用于眼部的干細胞誘導培養液、其制備方法及其應用
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，本發明提供一種用于眼部的干細胞誘導培養液，其包含血管內皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)，所述血管內皮細胞生長因子(VEGF)的含量為0.5?2.5ng/ml，所述堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的含量為0.25?0.4ng/ml，所述表皮生長因子(EGF)的含量為0.5?2.0ng/ml。本發明采用人眼眶脂肪來源的干細胞(ASCs)體外條件培養液對角膜損傷的再生修復發揮著重要的增強作用。
【專利說明】
用于眼部的干細胞誘導培養液、其制備方法及其應用
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種用于眼部的干細胞誘導培養液、其制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]角膜外傷是眼科臨床常見疾病，嚴重時甚至可以致盲。正常的角膜上皮化過程是通過角膜緣上皮基底層干細胞的再生分化完成的。角膜損傷導致角膜上皮缺損，繼發的炎癥反應會影響干細胞增生和迀移，形成血管翳，加重角膜水腫與瘢痕化，角膜渾濁影響透光，甚至造成角膜潰瘍。角膜移植目前仍是臨床角膜盲唯一可靠有效的治療手段。角膜供體一般來源于角膜捐獻者，一方面捐獻者數量有限，另一方面同種異體角膜移植仍然存在術后免疫反應，甚至出現供體排斥而致手術失敗。
[0003]干細胞再生醫學研究的興起為角膜損傷的修復提供了新的治療途徑，其基本方法是將體外培養擴增的自體正常組織細胞，例如角膜緣干細胞、結膜上皮細胞、口腔黏膜細胞等，吸附于一種生物相容性良好并可被機體降解吸收的生物支架，植入機體角膜部位，在支架材料逐步降解過程中，細胞繼續增殖并分泌基質，最終形成相應組織，達到促進角膜上皮再生，修復角膜缺損并重現視力功能的目的。
[0004]脂肪源性干細胞(adipose-derived stem cells，ASCs)是存在于脂肪組織中的一群具有多向分化潛能的成體干細胞，在體外能夠自我更新、不斷增殖，而且可誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨骼肌細胞、血管內皮細胞、心肌細胞及神經細胞等多種類型的細胞。因具有來源豐富、易于培養、多向分化等特點，ASCs在組織創傷修復領域具有良好的應用前景和科研價值。而ASCs在體外培養過程中，會分泌多種生物活性因子，通過旁分泌機制，促進組織創傷的修復。因此，ASCs的條件培養液也具有廣闊的臨床應用前景。
[0005]眼部整形手術是我國整形外科領域開展最廣泛的手術，術中通常會去除部分多余的眼眶脂肪。這種手術切除的眼眶脂肪通常被視為“廢物”而丟棄。醫學研究認為，在胚胎發育過程中，皮下脂肪與內臟脂肪發生于中胚層。而眼眶脂肪則不同，是與眼周組織(包括角膜、結膜、眼球、眼外肌肉與骨骼)一起從外胚層發育而來的。因此，本發明研究人員通過研究發現，眼眶脂肪來源的ASCs在體外培養分化過程中，其分泌的各種細胞因子和生長因子可能會對角膜上皮細胞的生長和修復起到重要作用。
【發明內容】
[0006]為了解決上述問題，本發明提供一種用于眼部的干細胞誘導培養液，能有效促進角膜損傷的再生修復。
[0007]本發明再一目的在于提供該干細胞誘導培養液的制備方法。
[0008]本發明還一目的在于提供該干細胞誘導培養液在用于角膜損傷的再生修復中的應用。
