一種自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系及其建立方法
【專利摘要】本發明公開了一種自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系及其建立方法，利用剛出生未哺乳仔豬口腔黏膜上皮組織進行原代培養、連續傳代培養，最終獲得一株純度高、穩定性好的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系。本發明獲得的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系生長迅速、性能穩定，第110代的細胞仍保持著原代細胞的形態特征，核型分析表明細胞沒有發生突變。本發明構建的永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系為連續傳代后自發形成，不存在外源基因的插入和基因突變，作為疫苗研發中的基質細胞，沒有生物安全風險。本發明的細胞系可以為分子生物學和病毒學研究提供一個良好的細胞模型，也可用于豬源病毒疫苗的研發。
【專利說明】
一種自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系及其建立方法
技術領域
[0001 ]本發明屬于細胞生物學技術領域，尤其涉及一種自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系及其建立方法。
【背景技術】
[0002]自然條件下，病毒、細菌等病原體入侵宿主大都是通過口鼻途徑。口腔黏膜上皮細胞作為動物免疫系統的第一道防線，是病毒、細菌感染宿主遇到的最早的一類細胞。口腔黏膜上皮細胞表面表達多種模式識別受體，能夠識別大多數入侵病原表達的病原體相關分子模式，口腔黏膜免疫是機體天然免疫的重要組成部分。
[0003]口腔黏膜上皮細胞體外培養存在很大的困難，傳代次數有限，細胞穩定性、均一性很差，極大地限制了相關科學研究和應用。目前國內外尚未有自發永生化的口腔黏膜上皮細胞系報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系及其建立方法，旨在解決口腔黏膜上皮細胞體外培養存在的傳代次數有限，細胞穩定性、均一性很差，極大地限制了其應用的問題。
[0005]本發明是這樣實現的，一種自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法，所述自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法包括:
[0006]首先將未哺乳的仔豬麻醉后，心臟采血致死。酒精消毒，剪取面頰部位對應的口腔上皮組織，無菌條件下PBS漂洗數遍，除去肉眼可見的非上皮組織，將口腔上皮組織剪成
0.2cm X I cm組織塊，移入離心管中，加入2.5mg/mL DispaseII溶液；
[0007]然后將組織剪成小塊，PBS漂洗，離心，接種于培養板，加入原代培養用生長液，置于培養箱中進行培養，每日觀察細胞形態及生長情況；
[0008]原代細胞生長至80 %?90 %融合時，吸去培養液，I3BS洗一遍，加入0.25 %胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓脫落時，加入含10%血清的培養基終止消化，消化后的細胞按1:2或1: 3的比例進行傳代，置于37°C/5%C02條件下培養，當細胞再次生長至80%?90 %融合時，繼續傳代培養，當傳代細胞能夠度過衰老危機傳代超過50代時，獲得自發永生化的細胞系。
[0009]進一步，所述PBS含600IU/ml雙抗，5yg/mL的兩性霉素B。
[0010]進一步，所述加入2.5mg/mLDispaseII溶液，4°C消化 18?20h;
[0011 ] 所述PBS漂洗3遍，1000r/min離心5min，接種于96孔培養板，靜置lOmin。
[0012]進一步，所述置于37°C、5%CO2培養箱中進行培養，24h觀察有無細菌污染，每3d換一次液，每日動態觀察細胞形態及生長增殖情況，培養7?12d。
[0013]本發明的另一目的在于提供一種所述自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法建立的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系。
[0014]本發明提供的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系及其建立方法，利用剛出生尚未吃初乳的新生仔豬口腔黏膜上皮組織進行原代培養、傳代培養最終獲得一株純度高、穩定性好的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系。本發明獲得的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系生長迅速、性能穩定，傳代110代以后的仍保持著原代細胞的形態特征，核型分析表明細胞沒有發生突變。本發明構建的永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系為連續傳代后自發形成，不存在外源基因的插入和基因突變，作為疫苗研發中的基質細胞，沒有生物安全風險。本發明的細胞系可以為分子生物學和病毒學研究提供一個良好的細胞模型，也可用于豬源病毒疫苗的研發。。本發明通過不斷傳代培養，最終獲得了一株自發永生化的仔豬口腔黏膜上皮細胞系；自發永生化的細胞系能夠為研究口蹄疫病毒、豬水泡病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的入侵、復制、致病等機理提供一個可供選擇的細胞模型，并為相關病原疫苗的研發提供了基礎材料。
