一種從三文魚罐頭中提取dna的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從三文魚罐頭中提取DNA的方法。進一步地，本發明的方法看用于鑒別三文魚罐頭中三文魚品種。本發明的方法可以包括如下步驟：a)：稱取一定質量的三文魚罐頭樣品，利用DNA提取液提取DNA，其中所述的DNA提取液的組成為：4％CTAB、100mmol/L Tris?HCl(pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA(pH 8.0)；b)：以a)中得到的DNA為模板，擴增出COI的212bp的DNA片段；c)：將b)中擴增得到的片段進行測序，與已有DNA數據庫進行序列特征比對，得到三文魚品種信息。本發明建立了能成功提取用于鑒別三文魚罐頭中三文魚品種的DNA的方法，對提高我國罐頭工業產品質量安全水平，規范行業發展，保護消費者合法權益和知情權具有十分重要的現實意義。
【專利說明】
-種從H文魚罐頭中提取DNA的方法
技術領域
[0001 ] 一種提取DNA的方法，特別是從S文魚罐頭中提取DNA的方法。根據本發明的方法 所提取的DNA可用于鑒別S文魚罐頭中S文魚品種，進而用于鑒別食品真實性。
【背景技術】
[0002] =文魚，是娃縛科魚類的總稱，食用性名貴魚類，主要分布于高締度地區的冷水魚 類，由于其含有豐富蛋白質和人體所需的脂肪酸，健康綠色無污染，營養價值較高，深受大 眾的喜愛。娃科魚包括3亞科7屬36種，主要為娃亞科(Salmoniae)，白娃亞科(Coregoninae) 和茵魚亞科(Thymallidae)。食品法典委員會CAC(O)DEX STAN 3-1981KS文魚罐頭》中規 定，大西洋娃魚（Salmo salar)、紅大麻哈魚（Oncorhynchus nerka)、銀大馬哈魚 (Oncorhynchus kisutch)、娃魚（Oncorhynchus tschaw}ftscha)、駝背大馬哈魚 (Oncorhynchus gorbusch曰）大馬哈魚（Oncorhynchus ket曰）、蟲工魚尊（Oncorhynchus m曰sou)7 種魚類均可W加工成=文魚罐頭。
[0003] 魚類制品原料品種鑒別成為水產加工行業中面臨的重要問題之一，目前國內外市 場上=文魚W次充好、假冒的現象時有發生，損害了消費者的合法權益和知情權。例如，據 統計國內挪威立文魚每公斤市場價高達240元，虹縛魚的市場價格每公斤60元左右，=文魚 罐頭食品標簽中僅標注原料為=文魚，并不標注出=文魚的具體品種。
[0004] 對于加工肉制品中原料品種鑒別技術，目前常基于對肉制品中特定理化成分的分 析，如蛋白質、脂肪酸等，采用色譜、光譜、電泳等方法識別，運些方法適用于加工程度相對 較低的肉制品，如火腿腸、肉干、肉脯等，對于=文魚罐頭食品，與一般加工肉類食品不同， 其在制作過程中須經過長時間的高溫殺菌處理，一般在118~12rc下處理20~90min，運給 魚罐頭食品中所用原料的品種鑒別帶來了困難。
[0005] 細胞色素氧化酶(切tochrome oxidase,C0X)是線粒體內呼吸鏈電子傳遞的終末 復合物，是線粒體氧化能力的關鍵調節物質。細胞色素 C氧化酶亞基I (C0I)是細胞色素 C氧 化酶具有酶催化活性的3個亞基之一。COXI在生物的系統分類W及種類鑒定方面有著廣泛、 重要的作用。劉君等人報道了基于線粒體COI的DNA條形碼技術在貽貝科種類鑒定中的應用 (水生生物學報，2011,35(5):874-88);梁華芳等人報道了利用COI基因序列對中國沿海龍 郵屬8種龍郵進行分子系統學研究（2011);王敏曉等人基于線粒體COXl片段序列對對膠州 灣浮游動物進行了 DNA條形碼分析(2011);李新光報道了基于COI的DNA條形碼的魚片（肉） 真偽鑒別技術研究(2013)。
[0006] 在魚類物種鑒別中，DNA條形碼技術是W-段650bp細胞色素 C氧化酶亞基I(COI) 基因序列作為標準序列，從而實現魚類的快速鑒別。但是對于DNA降解嚴重的魚類罐頭，DNA 條形碼技術可能不能夠擴增出適當大小的目的片段，從而導致無法對魚類品種進行有效鑒 別。
[0007] 為了提高我國魚類罐頭(尤其是=文魚類罐頭)工業產品質量安全水平，規范行業 發展，保護消費者合法權益和知情權，急需能擴增出適當大小的目的片段，從而對魚類品種 進行有效鑒別的方法。運對于消費者而言，將具有十分重要的現實意義。
【發明內容】
[000引本發明的主要目的是針對=文魚罐頭食品原料標示模糊，現有鑒別分析技術無法 準確鑒別其原料品種的問題，開發一種從S文魚罐頭提取能有效鑒別S文魚種類的DNA的 方法。