[0009]為了實現本發明目的，本發明提供一種用于眼部的干細胞誘導培養液，其包含血管內皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)，所述血管內皮細胞生長因子(VEGF)的含量為0.5-2.5ng/ml，所述堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的含量為0.25-0.4ng/ml，所述表皮生長因子(EGF)的含量為0.5-2.0ng/ml。
[0010]其中，優選的為，所述血管內皮細胞生長因子(VEGF)的含量為1.0-2.0ng/ml，所述堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的含量為0.3-0.4ng/ml，所述表皮生長因子(EGF)的含量為1.0-2.0ng/ml。
[0011]本發明所述用于眼部的干細胞誘導培養液采用將組織細胞進行ASCs分離培養而成。
[0012]本發明所述的組織細胞，包括但不限于眼眶脂肪細胞、眼周的其他部位的組織細胞(例如角膜緣干細胞、結膜細胞等)；也不局限于眼眶來源的脂肪細胞，可以是身體其它部位的脂肪細胞，例如腹部，大腿，上肢等。
[0013]組織細胞的來源包括人在內的哺乳類動物的組織細胞。
[0014]所述用于眼部的干細胞誘導培養液可采用如下方法制備:
[0015]I)先將脂肪組織去除血管、筋膜等無用組織后，制成糊狀，加入膠原酶消化處理；
[0016]2)然后加入培養基進行中和處理，離心；
[0017]3)棄去上清液后加入細胞培養液進行培養；
[0018]4)再在細胞融合至80?90%時進行消化傳代，待第二代細胞生長至融合狀態時，采用無血清的低糖DMEM培養液最后培養48小時而成。
[0019]為了實現本發明的另一目的，本發明所述用于眼部的干細胞誘導培養液的制備方法，包括如下步驟:
[0020]I)先將脂肪組織去除血管、筋膜等無用組織后，制成糊狀，加入膠原酶消化處理；
[0021]2)然后加入培養基進行中和處理，離心；
[0022]3)棄去上清液后加入細胞培養液進行培養；
[0023]4)再在細胞融合至80-90%時進行消化傳代，待第二代細胞生長至融合狀態時，采用無血清的低糖DMEM培養液最后培養48小時而成。
[0024]其中，步驟I)中，所述組織細胞可先采用無菌PBS沖洗2-4遍，然后用無菌眼科剪剔除血管、筋膜等組織。
[0025]所述膠原酶為I型膠原酶，A型膠原酶或復合型膠原酶，濃度范圍為0.05-0.5%，與組織細胞的體積比范圍1-2: I。
[0026]所述消化處理采用在37°C恒溫搖床中振蕩消化l_20h，振蕩速率為150-250r/min。
[0027]步驟2)中所述培養基為同體積含有10%FBS的低糖DMEM培養基。
[0028]所述離心處理的速率為1500-2000r/min，處理時間為5-10min。
[0029]步驟3)中所述細胞培養液為含有10%_20%胎牛血清(FBS)或小牛血清(CBS)的低糖DMEM培養基、F12細胞培養液，或低糖DMEM與Fl2混合培養液(1:1)，或干細胞專用培養液，無抗生素，培養條件為處于5 % CO2中，溫度設定為37 0C。
[0030]培養過程中可采用每3天換液I次。
[0031]步驟4)中所述消化傳代采用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)進行消化，傳代接種量為以細胞密度5 X 105/ml接種培養。
[0032]本發明采用人眼眶脂肪來源的ASCs體外條件培養液，經研究發現包含多種細胞因子，比如血管內皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)，其具有對角膜損傷的再生修復發揮著重要的誘導作用。
[0033]本發明用于的干細胞誘導培養液在制備治療眼角膜損傷或結膜損傷或其他眼表損傷的藥物中應用。
