑"應做廣義理解，即可以是檢測 兩種PTPRQ突變體編碼基因的試劑，也可以是檢測PTPRQ突變體多肽的試劑，例如可以采用 識別特異性位點的抗體。根據本發明的一個實施例，所述試劑為核酸探針或引物，優選地， 針對與SEQ ID N0:1相比具有c. 3125A>G突變的PTPRQ基因突變體，所述核酸探針或引物 具有如SEQ ID NO :3-4所示的核苷酸序列；針對與SEQ ID N0 :1相比具有c. 5981A>G突變 的PTPRQ基因突變體，所述核酸探針或引物具有如SEQ ID NO :5-6所示的核苷酸序列。由 此，可以高效地篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品。
[0055] 需要說明的是，在本文前面篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的系 統部分中所描述的特征和優點，同樣適用于篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣 品的試劑盒，在此不再贅述。
[0056] 構建體及重組細胞
[0057] 根據本發明的第五方面，本發明還提出了一種構建體。根據本發明的實施例，該構 建體包含前面所述的分離的編碼PTPRQ突變體的核酸。需要說明的是，"構建體包含前面 所述的分離的編碼PTPRQ突變體的核酸"表示，本發明的構建體包含與SEQ ID NO : 1相比 具有c. 3125A>G突變的PTPRQ基因突變體的核酸序列，或者包含與SEQ ID N0:1相比具有 c. 5981A>G突變的PTPRQ基因突變體的核酸序列，或者同時包含上述兩種PTPRQ基因突變體 的核酸序列。由此，利用本發明的構建體轉化受體細胞獲得的重組細胞，能夠有效地用于篩 選治療常染色體隱性非綜合型耳聾的藥物。其中，所述受體細胞的種類不受特別限制，例如 可以為大腸桿菌細胞、哺乳動物細胞，優選該受體細胞來源于哺乳動物。
[0058] 在本發明中所使用的術語"構建體"是指這樣的一種遺傳載體，其包含特定核酸序 列，并且能夠將目的核酸序列轉入宿主細胞中，以獲得重組細胞。根據本發明的實施例，構 建體的形式不受特別限制。根據本發明的實施例，其可以為質粒、噬菌體、人工染色體、粘粒 (Cosmid)、病毒的至少一種，優選質粒。質粒作為遺傳載體，具有操作簡單，可以攜帶較大片 段的性質，便于操作和處理。質粒的形式也不受特別限制，既可以是環形質粒，也可以是線 性質粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領域技術人員可以根據需要進行選擇。在本 發明中所使用的術語"核酸"可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包 括但不限于經過修飾的或者未經修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。對于用于構 建重組細胞的構建體，優選所述核酸為DNA，因為DNA相對于RNA而言，其更穩定，并且易于 操作。
[0059] 根據本發明的第六方面，本發明還提出了一種重組細胞。根據本發明的實施例，該 重組細胞是通過前面所述的構建體轉化受體細胞而獲得的。從而，本發明的重組細胞能夠 表達構建體所攜帶的PTPRQ基因突變體。根據本發明的一些實施例，利用本發明的重組細 胞，能夠有效地篩選治療常染色體隱性非綜合型耳聾的藥物。根據本發明的實施例，受體細 胞的種類不受特別限制，例如可以為大腸桿菌細胞、哺乳動物細胞，優選所述受體細胞來源 于非人哺乳動物。
[0060] 構建藥物篩選模型的方法
[0061] 根據本發明的第七方面，本發明還提供了一種構建藥物篩選模型的方法。根據本 發明的實施例，該方法包括：使動物的至少一部分細胞同時表達與SEQ ID N0 :1相比具有 c. 3125A>G突變的核酸，以及與SEQ ID N0:1相比具有c. 5981A>G突變的核酸。根據本發 明的實施例，所述動物為小鼠、豬、狗、靈長類動物。根據本發明的一些實施例，利用本發明 的藥物篩選模型，能夠有效地篩選治療常染色體隱性非綜合型耳聾的藥物。
[0062] 需要說明的是，本發明構建藥物篩選模型的方法不受特別的限制，只要使動物 的至少一部分細胞同時表達前述的兩種PTPRQ基因突變體（與SEQ ID N0:1相比具有 c. 3125A>G突變的核酸，以及與SEQ ID N0:1相比具有c. 5981A>G突變的核酸）即可。例 如，可以采用基因轉化的方法，將前面所述的本發明的構建體轉入受體動物（非人），從而 使動物的至少一部分細胞同時表達前述的兩種PTPRQ基因突變體；也可以采用CRISPR/ Cas9基因編輯技術、盒式突變、SOE PCR等方法，使受體動物的PTPRQ基因發生c. 3125A>G 和c. 5981A>G的復合雜合突變，并有效表達前述的兩種多肽，從而該受體動物能夠發生常 染色體隱性非綜合型耳聾，進而能夠有效地用于篩選治療常染色體隱性非綜合型耳聾的藥 物，也即能夠有效用作藥物篩選模型。
