一種從福壽螺肌肉組織中提取總rna的方法
【專利摘要】本發明涉及一種從福壽螺肌肉組織中提取總RNA的方法。包括以下步驟：（1）取新鮮福壽螺肌肉組織用DEPC水沖洗，放入液氮，在液氮條件下研磨成細粉狀，然后轉移到含有細胞裂解液的離心管中；（2）冰浴條件下，向步驟（1）中的離心管中加酸性水飽和酚，搖勻，加醋酸鈉，以及氯仿和異戊醇混合液，冰浴；（3）離心，分離沉淀相和液相；（4）轉移液相到新的離心管中，加氯仿、異戊醇混合液；（5）離心，取上清，加等體積異丙醇沉淀；（6）離心，棄上清液，加1-1.5mL乙醇洗滌沉淀；（7）重復步驟（6）1-2次，空氣干燥，加50-100μL無RNA酶水溶解沉淀，得到福壽螺肌肉組織總RNA溶液。本發明收率高，并且純度高、質量完整性好，可以滿足分子生物學研究應用。
【專利說明】
一種從福壽螺肌肉組織中提取總RNA的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，涉及淡水軟體生物總RNA的提取，尤其涉及種從福 壽螺肌肉組織中提取總RNA的方法。
【背景技術】
[0002] 總RNA (核糖核酸）分離純化技術是分子生物學研究技術的基礎，從組織中提取純 度穩定、完整性好、重復性高、無污染的總RNA的分離純化方法，是決定后續實驗結果質量 的關鍵。
[0003] 福壽螺又名大瓶螺、蘋果螺，原產于南美洲亞馬遜河流域。1980年前后，因其蛋白 質含量豐富，營養成分高且繁殖能力強，而被作為一種水生經濟動物被引入臺灣、菲律賓和 日本，并迅速擴散到東亞和東南亞其余國家（Halwart，1994)。后來由于市場化失敗，福壽 螺遭棄養并迅速擴散結果暴發成災，嚴重危害作物生產（Naylor，1996)。2000年，世界自 然保護耳關盟（World Conservation Union; International Union for Conservation of Nature and Natural Resources; IUCN)外來入侵物種專家委員會將福壽螺列為世界100種 惡性外來入侵物種之一（Lowe et al.，2000)，也是其中唯一的一種淡水螺。在我國大陸， 福壽螺于1981年引入到廣東養殖，1984年后在廣東、廣西、福建等地開始廣泛養殖，隨后 推廣到浙江、江西、云南、四川等地，目前已成為長江以南大部分省區的嚴重農業害蟲（俞 曉平等，2001)。2003年，國家環保總局和中國科學院（2003)將福壽螺列入了首批入侵中 國的16種外來物種的"黑名單"。傳統的防治如農業防治和物理防治外，如何從分子水平 上揭示福壽螺的入侵機制，開發新的防治途徑已經成為福壽螺研究的重點。
[0004] 目前，有針對性的分離純化福壽螺組織總RNA的方法較少，用傳統方法提取的福 壽螺組織總RNA含量少，穩定性差，容易污染，無法滿足后續的實驗要求。
【發明內容】
為了解決現有淡水軟體生物總RNA提取技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一 種從福壽螺肌肉組織中提取總RNA的方法，為福壽螺的分子生物學研究提供技術支持和保 障。
[0005] 本發明通過以下技術方案完成： (1) 取新鮮福壽螺肌肉組織用DEPC水沖洗3-5次，放入液氮，在液氮條件下研磨成細粉 狀，然后轉移到含有〇. 3 - 0. 5mL細胞裂解液的離心管中； (2) 冰浴條件下，向步驟（1)中的離心管中加入酸性水飽和酚，搖勻，加0. 1-0. 2mL醋酸 鈉，0. 1-0. 2mL氯仿和異戊醇混合液，冰浴15min ; (3) 4°C離心，分離沉淀相和液相； (4) 轉移液相到新的離心管中，加等體積氯仿、異戊醇混合液； (5) 離心，取上清，加等體積異丙醇-20°C沉淀； (6) 離心，棄上清液，加1-1. 5mL75%乙醇洗滌沉淀； (7) 重復步驟（6) 1-2次，空氣干燥，加50-100 μ L無 RNA酶水溶解沉淀，得到福壽螺肌 肉組織總RNA溶液。
[0006] 所述的細胞裂解液組成為：異硫氰酸胍：24重量份；十二烷基硫酸鈉0. 4重量份； 尿素0. 4重量份；氯化鈉0. 2重量份，加入25重量份DEPC水，定容至50體積；所述的水飽 和酚使用量為細胞裂解液的1/2 ;所述的氯仿、異戊醇混合液中的氯仿：異戊醇為24:1 ;所 述的醋酸鈉溶液的濃度為3mol/l，pH值為5. 2 ;所述的氯仿、異戊醇混合液的加入量與細 胞裂解液的體積相等；所述的離心速度為12000rpm。
[0007] 本發明適用于小量淡水軟體生物組織的RNA提取，方法簡單有效，適合分子生物 學研究應用。具體有益效果如下：1、操作步驟簡單、方便。2、RNA得率高；3、RNA純度高。
【附圖說明】
[0008] 圖1為本發明方法所提總RNA電泳圖。
[0009] 圖2為傳統Trizol法提取總RNA電泳圖。
[0010] 圖3為用本發明提取總RNA為模板，PCR電泳圖。
【具體實施方式】
[0011] 以下結合實例對本發明作進一步的詳細說明： 實施例所采用的試劑和設備 DEPC (焦碳酸二乙酯）水：雙蒸水中加0. 1%的DEPC搖勻后室溫過夜，再進行高溫高壓 滅菌即可。
[0012] 細胞裂解液：準確稱取異硫氰酸胍24g,十二烷基硫酸鈉0. 4g,尿素0. 4g,氯 化鈉0. 2g，加入25mL高溫高壓滅菌處理過的DEPC水，再定容到50mL。
[0013] pH值為5. 2的3mol/L醋酸鈉溶液：無水醋酸鈉12. 42g，DEPC水30mL溶解，冰醋 酸調pH值到5. 2,加水定容至50mL。
[0014] 氯仿：異戊醇混合液：吸取24mL氯仿，加入lmL異戊醇混勻。