[0009] 本發明的發明人通過優化S文魚罐頭中DNA提取方法，得到適用于PCR擴增的DNA 模板，W細胞色素 C氧化酶亞基I(COI)基因部分序列為目的片段，設計引物擴增出DNA片段 (例如長度212bp大小），進行序列測定，與國際通用DNA數據庫，如Genbank中的已有的立文 魚COI基因序列比對，確定罐頭樣品中的=文魚品種。
[0010] -方面，本發明提供了一種從=文魚罐頭中提取DNA的方法，所述方法包括使用含 有CTAB的DNA提取液。
[0011] 優選地，本發明的DNA提取液中含有4 %的CTAB。更優選地，本發明的DNA提取液的 組成為：4%CTAB、100mmol/L Tris-HCUpH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L 抓 TA(pH 8.0)。
[0012] 任選地，本發明的從=文魚罐頭中提取DNA的方法包括稱取一定質量的=文魚罐 頭樣品，加入適量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫靜置過夜，離屯、，棄上清，并用無菌去離子水 清洗樣品。
[0013] 優選地，其中氯仿：甲醇：水混合溶液是氯仿：甲醇：水=1: 2:0.8(體積比）的混合 液。
[0014] 具體而言，本發明的從S文魚罐頭中提取DNA的方法包括如下步驟：
[0015] a):稱取一定量的=文魚罐頭樣品，加入適量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫靜置過 夜，離屯、，棄上清，并用無菌去離子水清洗樣品；和
[0016] b)在步驟a)中得到的樣品中加入適量DNA提取液，提取S文魚罐頭中DNA。
[0017] 本發明還提供了一種用于從S文魚罐頭中擴增COI的部分基因序列的方法，其包 括：
[0018] a):稱取一定量的=文魚罐頭樣品，加入適量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫靜置過 夜，離屯、，棄上清，并用無菌去離子水清洗樣品；
[0019] b)在步驟a)中得到的樣品中加入適量DNA提取液，提取S文魚罐頭中DNA;
[0020] C) W步驟b)中獲得DNA為模板，進行PCR擴增。
[0021] 在本發明中，擴增COI的部分基因序列所用的引物可W為S文魚的細胞色素 C氧化 酶亞基I ( C 0 I )基因的部分序列的通用引物對，例如，上游引物序列可為： TGTAAAACGACGGCCAGTTCCACTAATCACAARGAT ATTGGT AC;下游引物序列可為： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC。
[0022] 示例性地，所述PCR的擴增條件為：95°C預變性2min;95°C變性lmin，46°C退火 lmin，72°C 延伸 3〇8,5個循環；95°(：變性1111111，53°(：退火1111111，72°(：延伸3〇3,35個循環；721： 延伸5min;反應體系為IOXPCR buffer 2.5化，dNTP 0.2mmol/L，上游引物0.8pmol/L，下游 引物0.8pmol/L，DNA模板200ng，Taq酶1.5U，用d地2〇將總體積補充至化化。
[0023] 本發明進而提供了鑒別=文魚罐頭中=文魚品種的方法，其包括如下步驟：
[0024] (I)從S文魚罐頭制品中提取DM, W得到適于PCR擴增的DNA模板；
[0025] (2) W步驟(1)中提取的DNA為模板，對細胞色素 C氧化酶亞基I(COI)基因部分序列 進行PCR擴增，W擴增出DNA片段(優選為長度100-5(K)bp，更優選150-25化P，最優選21化P大 小）；
[0026] (3)對步驟(2)中擴增出的DNA片段進行測序并將所測得的DNA序列與已知的S文 魚品種的COI基因序列進行比對，并確定該=文魚罐頭中的=文魚品種。
[0027] 任選地，步驟(3)中的比對是通過將所測定的COI基因的部分序列與DNA數據庫(如 Genbank)中的已有的S文魚COI基因序列比對。優先地，所述比對是通過Blast比對。
[0028] 通過本發明的擴增方法所擴增的產物可用于鑒別=文魚罐頭中=文魚品種中，其 包括如下步驟:測序所擴增的序列W及將所測序的序列與已知的S文魚品種的COI基因序 列進行比對，并確定該=文魚罐頭中的=文魚品種。
[0029] 作為一個非限制性的實施方式，利用本發明的方法所提取或擴增的DNA可用于鑒 別=文魚罐頭中=文魚品種，例如，可W通過如下步驟：
[0030] a):稱取一定質量的=文魚罐頭樣品，加入適量氯仿：甲醇:水混合溶液，室溫靜置 過夜，離屯、，棄上清，并用無菌去離子水清洗樣品；
[0031] b):在步驟a)中得到的樣品中加入適量DNA提取液(如上述的DNA提取液），提取S 文魚罐頭中DNA;
