一種免疫抑制劑誘導調節性cd8+t細胞體外擴增的方法
【專利摘要】本發明涉及一種免疫抑制劑誘導調節性CD8+T細胞體外擴增的方法，所述的方法為CD8+T細胞在TGF?β和RAPA的聯合誘導下擴增。本發明還提供一種具有免疫抑制功能的CD8+Treg細胞及其應用。其優點表現在：本發明首次在CD8+T細胞多克隆體外擴增體系中添加TGF?β和RAPA，并成功獲得了大量具有顯著的體外抑制功能的CD8+Treg細胞；隨著多輪擴增的進行，不僅在細胞數上能達到指數級增長，從而達到臨床細胞治療需求；并且其活性、純度、表型、無能性、抑制功能等都能維持穩定。可用于過繼性輸注治療多種自身免疫性疾病，臨床運用潛力巨大。
【專利說明】
一種免疫抑制劑誘導調節性CD8+T細胞體外擴増的方法
技術領域
[0001] 本發明涉及免疫學技術領域，具體地說，是一種免疫抑制劑誘導調節性CD8+T細胞 體外擴增的方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，CD8+調節性T細胞(Regulatory T cells,Tregs)因其強大的免疫抑制功 能已成為針對Treg細胞家族研究的熱點，而基于CDS+Tregs的細胞治療也作為一種新興的 潛在治療手段備受關注。
[0003] 有研究發現，與傳統CD4+Tregs相似，CD8+Tregs不僅持續表達Foxp3這一 Treg細胞 的標志性功能轉錄因子，還表達〇)103、〇)25丄044、61了1?、〇)621^、？381^、(：1'1^-4等分子。2006 年，Uss E.等發現，整合素家族成員⑶103是⑶8+Tregs的一個功能分子，主要介導細胞與細 胞、細胞與細胞外基質的相互粘附。另外，其它與功能相關的膜蛋白（如CD39、PD-1、CCR7等） 也相繼被發現在⑶8+Foxp3+Tregs上表達，并證實與其功能密切相關。CD8+Foxp3+Tregs具有 顯著的體外抑制功能，所涉及的抑制機制也呈現多樣化。有研究表明，⑶8+Foxp3+Tregs可通 過細胞間接觸機制起抑制作用，涉及CTLA-4、Fas-FasL等多個關鍵分子介導的免疫抑制途 徑;也可通過分泌一些抑制性細胞因子，如IL-HKTGF-β等，調節微環境中的免疫平衡，從而 發揮免疫負調控作用。另外，CD8 + LAG3+Foxp3 + Tregs可通過分泌趨化因子配體4(CC Chemokine Ligand 4，CCL4)，直接抑制T細胞的增殖，減弱免疫應答反應。同時，CD8+Foxp3+ Tregs也能通過調節其他細胞類型，如⑶4+Tregs、B細胞、樹突狀細胞(Dendritic cells， DCs)、濾泡輔助性T細胞(Follicular Helper T cells，Tfh)等發揮免疫抑制效應。這些研 究表明，CD8+F〇Xp3+Treg細胞可通過多種途徑協同發揮免疫抑制功能，實現對微環境的免疫 負調控。可見，與傳統的⑶4+Tregs相比，CD8+Tregs具有更有效、更穩定的抑制功能，能在促 進免疫耐受、調節機體穩態中發揮更積極的作用。
[0004] 同時，多項臨床研究結果表明，與正常人相比，在類風濕關節炎 (RheumatoidArthritis，RA)、系統性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE)、多 發性硬化(Multiple sclerosis，MS)、I型糖尿病（Type IDiabetes Mellitus，IDM)、自身免 疫性腎炎(autoimmune nephritis)等多種自身免疫性疾病患者體內，外周血中Treg的數 量雖然沒有減少，但CD8+Treg的功能明顯減弱。可見這些自身免疫性疾病的發生與⑶8+ Tregs功能的缺陷具有明顯相關性。目前，自身免疫性疾病多因無法明確病因及發病機理而 很難治愈，嚴重影響患者生活質量，甚至危及生命。而現在針對自身免疫病的治療方案多為 使用糖皮質激素和免疫抑制劑。但長期使用糖皮質激素和免疫抑制藥物會降低人體的整體 免疫功能，造成患者容易受病原體感染以及誘發腫瘤的產生。因此，有必要尋求新的能促進 免疫耐受、平衡機體免疫系統的治療方法。近年來，基于多種耐受型免疫細胞(如間充質干 細胞、CD4+Tregs、耐受型DCs等）的細胞治療備受關注，并在多種自身免疫性疾病動物模型 中被證實有效。其中，有些過繼性輸注的細胞治療方法已進入臨床試驗階段，有力的證明了 細胞治療具有臨床運用的可行性和有效性。因此，可以設想，作為與自身免疫病密切相關的 CD8+Tregs能誘導免疫耐受，必將成為耐受型細胞治療療法的"優勢作用細胞"。基于⑶8+ Tregs的過繼性治療將成為治療自身免疫性疾病的潛在治療方法，有巨大的臨床運用前景。