[0034]經實驗驗證，可以早期促進角膜上皮層的再生修復，重建正常眼表面，防止了病情進一步惡化。術后5天證實ASCs條件培養液處理組的兔眼角膜表面熒光素染色陽性面積較對照組(正常無血清細胞培養液)明顯縮小。術后7天免疫組化測定證實實驗組角膜緣血管內皮細胞生長因子(VEGF)特異性蛋白表達也低于對照組，未見新生血管侵入角膜，患眼視力有明顯提高。為早期臨床治療角膜損傷提供了新的思路。
【附圖說明】
[0035]圖1為本發明堿燒傷后兔角膜實驗組與對照組大體變化觀察對照圖片；
[0036]圖2為本發明實驗組(①)與對照組(②)兔角膜熒光素鈉染色對照圖；
[0037]圖3為本發明實驗組與對照組兔角膜HE染色(X100)對照圖；
[0038]圖4為本發明實驗組與對照組兔角膜VEGF免疫組化染色(X200)對照圖。
【具體實施方式】
[0039]以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限定本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。
[0040]本發明中未標注的試劑和原料均為市場上購買所得。
[0041 ] 實施例1
[0042]本實施例利用人眼眶脂肪組織，體外分離培養ASCs，獲得本發明的細胞培養液。
[0043]然后用氫氧化鈉(NaOH)溶液制造了兔角膜化學燒傷模型，以條件培養液作為滴眼液處理兔角膜化學傷，觀察對角膜炎癥水腫及潰瘍的修復治療效果。
[0044]I材料與方法
[0045]1.1主要儀器與試劑
[0046]胎牛血清(FBS，Gibco公司，美國)，低糖DMEM培養基(HyClone公司，美國)，1型膠原酶(Worthington，美國)，兔抗血管內皮生長因子(VEGF，AbCam，美國)，速眠新II注射液(敦化市圣達動物藥品有限公司，吉林)，鹽酸丙美卡因滴眼液(Alcon，比利時)，熒光素鈉檢測試紙(天津晶明新技術開發有限公司)，0.22μηι濾器(Merck Millipore，愛爾蘭)，裂隙燈顯微鏡(蘇州六六眼科醫療器械有限公司)。
[0047]1.2人ASCs培養液的獲取
[0048]1.2.1脂肪組織來源
[0049]所用脂肪組織來自上海市第十人民醫院整形外科6例行重瞼成形手術的患者，均為健康女性，年齡20?50歲。脂肪獲取量平均為1.2-1.5毫升/例。
[0050]1.2.2人ASCs的分離培養
[0051]本實施例的ASCs分離培養方法如下:將手術切取的脂肪組織用無菌磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solut1n，PBS)沖洗3遍，用無菌眼科剪剔除血管、筋膜等組織后，將脂肪組織剪成糊狀，加入同體積0.1 %1型膠原酶混合后置于50ml離心管中。放入37°C恒溫搖床中振蕩(I 50r/mi η)消化I h。取出離心管后，加入同體積含有1 % FBS的低糖DMEM培養基中和，離心(1500r/min) 5min。棄去上清液，加入適量細胞培養液(含有10 %FBS的低糖DMEM培養基，無抗生素)，混勻后加入無菌培養皿，置于5 %CO2、37°(:培養箱中培養。48小時后首次換液，去除未貼壁細胞，此后每3天換液I次，待細胞融合至80-90 %時進行消化傳代。在傳代中用0.25 %胰蛋白酶和0.02 %乙二胺四乙酸(EDTA)消化，經吹打、離心后，以細胞密度5 X105/ml接種在培養皿內，置于細胞培養箱內培養。
[0052]1.2.3人ASCs細胞培養液的制備
[0053]原代細胞傳至第2代后，每3天半量換液一次，待細胞生長至融合狀態時，更換為含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培養液。48小時后收集換液后的培養液，經過直徑0.22μπι濾器過濾，置于無菌50ml離心管，4°C冰箱保存。培養液一經開啟使用，2周內使用完畢。
[0054]1.2.4細胞培養液中生長因子的測定