[0032] C): W步驟b)中得到的DNA為模板，W細胞色素 C氧化酶亞基I(COI)基因部分序列 為目的片段，采用微條形碼引物擴增，得到片段大小為212bp的DNA片段，上游引物序列： TGT AAAA CGACGGCCAGTTC CA CTAAT CACA ARGATATTGGTAC，下游引 物序列： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC。
[0033] (1):?〇?擴增條件為95。(：預變性2111111;95。(：變性1111111，46。(：退火1111111，72。(：延伸303， 5個循環;95°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸3〇3,35個循環;72°(：延伸5111111;反應體系 為IOXPCR buffer 2.5化，dNTP 0.2mmol/L，上游引物0.8pmol/L，下游引物0.8pmol/L，DNA 模板20化g Jaq酶1.抓，用dd出明尋總體積補充至化化。
[0034] e):將步驟d)中擴增得到的DNA片段進行序列測定，并將序列在Genbank中進行 Blast比對，確定S文魚品種。
[0035] 優選地，本發明所述的氯仿：甲醇：水混合溶液是氯仿：甲醇：水=1: 2 :0.8 (體積 比）的混合液。
[0036] 本發明針對罐頭中DNA降解嚴重，PCR反應容易失敗的情況，WCOI部分序列（微條 形碼)作為目的片段，同時優化了S文魚罐頭中DNA的提取方法，能夠準確可靠的得到S文 魚罐頭中=文魚的具體品種信息，其優點在于操作簡便易行，操作流程易于實現標準化。
【附圖說明】：
[0037] 圖1顯示了 4 % CTAB提取液和2 % CTAB提取液對DNA提取效果的影響。
[0038] 圖2是針對=文魚罐頭進行引物篩選W擴增分別是2^bp、358bp和47化P的目的片 段的結果，其中：圖2A是212bp目的片段擴增結果；圖2B是358bp目的片段擴增結果；W及圖 2C是472bp目的片段擴增結果。
【具體實施方式】：
[0039] 為了更好的理解本發明，下面結合具體實例對本發明進一步說明。
[0040] 實施例：
[0041] 1.樣品采集從市面采集不同加工方式的=文魚罐頭樣品，如蒲燒、水浸、油浸等。 [00創 2. DNA提取
[0043] a)稱取1 OOmgS文魚罐頭肌肉組織樣品于2mL離屯、管中，加入ImL氯仿：甲醇：水= 1:2:0.8(體積比），室溫靜置過夜，500化pm離屯、3min，棄上清，無菌去離子水清洗樣品，樣品 組織于-40°C保存備用；
[0044] b)將步驟a)得到樣品，無菌條件下剪碎后加入ImL DNA提取液，提取液組成為4% CTAB、100mmol/L Tris-HCl(抑 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L 抓TA(pH 8.0)，置于65°C 恒溫水浴槽中，溫育I-化，期間不時顛倒混勻，直至樣品完全消化;溫育后，離屯、取上清液至 一新的2mL離屯、管中，加等體積的氯仿：異戊醇= 24:1(體積比）溶液緩慢震蕩至乳白色， 1200化/min離屯、IOmin;重復上述步驟一次;取上清液加2/3體積預冷的異丙醇沉淀DNA，-20 °C，比;離屯、棄上清液，加入80化L 70%乙醇進行洗涂兩次，然后棄去乙醇，干燥，沉淀用50y L無菌dd出0溶解，-20°C保存。
[0045] 3. PCR 擴增
[0046] 采用微條形碼引物對提取的DNA進行PCR擴增，上游引物序列： TGT AAAA CGACGGCCAGTTC CA CTAAT CACA ARGATATTGGTAC，下游引 物序列： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC，目的片段大小為21 化P。
[0047] PCR 擴增條件為 95°C 預變性2min;95°C 變性 1111111，46°(：退火1111111，72°(：延伸3〇3,5個 循環;95°C變性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸3〇3,35個循環;72°(：延伸5111111;反應體系為10 X PCR buf f er2.5化，dNTP 0.2mmo 1 /L，上游引物0. Spmo 1 /L，下游引物0. Spmo 1 /L，DNA模板 200ng，Taq酶1.抓，用d地2〇將總體積補充至化化。
[0048] 4.將擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，并送往測序公司測序，運用NCBI的 BLAST程序，把所有樣品的PCR產物測序結果與GenBank數據庫中已有S文魚COI基因序列進 行比較，確認=文魚品種，比對結果見表1。
[0049] 表1=文魚罐頭中=文魚品種鑒別結果