[0005] 由于⑶8+Foxp3+Tregs在人體內含量很少，需經過體外誘導擴增后才有可能滿足臨 床細胞治療需求。而目前CD8 + F〇Xp3 + TregS體外多克隆擴增還缺乏有效的方法。 Gunnlaugsdottir B等采用anti_CD3抗體、IL_2、TGF_01誘導擴增臍帶血單個核細胞生成 CD103+CD8+Tregs細胞，誘導3天后CD25hiFoxp3+細胞占 CD8+T細胞的比例小于30%，其中 ⑶103+細胞的比例約為60% diegmund K等從外周血幼稚⑶8+T細胞中采用anti-CD3抗體、 IL-2、TGF-0誘導CD8+Foxp3+T細胞生成，誘生的CD8+Foxp3+T細胞高表達CD25和CD28,分泌較 高水平的TNF-cuIFN-γ、顆粒酶B，不分泌IL-17A，CD8+Foxp3+T細胞對CD4+效應T細胞體外擴 增有較弱的抑制作用。另外，Suzuki Μ等發現⑶8+T細胞在較低強度的⑶3和IL-15刺激下能 夠誘生CD45RA+CCR7+F0XP3+Tregs。這種CD8+Tregs對幼稚型CD4效應Τ細胞的抑制作用較強， 對記憶型⑶4效應T細胞的抑制作用較弱。
[0006] 目前已有文獻報道了體外大量擴增抗原特異性⑶8+⑶28+Foxp3+Tregs的方法。 Zheng J等采用⑶40活化的B細胞從幼稚⑶8+T細胞中有效地誘導擴增獲得⑶8high和⑶81?兩 群細胞，其中CD8high細胞具有抗原特異性抑制CD4+效應T細胞增殖的能力及較弱的細胞毒殺 傷作用。誘導擴增過程不需要添加其他細胞因子，內源性產生的IFN-γ、IL-2、IL-4、CTLA-4 對⑶8+Tregs的誘導擴增起重要作用。另外他們還通過輸注人PBMC建立了人同種異基因 GVHD人源性小鼠模型來模擬骨髓移植后GVHD的發生。體外誘導擴增的⑶8highTregs以CTLA- 4依賴的方式通過抑制同種異基因反應性T細胞增殖，同時對腫瘤細胞也有殺傷作用。但這 種體外擴增的方法存在的問題是擴增時間較長，擴增后的CD8hlghTregS需要用流式細胞儀 分選，難以符合GMP要求。
[0007] 雖然抗原特異性Treg細胞具有免疫反應專一性強，不影響機體正常抗病原體以及 抗腫瘤的功能，但是由于大部分自身免疫性疾病還未找到特異性抗原，以及在很多治療過 程中不能及時獲得供體APC或者等待較長的體外擴增時間，因此，抗原特異性Treg細胞廣泛 的臨床應用目前還較難實現。另外對于多克隆Treg細胞是否會引起機體廣泛的免疫抑制反 應目前還存在爭議，因為美國和意大利血液病專家已完成了兩項體外擴增臍血和外周血 CD4+Tregs抑制GVHD的I期臨床試驗，證明過繼性輸注第三方無關供者以及多克隆Treg細胞 對病人是安全的，對GVHD的發生具有抑制作用并且不會增加病毒感染和腫瘤復發的風險。 因此，建立⑶8+F〇Xp3+TregS體外多克隆擴增的方法具有很重要的臨床應用價值，將推動⑶8 +TregS相關細胞治療領域的發展。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種免疫抑制劑誘導調節性CD8+細 胞體外擴增的方法，從而便捷而高效的獲得具有穩定抑制功能的調節性CD8+細胞，以滿足 臨床需求。
[0009] 本發明的再一的目的是，提供一種具有免疫抑制功能的調節性CD8+T細胞。
[0010] 本發明的另一的目的是，提供一種具有免疫抑制功能的調節性CD8+T細胞的應用。
[0011] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案是:一種調節性CD8+T細胞體外擴增的方 法，所述的方法為CD8+T細胞在TGF-β和雷帕霉素 (Rapamycin，RAPA)的聯合誘導下擴增。
[0012]所述的方法為CD8+T細胞多克隆體外擴增體系中添加 TGF-β和RAPA誘導擴增。
[0013]所述的CD8+T細胞多克隆體外擴增體系中包含白細胞介素-2(IL-2)。