[0055]應用酶聯免疫分析法(ELISA)測定條件培養液中血管內皮細胞生長因子(VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)含量。首先用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體。包被單抗的微孔中加入相應抗原，經過結合、洗滌后加入酶標抗抗體，洗滌后用顯色劑顯色。顏色的深淺和樣品中的生長因子含量呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(0D值)，計算樣品濃度。并以單純無血清培養液作為對照。
[0056]本實施例人眼眶脂肪組織來源的ASCs體外培養液包含的VEGF、bFGF與EGF的含量均明顯高于對照組培養液，濃度分別為(I.457 ± 0.82)ng/ml、(0.254 ± 0.088 )ng/ml和(1.085±0.506)ng/ml。而對照組培養液的上述因子濃度接近為O值。
[0057]實施例2
[0058]本實施例采用氫氧化鈉(NaOH)溶液制造兔角膜化學燒傷模型。以實施例1培養液作為滴眼液處理兔角膜化學傷，觀察對角膜炎癥水腫及潰瘍的修復治療效果。
[0059]I兔角膜堿燒傷模型的制備
[0060]1.1實驗動物健康純種新西蘭大白兔由上海市第十人民醫院動物實驗中心提供的，4月齡，共6只，雌雄不限，體重2.0?2.5kg，無眼疾。
[0061 ] 1.2制作兔角膜堿燒傷模型
[0062]實驗兔經全身麻醉后(速眠新lmg/kg肌肉注射)，鹽酸丙美卡因滴眼。眼瞼撐開器開瞼，棉簽吸除結膜囊多余液體。將直徑1mm形濾紙浸泡于lmol/L的NaOH溶液中Imin，用鑷子將浸泡后濾紙貼于兔角膜中央表面30秒。取下濾紙后，用50ml生理鹽水溶液(0.9%氯化鈉)快速沖洗角膜及結膜囊內多余的NaOH。如角膜中央區直徑I Omm范圍內變為白色圓形渾濁區，不可透見虹膜，則為兔角膜堿燒傷造模成功。
[0063]I實驗動物的分組處理
[0064]采用自身對照原則，兔的左眼設為實驗組，右眼為對照組。實驗組角膜堿燒傷造模后即刻用實施例1的ASCs條件培養液滴眼，每次0.3ml，2次/天，連續7天。
[0065]對照組用0.3ml未經培養過細胞的培養液(含有1 % FBS的低糖DMEM培養基，無抗生素)滴眼，2次/天，連續7天。
[0066]2觀察指標
[0067]2.1大體觀察
[0068]術后每天滴藥前檢查角膜渾濁程度、角鞏膜緣新生血管的情況，并拍照記錄。
[0069]2.2角膜上皮熒光素鈉染色
[0070]術后5天角膜經熒光素鈉染色，在裂隙燈顯微鏡鈷藍色光照射下照相，比較角膜上皮缺損面積。
[0071]2.3角膜組織學檢測
[0072]術后7天經兔耳緣靜脈空氣栓塞處死全部實驗動物。無菌條件下摘除兔雙側眼球，沿角鞏膜緣外Imm剪下角膜和部分球結膜，PBS溶液沖洗后固定于4%多聚甲醛溶液。常規脫水包埋，垂直于角膜切片(5μπι)，蘇木素-伊紅(HE)染色后置于光學顯微鏡下觀察。
[0073]2.4免疫組化法檢測兔缺損角膜VEGF的表達
[0074]免疫組織化學染色采用PowerVis1n TM二步法免疫組化檢測系統。具體方法如下:①切片常規脫蠟至水;②3%H202室溫浸泡lOmin，阻斷內源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次，每次5min；③熱修復抗原:將切片浸入0.0lM枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)，電爐加熱至沸騰1.5min。冷卻后蒸餾水洗滌2次，每次5min;④滴加1: 500稀釋的一抗(兔IgGhfCSS13PBS(PH7.2?7.6)洗滌3次，每次5!!^11;?滴加山羊抗兔186抗體-!11^多聚體，201^11，？83沖洗3次，每次5min;⑥DBA顯色:使用DBA顯色試劑盒(AR1022)。室溫顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌;⑦蘇木素輕度復染。梯度酒精脫水，透明，封片。免疫組化染色結果在普通光學顯微鏡下觀察，觀察陽性細胞及新生血管情況。
