一種造血干細胞無血清培養基的制作方法
【專利摘要】本發明的目的在于提供一種造血干細胞無血清培養基，成分包括，細胞因子組合、DMEM培養液、胰島素、轉鐵蛋白、BMP?4、谷胱甘肽、FGF?2和生長激素。所述細胞因子組合包括IL?3，IL?6，SCF和FL，濃度分別為：IL?3：1?20ng/ml；IL?6：1?100ng/ml；SCF：1?100ng/ml；FL：1?100ng/ml。通過研發無血清培養基、改變造血因子的加入順序，解決目前造血干細胞培養基現有技術的弊端。
【專利說明】
一種造血干細胞無血清培養基
技術領域
[0001 ]本發明涉及生物領域，尤其涉及一種造血干細胞無血清培養基。
【背景技術】
[0002] 造血干細胞在體液循環中發揮關鍵作用：一方面，體液中各種血細胞都是由造血 干細胞分化而來；另一方面，體液中的血細胞更新和補充也依賴于造血干細胞的增值和分 化。隨著個性化再生醫學技術的興起，造血干細胞在抗衰老及疾病治療方面起著日益重要 的作用現在臨床用于糖尿病、腫瘤、免疫系統疾病以及缺血性組織壞死的治療，造血干細胞 移植也用于腫瘤放化療后的支持治療，以提高腫瘤治療效果，降低復發率。
[0003] 而造血干細胞培養如何實現快速擴增又不影響其功能是造血干細胞培養的關鍵， 然而現有技術中培養造血干細胞技術不夠成熟，表現在細胞的增殖速度慢和傳代次數較 低。
[0004] 現有的干細胞培養基中添加了胎牛血清(FBS)和動物來源的生長因子。然而這些 動物來源的成分會在臨床上引起很多潛在的危險：（1)含有的免疫原和毒蛋白能激發免疫 反應，發生免疫排斥，比如，體外培養帶有動物來源Neu5GC抗體的細胞，移植到人體內后會 產生嚴重的免疫排斥反應。動物來源組分擴增的細胞一直到人體內后會引起嚴重的過敏反 應和免疫排斥反應；⑵增加了病原微生物污染干細胞的危險性，包括病毒和細菌感染、朊 病毒和未知的動物傳染病;不利于干細胞的臨床應用和基礎研究。
[0005] 造血干細胞的增值分化、發育成熟過程相當復雜，依賴于各種造血因子的調節，其 中細胞刺激因子發揮的作用極為關鍵。ΙΠ 型酪氨酸激酶受體配體(flt3-ligand FL)是最近 幾年發現的一種調節早期造血的細胞因子，主要生物活性表現為刺激早期造血干細胞的增 值與分化。白細胞介素3(InterleUkin3 IL-3)有利于造血細胞的生長和活性維持，然而對 造血干細胞早期增值分化有抑制效應。
[0006] 通過研發無血清培養基、改變造血因子的加入順序，解決目前造血干細胞培養基 現有技術的弊端。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種無血清的造血干細胞培養基。
[0008] 為實現本發明的目的，本發明提供了以下技術方案：
[0009] -種造血干細胞無血清培養基，成分包括，細胞因子組合、DMEM培養液、胰島素、轉 鐵蛋白、BMP-4、谷胱甘肽、FGF-2和生長激素。
[0010] 所述細胞因子組合包括IL-3，IL-6，SCF和FL，濃度分別為：IL-3 l-20ng/ml; IL-6 l-100ng/ml；SCF l-100ng/ml；FL l-100ng/ml〇
[0011] 轉鐵蛋白的濃度為0 · 05-0 · 15μg/ml; BMP-4的濃度為0 · 05-0 · 15ng/ml;所述多肽濃 度為100-300μg/ml;其特征在于所述FGF-2濃度為5-15ng/ml;所述生長激素濃度為1 -20ng/ ml 〇
[0012] 胰島素濃度為5-15μg/ml。
[0013] 所述DMEM培養液為高糖型DMEM培養液，葡萄糖濃度為3000mg/L-4500mg/L。