[0014]所述的⑶8+T細胞多克隆體外擴增體系采用包被anti-CD3/CD28抗體的磁珠和IL- 2擴增。
[0015] 所述的TGF-β為轉化生長因子1 (TGF-βΙ)。
[0016]所述的CD8+T細胞為人CD8+T細胞。所述的CD8+T細胞的來源包括人外周血單個核細 胞、臍血單個核細胞、經動員后的外周血單個核細胞、骨髓細胞。
[0017] 所述的方法采用人外周血單個核細胞中新鮮分離的⑶8+T細胞在Anti-CD3/CD28 包被的磁珠刺激下，同時添加 IL-2，在TGF-βΙ、RAPA聯合誘導條件下進行培養。
[0018] 為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是：一種具有免疫抑制功能的調 節性CD8+T細胞，所述的具有免疫抑制功能的調節性CD8+T細胞為TGF-β和RAPA聯合誘導的調 節性CD8+T細胞。
[0019] 為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是:所述的具有免疫抑制功能的 調節性CD8+T細胞在針對自身免疫性疾病的細胞治療療法中的應用。
[0020] 所述的自身免疫性疾病包括類風濕關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化、I型糖 尿病、自身免疫性腎炎等。
[0021] 本發明優點在于：
[0022]本發明建立了一種新的人⑶8+Treg細胞的體外擴增方法，即首次在⑶8+T細胞多克 隆體外擴增體系中添加 TGF-β和RAPA，并成功獲得了大量具有顯著的體外抑制功能的CD8+ Treg細胞。TGF-i3/RAPA聯合誘導的⑶8+Treg細胞隨著多輪擴增的進行，不僅在細胞數上能 達到指數級增長，從而達到臨床細胞治療需求;并且其活性、純度、表型、無能性、抑制功能 等都能維持穩定。可用于過繼性輸注治療多種自身免疫性疾病，臨床運用潛力巨大。
【附圖說明】
[0023]附圖1A: CD8+Treg-TR體外四輪擴增之每輪擴增倍數(R1-R4為第一至第四輪，η = 6)；
[0024] 附圖IB: CD8+Treg-TR體外四輪擴增之細胞總量(R0為起始接種量，R1-R4為第一至 第四輪，n = 6)。
[0025] 附圖2A:體外擴增的CD8+Treg-TR細胞CD8/CD25雙陽性率(Fresh為新鮮分離的CD8+ T細胞，R1、R4分別為單輪擴增和四輪擴增的⑶8+Treg-TR，n = 3,圖為其中一組數據）；
[0026] 附圖2B:體外擴增的CD8+Treg-TR細胞Foxp3陽性率(R1、R4分別為單輪擴增和四輪 擴增的CD8+Treg-TR，η = 3，圖為其中一組數據）；
[0027]附圖2C:體外擴增的CD8+Treg-TR細胞表面分子陽性率(R1、R4分別為單輪擴增和 四輪擴增的CD8+Treg-TR，n = 3);
[0028] 附圖2D:體外擴增的CD8+Treg-TR細胞活性(η = 3，圖為其中一組數據）。
[0029] 附圖 3:CD8+Treg-TR 對 CD4+效應 Τ 細胞增殖的抑制率(CD8+Treg-TR:CD4+T = 0:1，1: 1，1:4，1:16，1:64，11 = 3，圖為其中一組數據）。
【具體實施方式】
[0030]下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0031 ]本發明米用人外周血單個核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC) 中新鮮分離的⑶8+T細胞在Anti-⑶3/⑶28包被的磁珠刺激下，同時添加 IL-2,在TGF-βΙ、雷 帕霉素(Rapamycin，RAPA)聯合誘導條件下進行培養，并進行多輪重復刺激的廣譜擴增。實 驗結果表明，TGF-i3/RAPA聯合誘導的CD8+Treg細胞(CD8+Tregs-TR)可在體外大量擴增并具 有顯著的體外抑制功能，并且隨著多輪擴增的進行，其活性、純度、表型、無能性、抑制功能 等維持穩定。
[0032] 實施例1 [0033]材料：