[0063] 需要說明的是，本發明采用新一代的全外顯子組測序技術，針對一個常染色體隱 性非綜合型耳聾患者家系進行全基因組外顯子組測序分析，從而發現了 2個常染色體隱性 非綜合型耳聾致病基因 PTPRQ的新突變位點。與傳統的連鎖分析、候選基因關聯分析技術 相比，外顯子組測序技術針對基因組內編碼蛋白質的外顯子區域，目標集中，測序深度和精 度更高，可以更準確的定位常染色體隱性非綜合型耳聾的致病基因及其突變位點，進而為 闡明Bjdrastad S綜合癥的分子發病機制，開發有效的早期致病基因篩查和干預治療措施提 供科學依據。
[0064] 下面參考具體實施例，對本發明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明 性的，而不能理解為對本發明的限制。
[0065] 若未特別指明，實施例中所采用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手 段，可以參照《分子克隆實驗指南》第三版或者相關產品進行，所采用的試劑和產品也均為 可商業獲得的。未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法，所用試劑的來 源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現時標明，其后所用相同試劑如無特 殊說明，均以首次標明的內容相同。
[0066] 實施例1確定常染色體隱性非綜合型耳聾致病突變 [0067] 1、樣本收集
[0068] 發明人收集到一個中國漢族2代常染色體隱性非綜合型耳聾患者家系其家系圖 見圖2。如圖2所示，該家系包含4個成員，包括2名患者（即家系圖中的II1、112)、2名家 系內正常人（即該2例患者的父母II、12,其均未發病），符合常染色體隱性遺傳模式。其 中，〇表示正常女性，□表示正常男性，表示男性患者，箭頭所指為先證者。
[0069] 其中，該豕系中兩個患者的純首測聽結果見圖3。在圖3中，橫坐標表純首的頻 率，縱坐標表示聽力級，如果聽力正常閾值曲線應該是在0附近浮動的，曲線往下走表示聽 力下降。如圖3所示，左圖為患者III的檢測結果，右圖為患者112的檢測結果，結果顯示 患者III、112的聽力均為雙側中-重度感音神經性耳聾。
[0070] 發明人收集該家系內所有成員的外周血樣，加入EDTA抗凝，-80攝氏度保存。所 有血樣均簽屬知情同意書。
[0071] 2、DNA 提取
[0072] 取上述家系所有成員的外周血，分別利用QIAmp Blood kit (Qiagen, Hilden, Germany)抽提外周血白細胞中的基因組DNA，并利用Qubit Fluorometer和瓊脂糖凝膠電泳測量DNA的濃度及純度，所得的每個標本基因組DNA 0D260/0D280均位于1. 7-2. 0之間，濃度不少于50納克/微升，總量不少于3微克。
[0073] 3、外顯子捕獲測序
[0074] 發明人利用 NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library ν3· 0 全外顯子捕獲平 臺，結合Illumina Hiseq 2000的高通量測序技術，對上述常染色體隱性非綜合型耳聾患者 家系中的兩位患者及其表型正常的父母的外顯子組序列進行了測序。
[0075] 具體如下：
[0076] 1)利用超聲波儀（CovarisS2, Massachusetts, USA)將各基因組DNA樣本隨機打斷 成250-300bp左右的片段，隨后按照制造商提供的操作說明書，在片段兩端分別連接上接 頭制備文庫（可參見：http://www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa標準建庫說明 書，通過參照將其全文并入本文）。
[0077] 2)文庫經純化后經過Ligation-mediated PCR(LM-PCR)的線性擴增與捕獲試劑 Biotinylated DNA Library進行雜交富集，再經過LM-PCR的線性擴增，文庫檢測合格后即 可上機測序，以便獲得原始測序數據。其中，測序平臺為Illumina Hiseq 2000,讀取長度為 90bp，各樣本的平均測序深度最少為50X。