[0014] 所述的DMEM培養液包括以下組分:無水氯化鈣、無水硫酸銅、九水硝酸鐵、七水硫 酸亞鐵、氯化鉀、氯化鎂、無水硫酸鎂、氯化鈉、無水磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、七水硫酸鋅、 L-精氨酸鹽酸鹽、L-胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸鹽酸鹽、L-異亮氨酸、L- 亮氨酸、L-賴氨酸鹽酸鹽、L-蛋氨酸、次黃嘌呤、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-丙氨 酸、L-天門冬酰胺、D-葡萄糖、L-天門冬氨酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-色 氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、亞油酸、硫辛酸、酚紅、維生素 B12、l，4-丁二胺二鹽酸鹽、丙酮酸 鈉、維生素 H、D-泛酸鈣、氯化膽堿、胸苷、葉酸、i-肌醇、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、鹽酸吡哆淳、核 黃素、鹽酸硫胺。
[0015] 所述的DMEM培養液各組分的濃度為： 無水氯化興 90- 120mg/L 無水硫酸銅 a 001-0, Θ02 mg/L 九水硝酸鐵 0.03-0. 07 mg/L 七水硫酸亞鋏 Q. 3-α· 5 rag/L 氯化鉀 300-4QQ mg/L 氯化鎂 卽-35 mg/L 無水硫酸鎂 40-60 mg/L
[0016] 氯化鈉 8000 fflg/L 無水磷酸二氫鈉 熱-55. m_g/L. 磷酸氫二鈉 63-80 .mg/L 七水硫酸鋅 0. 4-0. 5: mg/L L-精氨酸鹽酸鹽 100-200 mg/L L-胱氨酸鹽酸鹽 20-4(3 mg/L L-谷氨酰胺 30:0-姐0 mg/.L 甘氨酸 10-3? mg/L L-亮氨酸 《-60 fflg/L L-賴氨酸鹽酸鹽 80-100. mg/L L-蛋氨酸 l5-.22:mg./L 次黃嘌呤 卜3 mg/L L-苯丙氨酸 30-40 mg/L L-絲氨酸 2:0-30 mg/L L-蘇氨酸 40-60 mg/L L-丙_ 氛酸 _3-& mg/L L_天門冬酰胺 ：5-1Θ mg/L D-葡萄糖 300:0-450:0 mg/L L-天門冬氨酸 5-7 mg:/L L-半胱氨酸鹽酸鹽 10-20. mg/L L-谷氨酸 5_:9_ mg/L
[0017] L-脯氨酸 15-20 mg/L L-色氨酸 ：8-1_Q :mg/L L_ 釀氨酸 30-45. mg/L L_顯氣酸 45-55 m:g./L 亞油酸 0· 03-0. 05 mg/L 硫辛酸 0. 1-0. 15 mg/L 酚紅 7-10 mg/L 維生素 B12 0. 5-lmg/L 1，4-丁二胺二鹽酸鹽 Ο. 05-0：. 1 mg/L： 丙酮酸鈉 4:0-.60 mg/L 維生素 Η 0. 003-0, 04 mg/L D-泛酸鈣 2-3 mg/L 氯化膽堿 7-9 mg/L 胸背 0, 3-0：. 4 trig/i, 葉酸 2:-4 _mg/L i-肌醇 m-20 mg/L 煙酰胺 1· 5-:2:, 5 rag:/L
[0018] 鹽酸吡哆醛 1-3: mg./L 鹽酸吡哆淳 Θ, 02-0:, Θ4 mg/L 核黃素 （λ 1-0. 3 mg/L 鹽酸硫胺 .1. 5-2. 5 mg/L。
[0019] -種造血干細胞無血清培養基的使用方法，培養造血干細胞過程如下:a、在制備 好DMEM培養液中按濃度加入胰島素、轉鐵蛋白、BMP-4、谷胱甘肽、FGF-2和生長激素制作成 培養液;b、在24孔板中進行培養，每孔lml培養液，接種接種所需的造血干細胞，接種密度為 lX105cells/ml，于37°C、5%C02的全飽和濕度下培養;c、培養第一周加入IL-3+IL-6+SCF; 第7天同時加入FL直到第四周結束;第14d起停用IL-3。
[0020] 補充說明
[0021 ] FL是(flt3-ligand)III型酪氨酸激酶受體配體；
[0022] IL-3 是 Interleukin3 白細胞介素 3;
[0023] IL-6 是 Interleukin6 白細胞介素 6;