[0034] 健康人單個核細胞(PBMC);AB血型人血清;淋巴細胞分離液(Ficoll);1640培養 液;磷酸鹽緩沖液(PBS);胎牛血清(FBS);人⑶8+細胞分選試劑盒;Anti-⑶3/⑶28單克隆抗 體包被的免疫刺激磁珠；重組人白細胞介素2(IL-2);轉化生長因子l(TGF-m);雷帕霉素 (RAPA)〇 [0035]方法：
[0036] 1 ·人⑶8+T細胞的分離與純化(無菌環境）
[0037] 1.1用Ficoll密度梯度離心法分離白膜血中的PBMC細胞
[0038] 將一個單位的白膜血3500rpm離心15min;吸取離心后的濃縮白細胞層，用原血漿 稀釋，混勻后緩慢重懸于Ficol 1上，密度梯度離心后將白細胞層吸出；加入PBS洗滌，獲得 PBMC細胞。
[0039] 1.2用人⑶8+T細胞分選試劑盒進行分選
[0040]使用人CD8+T細胞分選試劑盒，按其說明書，用免疫磁珠陽性分選步驟從PBMC細胞 中分選獲得CD8+T細胞:每1 X 107個PBMC細胞中加入80yL的含2%FBS的PBS(FBS-PBS)和20yL 人⑶8+T細胞分選磁珠，4°C，孵育20min;FBS-PBS洗滌后，細胞懸液過磁柱;打出吸附在磁柱 上的細胞，即⑶8+T細胞。
[0041 ] 2.人⑶8+Tregs-TR細胞的體外誘導與多輪擴增(無菌環境）
[0042] 2.1將分選獲得的⑶8+T細胞懸于含1%AB血清的RPMI-1640培養液中，細胞濃度為 1 X 105/mL;加入細胞因子混合液（含有TGF-β 125ng/mL、RAPA0 · 2yg/mL、IL-21600U/mL)和 Anti-⑶3/⑶28單克隆抗體包被的免疫刺激磁珠(磁珠:細胞= 4:1);接種于96孔U型底培養 板，終體積為l〇〇yL/孔;置于37°C、5%⑶2及飽和濕度的條件下進行培養，記為第0天。每隔 兩天進行半量換液。
[0043] 2.2以"6天擴增+1天靜息"記為一個輪次；重復刺激四輪后，收集細胞，即為CD8+ Treg-TR 細胞。
[0044] 3.人CD8+Treg_TR細胞的生物學特征檢測
[0045] 3.1對獲得的⑶8+Tregs-TR進行計數，計算擴增倍數。
[0046] 3.2流式細胞術檢測0)8+1'代88-了1?細胞的表面分子(0)103、0)25、0039、(：1'1^-4等） 和Foxp3的陽性表達率。
[0047] 3.3Annexin V/PI-流式細胞術檢測細胞的凋亡/死亡率。
[0048] 3.4流式細胞術測定0)8+1'代88-了1?胞內細胞因子（1?^丫、11^4、幾-2、11^17)的表 達情況。
[0049] 3.5將⑶8+Tregs-TR與CFSE標記的⑶4/⑶8效應T細胞按不同比例混合培養，加入 anti-⑶3/⑶28抗體刺激后，流式細胞術檢測培養前后CFSE+細胞比例，根據CFSE損耗程度 計算效應T細胞被抑制程度。
[0050] 結果：
[0051 ] 1.通過TGF-0/RAPA聯合誘導可獲得大量的CD8+Tregs-TR
[0052]實驗研究表明，CD8+T細胞多克隆體外擴增體系中（采用包被anti-CD3/CD28抗體 的磁珠和IL-2擴增）添加 TGF-β和RAPA能夠誘導擴增得到大量的CD8+CD103+Foxp3+Tregs (⑶8+Tregs-TR)，在體外培養8天后擴增20-30倍。以"6天擴增+1天靜息"為一個擴增輪次進 行四輪刺激后，可獲得大量的表型和功能穩定的⑶8+Tregs-TR。對⑶8+Tregs-TR計數并統計 后發現，各輪擴增倍數(R1 = 15.42±1.73，R2 = 15.32±1.33，R3 = 14.58±2.09，R4 = 11.58 ±0.77，圖1A)之間無顯著差異，說明⑶8+Tregs-TR細胞隨著體外多輪擴增的進行，其擴增 能力并未下降。經四輪擴增后，細胞總數可達原始接種細胞數的10000倍以上(最大擴增能 力，圖1B)，說明TGF-i3/RAPA聯合誘導的CD8+Tregs-TR可在體外進行多輪擴增，獲得滿足臨 床治療需求的細胞量。
[0053] 2.體外誘導擴增的CD8+Treg-TR純度高、表型穩定、活性強
[0054]收集TGF-i3/RAPA聯合誘導單輪擴增和四輪擴增的CD8+Treg-TR細胞(分別為R1和 R4)，通過流式細胞術進行表型檢測。流式結果表明：CD8+CD25+雙陽性率為Rl = 99.4 土 0.3%，1?4 = 99.2±0.7%(圖2八），卩(《口3陽性率1?1 = 88.4±0.5%，1?4 = 90.4±1.5%(圖28)， 均無顯著性差異。另外，與R1相比，經四輪擴增后R4細胞表面分子⑶28、⑶62L、⑶103的表達 也均無顯著性差異，但⑶39、CD73、⑶152(CTLA-4)的表達量顯著升高（圖2C)，提示經四輪刺 激后CD8+Treg-TR功能可能有所增強。