[(K)加 ]
[0051 ] 對比實施例1:關于DNA提取說明
[0052]采用四種DNA提取方法針對不同加工類型的S文魚罐頭進行DNA提取。分別是如實 施例1的CTAB法W及常規的SDS法、脈鹽法、試劑盒法，W不同片段長度引物進行擴增，W擴 增的結果(能否順利擴增為依據)判斷DNA提取方法的優劣。
[0化3]四種DNA提取方法PCR擴增結果匯總
[0化4]
[0化5] +:擴增良好，未擴增出
[0056]從擴增結果來看，4種提取方法均能得到123bp的目的片段，當目的片段增大到 224bp時，CTAB法能夠擴增絕大多數樣品，所WCTAB法為最優的方法。
[0化7] 對比實施例2:關于CTAB法的優化
[0058] 根據實施例1的方法，采用不同系列濃度的CTAB對S文魚罐頭進行DNA提取。結果 發現，4 % CTAB的提取效果最佳。示例性地，圖1顯示了 4 % CTAB提取液和2 % CTAB提取液對 DNA提取效果的影響。其中左側的1-7泳道對應于4 %CTAB提取液；右側的泳道對應于2 % CTAB提取液。
[0059] 對比實施例3:關于目的片段的選擇
[0060] 盡管能從=文魚罐頭中獲得123bp的目的片段(如上述實施例中的表1所示），但根 據研究結果，基于123bp并不能鑒定到種水平，只能到屬(下表）。
[0061 ] S文魚罐頭商品原料品種鑒定 [00621
[0063] 因此需要獲得更大的片段。針對=文魚罐頭進行引物篩選W擴增分別是212bp、 358bp和47化P的目的片段，擴增結果如圖2A-圖2C:其中圖2A是212bp目的片段擴增結果；圖 2B是358bp目的片段擴增結果；W及圖2C是472bp目的片段擴增結果。
[0064] 根據電泳結果，發現在當目的片段為212bp時，所有樣品均能獲得較好的擴增，并 且基于該片段的測序分析能夠將=文魚罐頭鑒定至種水平。
[0065] 最后應當說明的是，W上實施例僅用于說明本發明的技術方案而非限制，盡管參 照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可W對發明的 技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在 本發明的權利要求范圍內。
【主權項】
1. 一種從三文魚罐頭中提取DNA的方法，其包括使用含有CTAB的DNA提取液。2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述DNA提取液中含有4 %的CTAB。3. 根據權利要求1所述的方法，其中所述DNA提取液的組成為：4 % CTAB、1 OOmmo 1 /L Tris-HCl(pH 8.0)、1.4mol/L NaCl、20mmol/L EDTA(pH 8.0)。4. 根據權利要求3所述的方法，其包括稱取一定質量的三文魚罐頭樣品，加入適量氯 仿：甲醇:水混合溶液，室溫靜置過夜，離心，棄上清，并用無菌去離子水清洗樣品。5. 根據權利要求4所述的方法，其中氯仿：甲醇:水混合溶液是氯仿：甲醇:水=1: 2:0.8 (體積比）的混合液。6. -種擴增三文魚罐頭中細胞色素 C氧化酶亞基I(COI)基因的部分序列的方法，其包 括以權利要求1-5中任一項所述的方法提取的DNA為模板進行PCR擴增。7. 根據權利要求6所述的方法，其中擴增所用的引物對序列如下：上游引物序列： TGTAAAACGACGGCCAGTTCCACTAATCACAARGATATTGGTAC;下游引物序列： CAGGAAACAGCTATGACGAAAATCATAATGAAGGCATGAGC〇8. 根據權利要求6所述的方法，其中PCR擴增的條件為：95 °C預變性2min ; 95 °C變性 111^11，46°(：退火1111丨11，72°(：延伸3〇8,5個循環；95°(：變性1111丨11，53°(：退火1111丨11，72°(：延伸3〇8， 35個循環；72°C延伸5min;反應體系為 10XPCR buffer 2.5yL，dNTP 0.2mmol/L，上游引物 0 · 8pmol/L，下游引物0 · 8pmol/L，DNA 模板200ng，Taq酶 1 · 5U，用ddH20將總體積補充至 25yL。9. 根據權利要求6-8中任一項所述的方法，其中所述細胞色素 C氧化酶亞基I(COI)基因 的部分序列的大小為212bp。10. 根據權利要求6-9中任一項所述的方法所擴增的產物在鑒別三文魚罐頭中三文魚 品種中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838708SQ201610282830
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】孟鎮, 仇凱, 鐘其頂, 安麗艷, 楊彤輝
【申請人】中國食品發酵工業研究院