[0024] SCF是stem cell factor干細胞因子；
[0025] BMP-4是Bone Morphogenetic Protein骨形態發生蛋白4;
[0026] DMEM是(Dulbeco's Modified Eagle Medium)杜爾伯科極限必需培養基；
[0027] FGF-2是Fibroblast Growth Factor 2成纖維細胞生長因子2;
[0028] FBS是胎牛血清；
[0029] 凋亡率=凋亡陽性的細胞數/細胞總數X 100%。
[0030] 有益效果:本發明通過研發無血清培養基，即培養基中不加胎牛血清，從而避免了 臨床應用中可能產生的免疫排斥反應，減少了病原微生物污染的風險;通過改變造血因子 的加入順序，可減弱FL對造血干細胞早起增值的抑制作用，提高造血干細胞在體外增殖分 化的活性，降低細胞凋亡率。
【具體實施方式】
[0031] 按照表格1配制高糖型DMEM培養液
[0032] 表1高糖型DMEM配方表
[0033]
[0034] a、配制造血干細胞培養液:在DMEM培養液中按濃度加入胰島素、轉鐵蛋白、BMP-4、 谷胱甘肽、FGF-2和生長激素制作成造血干細胞培養液；
[0035] b、加入細胞因子:實驗分成五個組，第一組為不加 IL-3的對照組，第二組為不加 FL 的對照組，第三組為四種細胞因子同時加入，不分先后順序，第四組為本發明造血干細胞培 養方法，第五組為空白對照實驗，四種細胞因子均不加，具體情況如下：
[0036] 第一組 IL-6+SCF+FL
[0037] 第二組 IL-3+IL-6+SCF
[0038] 第三組 IL-3+IL-6+SCF+FL
[0039] 第四組培養第一周加入IL-3+IL-6+SCF;第7天同時加入FL直到第四周結束;第14d 起停用IL-3;
[0040]其中細胞因子的濃度為IL-3 5ng/ml，IL-6 50ng/ml，SCF 50ng/ml，FL 50ng/ml; [00411 c、接種造血干細胞:培養試驗在24孔板中進行，每孔lml培養液，接種純化的AC133 +細胞，接種密度為1 X l05ce 11 s/ml，于37°C、5%C02的全飽和濕度下培養。在培養開始及第 7天、14天、21天、28天分別計算細胞總數。
[0042]結果統計與分析：
[0043] AC133+細胞在不同細胞因子組合刺激下擴增倍數
[0044]
[0045] 結果分析:細胞擴增方面，除了第四組外，其他組合都在培養21d時擴增倍數達到 最高，隨后出現下降，且在21d時都小于第四組擴增倍數，第四組的最高擴增倍數為培養28d (9847.2倍)時。說明本發明組合擴增效果最好。
[0046] AC133+細胞在不同細胞因子組合刺激下細胞凋亡情況比較（％ )
[0047]
[0048] 結果分析:結果二:在細胞凋亡方面，都在培養至14d達到最高，以后有所下降。第 四組的最高凋亡率為（?=6. 1) %，低于其他組合，說明本發明組合凋亡率最低。
[0049] 以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到的變化或替換，都應 涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權利要求的保護范圍為準。
【主權項】
1. 一種造血干細胞無血清培養基，其特征在于:成分包括，細胞因子組合、DMEM培養液、 膜島素、轉鐵蛋白、BMP-4、谷脫甘膚、FGF-2和生長激素。2. 根據權利要求1所述的一種造血干細胞無血清培養基，其特征在于:所述細胞因子組 合包括化-3,化-6，SCF和化，濃度分別為：化-3 l-20ng/ml;化-6 l-100ng/ml;SCF 1- lOOng/ml;化 l-lOOng/ml。3. 根據權利要求1所述的一種造血干細胞無血清培養基，其特征在:轉鐵蛋白的濃度為 0.05-0.15μg/ml; BMP-4的濃度為0.05-0.15ng/ml;所述多膚濃度為 100-300μg/ml;其特征 在于所述FGF-2濃度為5-15ng/ml;所述生長激素濃度為l-20ng/ml。