[0055] 同時，擴增四輪后，通過Annexin V/PI染色檢測發現，CD8+Treg-TR活細胞為93.9 ±1.5%，細胞存活率高（圖2D)。
[0056] 3.體外誘導擴增的CD8+Treg_TR分泌較少的炎性細胞因子
[0057] 我們將⑶8+Treg-TR和⑶8+T效應細胞(對照組)經佛波酯、離子霉素刺激后，對多種 細胞因子進行熒光標記并進行流式檢測。流式結果顯示，與CD8+T效應細胞相比，CD8+Treg- 丁1?分泌較少的11^-2、11^-4、正^丫；表達較高的11^-10。另外，〇)8+1^8-了1?和〇)8 +1'效應細胞均 不分泌IL-17(表1)。
[0058] 表1 CD8+Tregs-TR胞內細胞因子的表達
[0059]
[0060] 注：CD8+Tregs-TR 與 CD8+T 效應細胞比較，*ρ<0·01，#ρ<0·05，η = 3 [0061 ] 4.體外誘導擴增的⑶8+Treg-TR具有較強的免疫抑制功能
[0062] 在CD4+T效應細胞的增殖體系（anti-CD3/28、IL-2刺激）中加入不同比例的CD8+ Treg-TR。共培養4天后，流式檢測結果顯示:Q)8+Treg-TR在各個Treg:Tresp比例下，都能較 強的抑制CD4+T效應細胞增殖；即使當CD8+Treg-TR細胞數較少時(Treg:Tresp比例=1:64)， 仍能發揮有效的抑制作用（圖3)。
[0063]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種調節性⑶8+T細胞體外擴增的方法，其特征在于，所述的方法為⑶8+T細胞在TGF-β和RAPA的聯合誘導下擴增。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法為CD8+T細胞多克隆體外擴增體 系中添加 TGF-β和RAPA誘導擴增。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的CD8+T細胞多克隆體外擴增體系中包 含IL-2。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的CD8+T細胞多克隆體外擴增體系采用 包被anti-⑶3/⑶28抗體的磁珠和IL-2擴增。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的TGF-β為TGF-βΙ。6. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CD8+T細胞的來源包括人外周血單個 核細胞、臍血單個核細胞、經動員后的外周血單個核細胞、骨髓細胞。7. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法采用人外周血單個核細胞中新 鮮分離的⑶8+T細胞在Anti-⑶3/⑶28包被的磁珠刺激下，同時添加 IL-2，在TGF-βΙ、RAPA聯 合誘導條件下進行培養。8. -種具有免疫抑制功能的調節性CD8+T細胞，其特征在于，所述的具有免疫抑制功能 的調節性CD8+T細胞為TGF-β和RAPA聯合誘導的調節性CD8+T細胞。9. 根據權利要求8所述的具有免疫抑制功能的調節性CD8+T細胞在制備治療自身免疫性 疾病的藥物中的應用。10. 根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述的自身免疫性疾病包括類風濕關節 炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化、I型糖尿病、自身免疫性腎炎。
【文檔編號】A61P19/04GK105838674SQ201610369644
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】楊潔, 范華驊, 孫娟, 楊懿銘, 謝如鋒, 蔣雪玉, 劉李棟
【申請人】上海市血液中心