[0015] 75%乙醇：取75mL無水乙醇，加 DEPC水至100mL即得75%乙醇。
[0016] 實施例1 (1) 取新鮮福壽螺肌肉組織l〇〇mg用DEPC水沖洗3或5次，放入液氮，在液氮條件下研 磨成細粉狀，然后轉移到含有〇. 5mL細胞裂解液的離心管中； (2) 冰浴條件下，向步驟（1)中的離心管中加0. 25mL酸性水飽和酚，搖勻，加0. 05mL醋 酸鈉，再加〇. 5mL氯仿、異戊醇混合液，混勻，冰浴15min; (3) 4°C，12000rpm離心10min，分離沉淀相和液相； (4) 轉移液相到新的1. 5mL離心管中，加等體積氯仿、異戊醇混合液； (5) 4°C，12000rpm離心10min，取上清，將上清轉移到新的1. 5mL離心管中，加等體積異 丙醇-20°C沉淀30min ; (6) 4°C，12000rpm離心10min，棄上清液，沉淀加 lmL75%乙醇洗滌沉淀； (7) 重復步驟（6) 1或2次，空氣干燥，加無 RNA酶水溶解沉淀，得到福壽螺肌肉組織總 RNA溶液。
[0017] 為了檢測所提總RNA的質量，用1 %的瓊脂糖凝膠甲醛變性電泳檢測，發現總 RNA的純度高（圖1 )、完整性較好，并且產量高.總RNA中的mRNA足以進行Northern印 跡及雜交分析、cDNA合成等反應，從電泳圖上可以看到提取出來的RNA沒有RNA的污染， 還可以很清楚的看到28S與18S的比值約為2 : 1，表明沒有RNA降解，且純度高。
[0018] 實施例2 各種實驗方法的比較： 見下表
從上表可以看出，本發明所述RNA提取方法提取的RNA的0D260/0D280及0D260/0D230 的比值都在理想的范圍內，而用傳統的Trizol提取法提取的淡水軟體生物福壽螺的RNA的 0D260/0D280及0D260/0D230的比值與標準值有一定差距。這說明，本發明方法獲得的RNA 質量更高，純度、完整度更好，能完全滿足后續分子生物學實驗。
[0019] 實施例3總RNA的逆轉錄及TSP基因的擴增 采用上海生工生物提供的cDNA Synthesis Kit進行逆轉錄。用本發明提取的福壽螺 肌肉組織總RNA為模板，利用隨機引物在反轉錄酶的作用下合成cDNA.然后進行PCR反應， 反應條件如下：94° C預變性3min;然后94° C變性30s，55° C退火30s，72° C延伸 lmin，共35個循環；最后72° C延伸lOmin。所得的PCR產物均用1.0%的瓊脂糖凝膠 電泳分析。
[0020] 反應體系如下： 10XPCR Buffer 5μ 1 dNTP Mixture (each 2. 5mM) 4 μ 1 模板DNA 2 μ 1 Primer F (10 μ Μ) 1 μ 1 Primer R (10 μ Μ) 1 μ 1 TaKaRa Taq (5U/μ 1) 0.25 μ 1 加 ddH20 Up to 50 μ 1 電泳結果如圖3,獲得了全長2300bp左右的目標片段。因此，用本發明方法提取的總 RNA獲得成功。
【主權項】
1. 一種從福壽螺肌肉組織中提取總RNA的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 取新鮮福壽螺肌肉組織用DEPC水沖洗3-5次，放入液氮，在液氮條件下研磨成細粉 狀，然后轉移到含有〇. 3 - 0. 5mL細胞裂解液的離心管中； (2) 冰浴條件下，向步驟（1)中的離心管中加入酸性水飽和酚，搖勻，加0. 1-0. 2mL醋酸 鈉，0. 1-0. 2mL氯仿和異戊醇混合液，冰浴15min ; (3) 4°C離心，分離沉淀相和液相； (4) 轉移液相到新的離心管中，加等體積氯仿、異戊醇混合液； (5) 離心，取上清，加等體積異丙醇-20°C沉淀； (6) 離心，棄上清液，加1-1. 5mL75%乙醇洗滌沉淀； (7) 重復步驟（6) 1-2次，空氣干燥，加50-100 μ L無 RNA酶水溶解沉淀，得到福壽螺肌 肉組織總RNA溶液。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞裂解液組成為： 異硫氰酸胍 24重量份， 十二烷基硫酸鈉 〇. 4重量份， 尿素 0. 4重量份， 氯化鈉 0. 2重量份， 加入25重量份DEPC水，定容至50體積。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水飽和酚使用量為細胞裂解液的 1/2。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的氯仿和異戊醇混合液中的氯仿：異 戊醇為24:1。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的醋酸鈉溶液的濃度為3mol/l，pH 值為5.2。6. 根據權利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的氯仿和異戊醇混合液的加入量 與細胞裂解液的體積相等。7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心速度為12000rpm。8. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的DEPC為焦碳酸二乙酯。
【文檔編號】C12N15/10GK105838707SQ201510021161
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月16日
【發明人】劉光富, 許益鵬, 楊倩倩
【申請人】中國計量學院