[0078] 3)變異檢測、注釋及數據庫比較
[0079] 利用Illumina basecalling Software 1. 7對上述獲得的原始測序數據進行 處理，經過過濾去污染后，使用S0APaligner/S0AP2(可參見：Li R, Li Y, Kristiansen K, et al,SOAP: short oligonucleotide alignment program.Bioinformatics 2008,24(5):713-714；Li R, Yu C, Li Y, ea al,S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics 2009, 25 (15) :1966-1967,通過參照將其全文并 入本文）比對到參考基因組UCSC NCBI37/hgl9,以便獲得比對到基因組上的唯一比對序 列。然后利用 SOAPsnp (可參見：Li R，Li Y，Fang X，Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Res 2009,19 (6):1124-1132, 通過參照將其全文并入本文）確定靶區域的基因型。
[0080] 結果，在病例1 (III)中發現94316個單核苷酸多態性（SNPs)和6774個插入/缺 失（11?1618)，在病例2(11:2)中發現93434個3即和6807個111(161，在父親（1:1)中發現 93657個SNP和6753個Indel，在母親（I: 2)中發現99942個SNP和7055個Indel。隨后通過 dbSNP 數據庫（http://hgdownload. cse. ucsc. edu/goldenPath/hgl9/database/snpl32. txt. gz)，HapMap 數據庫（f tp: //f tp. ncbi. nlm. nih. gov/hapmap)，千人基因組數據庫 (ftp: //ftp. lOOOgenomes. ebi. ac. uk/vol 1/ftp)，炎黃數據庫（http: //yh. genomics, org. cn/)等公共數據庫的過濾，去掉所有已知的且在數據庫中等位基因頻率大于0.005的變異 (變異MAF值高，通常為不致病的普通多態性），并利用SIFT軟件進行SNP功能預測。
[0081] 其中，感音神經性耳聾屬于有常隱和常顯兩種遺傳模式，發明人結合家系實際情 況，使用隱性遺傳策略分析。將分析后的加息結果與目前已經報道的與耳聾相關的基因列 表取交集，驗證得到22個復合雜合突變的基因和兩個純合突變的基因。發明人綜合測序 質量、信息分析數據篩選參考，結合隱性遺傳模式：即父母雜合突變、孩子純合突變或者父 母同一基因各帶有一個突變、孩子同時擁有兩個突變（復合雜合），發現ARNSHL已知基因 PTPRQ上的突變符合條件。PTPRQ上有兩個錯義突變為患者共有的：c. 3125A>G(p. D1042G)， c. 5981A>G(p. E1994G)。根據信息學分析，此家系中如父母各帶一個突變，PTPRQ中的兩個 錯義突變可形成復合雜合突變。
[0082] PTPRQ為已知耳聾致病基因，該基因包含45個外顯子，編碼蛋白大小為 260. 924KDa。PTPRQ編碼的蛋白屬于III型受體蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP酶）家族，該蛋白 在細胞增殖和分化中可起到催化磷酸和磷酸酰肌醇磷酸化的作用。研究表明，該基因的突 變可引起常染色體隱性遺傳性耳聾。
[0083] 進一步，對兩個患者及其正常父母進行sanger測序驗證，結果發現上述突變位 點符合常染色體隱性遺傳模式的共分離。由此，發明人認為，PTPRQ基因的c. 3125A>G(p. D1042G)和c. 5981A>G(p. E1994G)突變極可能為常染色體隱性非綜合型耳聾的新的致病突 變。
[0084] 實施例2 Sanger法測序驗證
[0085] 分別對實施例1中所述的常染色體隱性非綜合型耳聾患者家系中的所有家系成 員（包括2個患者和2個正常家系成員）以及328名隨機挑取的家系外正常人的PTPRQ基 因進行檢測：針對PTPRQ基因的c. 3125A>G和c. 5981A>G突變設計引物，然后通過PCR擴增、 產物純化和測序的方法獲得突變位點有關序列，根據確定序列測定結果屬于突變型還是野 生型，驗證PTPRQ基因的c. 3125A>G和c. 5981A>G突變與常染色體隱性非綜合型耳聾之間 的相關性。
[0086] 具體方法步驟如下：
[0087] 1、DNA 提取