[0075]3 結果
[0076]3.1兔角膜堿燒傷術后大體觀察
[0077]堿燒傷術后即刻，可見兔角膜中央一圓形白色渾濁區域，不能透見虹膜，局部球結膜充血。術后2天實驗組兔角膜表面白色渾濁均勻分散，水腫程度較對照組輕，角膜緣未見長入刷狀毛細血管;術后4天實驗組兔角膜渾濁程度減輕，可透見瞳孔輪廓，瞼結膜和球結膜未見明顯充血水腫。對照組術后4天內全角膜渾濁不清，角膜緣出現新生血管，球結膜和結膜穹窿毛細血管充血腫脹。術后6天實驗組兔角膜較對照組渾濁范圍縮小，角膜透明度增高，瞳孔明顯清晰，可見虹膜紋理。對照組兔角膜不透明，角膜緣仍有水腫充血，如圖1所示。
[0078]3.2兔角膜堿燒傷術后熒光素鈉染色
[0079]堿燒傷術后5天行兔角膜熒光素鈉染色檢測。裂隙燈顯微鏡檢查發現實驗組的角膜上皮缺損范圍局限，熒光素鈉染色陽性(黃染區域)的上皮缺損面積明顯縮小，邊界清楚。對照組可見大范圍連續黃色染色區域，邊界不清，缺損面積較大，角膜明顯水腫，如圖2所不O
[0080]3.3堿燒傷術后兔角膜HE染色
[0081]術后7天兔角膜組織HE染色，鏡下可見實驗組角膜上皮細胞連續相間，基質層纖維組織排列整齊，未見明顯炎癥細胞浸潤和血管增生，后彈力層和內皮細胞層完整。對照組角膜基質全層松散，纖維組織間隙較大，后彈力層脫離，如圖3所示。
[0082]3.4堿燒傷術后兔角膜VEGF染色
[0083]堿燒傷術后7天兔角膜標本切片后行VEGF免疫組織化學染色。實驗組鏡下可見角膜中央和角鞏膜緣前1/2基質層的新生血管內皮細胞及炎癥細胞胞質淺棕黃色染色，VEGF表達輕度陽性;新生血管數量增多且血管管腔增大，周圍錯雜排列的膠原纖維深至基質層后1/3。對照組可見角鞏膜緣前1/2基質層炎癥細胞數量增多，胞質染深棕黃色，膠原纖維粗大且排列無序，VEGF陽性表達率明顯高于實驗組，如圖4所示。
[0084]4.結論
[0085]角膜由上皮層、前彈力層、基質層、后彈力層和內皮層組織構成。其中，角膜上皮是一種非角化鱗狀上皮，厚約50μπι?90μπι，有4?6層細胞，排列規整。完整的角膜上皮形成隔離外界環境和角膜基質之間的天然屏障。角膜上皮細胞代謝旺盛，細胞更新每天可達到總數的1/7。凋亡細胞通過角膜緣干細胞不斷分化增殖予以補充。當角膜損傷波及角膜緣，破壞干細胞達到一定程度，將造成無足夠的角膜上皮細胞補充來源，此時周邊結膜上皮發生向心性生長、角膜血管化和上皮復發性糜爛，導致持續性上皮缺損、基質新生血管化和無菌潰瘍等嚴重眼角膜疾病。
[0086]在研究過程中，發現兔角膜化學堿燒傷導致角膜上皮缺損。本發明采用人眼眶脂肪來源的ASCs體外條件培養液進行臨床治療，結果發現可以早期促進角膜上皮層的再生修復，重建正常眼表面，防止了病情進一步惡化。術后5天證實ASCs培養液處理組的兔眼角膜表面熒光素染色陽性面積較對照組(正常細胞培養液)明顯縮小。術后7天免疫組化測定證實實驗組角膜緣血管內皮細胞生長因子(VEGF)特異性蛋白表達也低于對照組，未見新生血管侵入角膜，患眼視力有明顯提高。從而為早期臨床治療角膜損傷提供了新的思路。
[0087]ASCs在體外培養過程中能夠分泌多種生長因子，通過旁分泌機制對細胞的分化增殖與創傷修復等具有重要作用。鑒于眼眶脂肪與眼表角膜、結膜等組織都來源于外胚層的發生發育，因此推測眼眶脂肪來源的ASCs分泌的細胞因子可能對角膜損傷的再生修復發揮著重要的誘導作用。實驗結果證實細胞條件培養液中的一些細胞因子，例如VEGF、bFGF和EGF含量明顯增高，能夠增強角膜上皮細胞的增殖、促進角膜損傷的再生修復。因此，相較于單一應用的商品化生產的細胞生長因子，ASCs條件培養液更具有臨床應用前景。總之，本實施例為ASCs條件培養液治療角膜損傷等眼表疾病提供了新的方法與技術，有望將來開發一種新的眼科用藥或治療方法。