4. 根據權利要求1所述的一種造血干細胞無血清培養基，其特征在于:膜島素濃度為5- 15μ邑/ml。5. 根據權利要求1所述的一種造血干細胞無血清培養基，其特征在于:所述DMEM培養液 為高糖型DMEM培養液，葡萄糖濃度為3000mg/l-4500mg/L。6. 根據權利要求1所述的一種造血干細胞無血清培養基，其特征在于:所述的DMEM培養 液包括W下組分:無水氯化巧、無水硫酸銅、九水硝酸鐵、屯水硫酸亞鐵、氯化鐘、氯化儀、無 水硫酸儀、氯化鋼、無水憐酸二氨鋼、憐酸氨二鋼、屯水硫酸鋒、1^-精氨酸鹽酸鹽、iHt氨酸 鹽酸鹽、心谷氨酷胺、甘氨酸、k組氨酸鹽酸鹽異亮氨酸、k亮氨酸、心賴氨酸鹽酸鹽、L- 蛋氨酸、次黃嚷嶺α-苯丙氨酸、1^-絲氨酸、1^-蘇氨酸α-丙氨酸、1^-天口冬酷胺、D-葡萄糖、 k天口冬氨酸、k半脫氨酸鹽酸鹽、k谷氨酸脯氨酸色氨酸酪氨酸鄉氨酸、亞 油酸、硫辛酸、酪紅、維生素 B12、l ,4-下二胺二鹽酸鹽、丙酬酸鋼、維生素 H、D-泛酸巧、氯化 膽堿、胸巧、葉酸、i-肌醇、煙酷胺、鹽酸化唉醒、鹽酸化唉淳、核黃素、鹽酸硫胺。7. 根據權利要求1所述的一種造血干細胞無血清培養基，其特征在于:所述的DMEM培養 液各組分的濃度為： 無氷氯化探撕-120fflg義 無水硫酸銅 0、日01-日.觸2 mg./L 九氷硝酸鐵 0.聰-0. 07 mg/L -屯水硫酸亞鐵 0. 3-Q. & mg/L 氯化鐘 泌0-撕Θ I雌化 氯化摸 20-3日mg:/L 無水硫酸鎊 40-60 .雌凡 氯化鋼 6舶0-沸腑mg/l 無水憐酸二氨納 犧-旅mg/L 稱酸氨鋼 扣-80 mg/L 古水硫酸巧 日.4-日.日in呂·/! k精氨酸鹽酸鹽 100-幼0 mg/L, 心脫氯酸祐酸祐 20-4.0 mg/L L·-谷氨醜胺 孤0-400 mg/L 甘氨酸 10-30 mg化 心寮氯酸 40-60 mg/L L-賴氨酸鹽酸鹽 80-100 mg/L ^蛋氨酸 1日-22mg化 次黃囑嶺 1-3 mgA 心苯巧氨酸 30-40 m'g:/L ^絲氯酸 淡-撕鵬凡 心蘇氨酸 奶-測mg/L L·-丙氨酸 3-日mg/L ^天|'1冬醜胺 日-K) mg/L D-葡萄糖 3000-4加0 I嗤/L 心天口冬氨酸 自-7 mg/L 心半脫氨酸鹽酸盛 10-20 mg/L 以巧氮酸 日-9 mg/L k脯氨酸 15-如mg/L 心色氨酸 S-10 mg/L 心酪氨酸 3Q-45 mg/L k鄉氨酸 45-日日mg/L 亞油酸 0.朋-0. 0日mg/L 硫親酸 0. H0.巧mg凡 酪紅 7-10阻霞凡 維生素 M2 0. 5-lmg/L 1，4-下二胺二鹽酸鹽 0. 05-0. 1 ra呂/L 丙酬酸納 婚-鈍 mg/L 維生素 Η 0.003-0.04 mg/L D-泛酸巧 2-3 mg/L 氯化膽堿； 7-9 mg/L 胸巧 0.過-自.4 mg/L 葉酸 2-4 mg/L i-肌醇 10-2日 mg/L 煙醜胺 1. 5-2. 5嚇凡 鹽酸恥唉酸 1-3班齡α 鹽酸化峻淳 化胎-0. 04 m呂凡 核黃素 0. 3 mg/L 鹽酸硫胺 1.5哨.5峭凡。8.-種權利要求1-7任一項所述的造血干細胞無血清培養基的使用方法，其特征在于： 培養造血干細胞過程如下:a、在制備好DMEM培養液中按濃度加入膜島素、轉鐵蛋白、BMP-4、 谷脫甘膚、FGF-2和生長激素制作成培養液;b、在24孔板中進行培養，每孔1ml培養液，接種 接種所需的造血干細胞，接種密度為lXl〇5cells/ml，于37°C、5%C02的全飽和濕度下培養； C、培養第一周加入比-3+a-6+SCF;第7天同時加入化直到第四周結束;第14d起停用比-3。
【文檔編號】C12N5/0789GK105838675SQ201610398475
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】張嚴冬, 謝海濤, 李相魯, 孟建軍
【申請人】廣東萬海細胞生物科技有限公司