[0088] 按照實施例1中所述的提取DNA的方法，分別提取制備受試者外周靜脈血中的基 因組DNA，備用。
[0089] 2、引物設計及PCR反應
[0090] 首先，參考人類基因組序列數據庫GRCh37/hg 19，設計得到針對PTPRQ基因的 c. 3125A>G和c. 5981A>G突變的外顯子特異性引物，具體序列如下：
[0091]
[0092] 接著，分別按照以下配比配制各基因組DNA樣本的PCR反應體系以及進行PCR反 應：
[0093] 反應體系（20 μ 1):
[0094]
[0095] PCR反應條件：
[0096]
[0097] 由此，獲得各受試者基因組DNA樣本的PCR擴增產物。
[0098] 3、測序
[0099] 將步驟2中獲得的各受試者基因組DNA樣本的PCR擴增產物直接進行DNA測序。 其中，測序采用ABI3730型測序儀進行。
[0100] 基于測序結果，在本發明的常染色體隱性非綜合型耳聾患者家系中對PTPRQ基因 的c. 3125A>G(p. D1042G)和c. 5981A>G(p. E1994G)突變位點進行突變排查，結果發現該家 系中兩個患者均攜帶c. 3125A>G(p. D1042G)和c. 5981A>G(p. E1994G)的復合雜合突變，而 表現正常的父母分別攜帶其中的一種雜合突變：父親僅攜帶c. 5981A>G(p. E1994G)的錯義 突變，而母親僅攜帶c. 3125A>G(p.D1042G)的錯義突變（具體結果見圖4)。此外，在328 個正常對照樣本中，僅有2個樣本具有c. 3125A>G突變，而c. 5981A>G突變在這些樣本中 均不存在。其中，圖4為上述ARNSHL患者家系中所有家系成員的PTPRQ基因 c. 3125A>G、 c. 5981A>G突變位點的代表性Sanger測序驗證峰圖。
[0101] 由此，進一步證明 PTPRQ 基因的 c. 3125A>G(p.D1042G)和 c. 5981A>G(p.E1994G) 是常染色體隱性非綜合型耳聾的新的致病位點，PTPRQ基因的c. 3125A>G和c. 5981A>G的 復合雜合突變，能夠導致該病。
[0102] 實施例3檢測試劑盒
[0103] 制備一檢測試劑盒，其包含能夠檢測PTPRQ基因的c. 3125A>G和c. 5981A>G突變 的引物，用于篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品，其中這些引物為PTPRQ基 因外顯子特異性引物，其序列如實施例2中SEQ ID NO :3-6所示。
[0104] 利用上述試劑盒篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的具體步驟為： 按照實施例1的步驟2所述的方法提取待測者DNA，以所提取的DNA為模板與上述PTPRQ基 因的外顯子特異性引物進行PCR反應（PCR反應體系和反應條件參見實施例2)，并按照本領 域常規方法對PCR產物純化，將純化的產物進行測序，然后通過觀察測序所得到的序列是 否同時具有c. 3125A>G和c. 5981A>G突變，能夠有效地檢測本發明的兩種PTPRQ基因突變 體在待測者DNA中是否同時存在，從而能夠有效地檢測待測者是否易患常染色體隱性非綜 合型耳聾，進一步，能夠從待測者中篩選出易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品。
[0105] 在本說明書的描述中，參考術語"一個實施例"、"一些實施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特 點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不 一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何 的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
[0106] 盡管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解：在不 脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本 發明的范圍由權利要求及其等同物限定。
【主權項】