[0088]本發明范圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的范圍之內。
【主權項】
1.一種用于眼部的干細胞誘導培養液，其特征在于，其包含血管內皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子，所述血管內皮細胞生長因子的含量為0.5-2.5ng/ml，所述堿性成纖維細胞生長因子的含量為0.25-0.4ng/ml，所述表皮生長因子的含量為0.5-2.0ng/ml。2.根據權利要求1所述的用于眼部的干細胞誘導培養液，其特征在于，所述血管內皮細胞生長因子的含量為1.0-2.0ng/ml，所述堿性成纖維細胞生長因子的含量為0.3-0.4ng/ml，所述表皮生長因子的含量為1.0-2.0ng/ml。3.根據權利要求1或2所述的用于眼部的干細胞誘導培養液，其特征在于，所述用于眼部的干細胞誘導培養液采用將組織細胞進行ASCs分離培養而成。4.根據權利要求3所述的用于眼部的干細胞誘導培養液，其特征在于，所述組織細胞包括但不限于眼眶脂肪細胞、眼周的其他部位的組織細胞以及身體其它部位的脂肪細胞;組織細胞的來源包括人在內的哺乳類動物的組織細胞細胞。5.根據權利要求1-4任意一項所述的用于眼部的干細胞誘導培養液，其特征在于，所述用于眼部的干細胞誘導培養液采用如下方法制備: 1)先將脂肪組織去除血管、筋膜等無用組織后，制成糊狀，加入膠原酶消化處理； 2)然后加入培養基進行中和處理，離心； 3)棄去上清液后加入細胞培養液進行培養； 4)再在細胞融合至80-90%時進行消化傳代，待第二代細胞生長至融合狀態時，采用無血清的低糖DMEM培養液最后培養48小時而成。6.制備權利要求1-5任意一項所述的用于眼部的干細胞誘導培養液的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 1)先將脂肪組織去除血管、筋膜等無用組織后，制成糊狀，加入膠原酶消化處理； 2)然后加入培養基進行中和處理，離心； 3)棄去上清液后加入細胞培養液進行培養； 4)再在細胞融合至80-90%時進行消化傳代，待第二代細胞生長至融合狀態時，采用無血清的低糖DMEM培養液最后培養48小時而成。7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟I)中，所述組織細胞先采用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗2-4遍。8.根據權利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述膠原酶為I型膠原酶，A型膠原酶或復合型膠原酶，濃度范圍為0.05-0.5%,與組織細胞的體積比范圍1-2: I。9.根據權利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，步驟3)中所述細胞培養液為含有10 %-20 %胎牛血清或小牛血清的低糖DMEM培養基、F12細胞培養液，或低糖DMEM與F12混合培養液(1:1 )，或干細胞專用培養液。10.權利要求1-5任意一項所述用于的干細胞誘導培養液在制備治療眼角膜損傷或結膜損傷或其他眼表損傷的藥物中應用。
【文檔編號】A61P27/02GK105838672SQ201610294415
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】劉廣鵬, 廖彩荷, 許益聘, 譚健, 韓芳, 葉信海
【申請人】上海市第十人民醫院