1. 一種分離的編碼PTPRQ突變體的核酸，其特征在于，與SEQ ID NO : 1相比，所述核酸 具有c. 3125A>G突變，或者c. 5981A>G突變， 任選地，所述核酸為DNA。2. -種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID N0:2相比，所述分離的多肽具有P.D1042G 突變，或者P.E1994G突變， 任選地，所述多肽是由權利要求1所述的核酸編碼的。3. -種篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的系統，其特征在于，包括： 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于從所述生物樣品提取核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核 酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列； 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于所述核酸樣本的核 酸序列或其互補序列，與SEQ ID N0:1相比，是否具有c. 3125A>G和c. 5981A>G的復合雜合 突變，判斷所述生物樣品是否易患常染色體隱性非綜合型耳聾。4. 根據權利要求3所述的系統，其特征在于，所述核酸提取裝置進一步包括： RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從所述生物樣品提取RNA樣本；以及 反轉錄單元，所述反轉錄單元與所述RNA提取單元相連，用于對所述RNA樣本進行反轉 錄反應，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構成所述核酸樣本。5. 根據權利要求3所述的系統，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進一步包括： 文庫構建單元，所述文庫構建單元用于針對所述核酸樣本，構建核酸測序文庫；以及 測序單元，所述測序單元與所述文庫構建單元相連，用于對所述核酸測序文庫進行測 序，以便獲得由多個測序數據構成的測序結果。6. 根據權利要求5所述的系統，其特征在于，所述文庫構建單元進一步包括： PCR擴增模塊，所述PCR擴增模塊中設置有PTPRQ基因外顯子特異性引物，以便利用所 述特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增， 任選地， 針對c. 3125A>G突變，所述PTPRQ基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID N0:3-4所示 的核苷酸序列； 針對c. 5981A>G突變，所述PTPRQ基因外顯子特異性引物具有如SEQ ID NO :5-6所示 的核苷酸序列， 任選地，所述測序單元包括選自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一 種。7. -種用于篩選易患常染色體隱性非綜合型耳聾的生物樣品的試劑盒，其特征在于， 含有： 適于檢測與SEQ ID NO :1相比具有c. 3125A>G突變的PTPRQ基因突變體，以及與SEQ ID NO :1相比具有c. 5981A>G突變的PTPRQ基因突變體的試劑， 任選地，所述試劑為核酸探針或引物， 任選地，針對與SEQ ID N0:1相比具有c. 3125A>G突變的PTPRQ基因突變體，所述核酸 探針或引物具有如SEQ ID NO :3-4所示的核苷酸序列； 針對與SEQ ID N0:1相比具有c. 5981A>G突變的PTPRQ基因突變體，所述核酸探針或 引物具有如SEQ ID NO :5-6所示的核苷酸序列。8. -種構建體，其特征在于，包含權利要求1所述的分離的編碼PTPRQ突變體的核酸。9. 一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞是通過權利要求8所述的構建體轉化受 體細胞而獲得的。10. -種構建藥物篩選模型的方法，其特征在于，包括： 使動物的至少一部分細胞同時表達與SEQ ID N0:1相比具有c. 3125A>G突變的核酸， 以及與SEQ ID NO :1相比具有c. 5981A>G突變的核酸， 任選地，所述動物為小鼠、豬、狗、靈長類動物。
【文檔編號】C12N5/10GK105838720SQ201510017150
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月14日
【發明人】高雪, 戴樸, 張建國, 諶于藍, 管李萍, 徐訊
【申請人】中國人民解放軍總醫院, 深圳華大基因股份有限公司