[0015]與現有技術先比，本發明有以下進步:
[0016]1.本發明的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系是保持著正常豬口腔黏膜上皮細胞的基本生物學特性，是研究口蹄疫病毒、豬水泡病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的入侵、復制、致病等機理的理想的細胞模型。
[0017]2.本發明自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞是通過正常體細胞自發永生化獲得的，不是通過轉基因等細胞工程手段所得，在作為研發豬源病毒疫苗的基質細胞，不存在生物安全隱患。
[0018]3.本發明的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系，形態均一，生長迅速，解決了原代豬口腔黏膜上皮細胞培養難的問題。
【附圖說明】
[0019]圖1是本發明實施例提供的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法流程圖。
[0020]圖2是本發明實施例提供的組織塊法培養的原代仔豬口腔黏膜上皮細胞示意圖。
[0021]圖3是本發明實施例提供的永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系第100代示意圖。
[0022]圖4是本發明實施例提供的間接免疫熒光鑒定角蛋白表達示意圖。
[0023]圖5是本發明實施例提供的核型分析結果照相示意圖。
[0024]圖6是本發明實施例提供的核型分析結果染色體配對示意圖。
[0025]圖7是本發明實施例提供的第80代永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞致瘤實驗示意圖。
[0026]圖8是本發明實施例提供的Hela細胞致瘤實驗示意圖。
[0027]圖9是本發明實施例提供的永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系第95代細胞周期分布示意圖。
【具體實施方式】
[0028]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。
[0029]下面結合附圖對本發明的應用原理作詳細的描述。
[0030]如圖1所示，本發明實施例的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法包括以下步驟:
[0031]SlOl:將未哺乳的仔豬麻醉后，心臟采血致死，酒精消毒，剪取面頰部位對應的口腔上皮組織，無菌條件下PBS(含600IU/ml雙抗，5yg/mL的兩性霉素B)漂洗數遍，除去肉眼可見的非黏膜上皮組織，將口腔黏膜上皮組織剪成0.2cm X I cm組織塊，移入離心管中，加入2.5mg/mL DispaseII溶液，4°C消化18?20h;
[0032]S102:然后將組織剪成<lmm3的組織小塊，PBS漂洗3遍，1000r/min離心5min，接種于96孔培養板，靜置lOmin，小心加入原代培養用生長液，置于37°C、5%C02培養箱中進行培養，24h觀察有無細菌污染，每3d換一次液，每日動態觀察細胞形態及生長增殖情況，培養7?12d;
[0033]S103:原代細胞生長至80 %?90 %融合時，吸去培養液，I3BS洗一遍，加入0.025 %胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓脫落時，加入含10%血清的培養基終止消化，消化后的細胞按1:2或1:3的比例進行傳代，置于37°(:/5%0)2條件下培養。當細胞再次生長至80 %?90 %融合時，繼續傳代培養。
[0034]下面結合具體實施例對本發明的應用原理作進一步的說明。
[0035]實施例1原代培養仔豬口腔黏膜上皮細胞
[0036]將未哺乳的仔豬麻醉后，心臟采血致死，酒精消毒，剪取面頰部位對應的口腔上皮組織，無菌條件下PBS(含600IU/ml雙抗，5yg/mL的兩性霉素B)漂洗數遍，，除去肉眼可見的非黏膜上皮組織，將□腔黏膜上皮組織剪成0.2cm X I cm組織塊，移入離心管中，加入2.5mg/mL Dis pasell溶液，4°C消化18?20h，然后將組織剪成<Imm3的組織小塊，PBS漂洗3遍，1000r/min離心5min，接種于96孔培養板，靜置lOmin，小心加入原代培養用生長液，置于370C,5% CO2培養箱中進行培養，24h觀察有無細菌污染，每3d換一次液，每日觀察細胞形態及生長情況，培養7?12d。原代培養的豬口腔黏膜上皮細胞見圖2，呈典型上皮樣細胞特征。
[0037]實施例2.傳代培養仔豬口腔黏膜上皮細胞
[0038]原代細胞生長至80 %?90 %融合時，吸去培養液，I3BS洗一遍，加入0.25 %胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓脫落時，加入含10%血清的培養基終止消化，消化后的細胞按1:2或1:3的比例進行傳代，置于37°(:/5%0)2條件下培養。當細胞再次生長至80%?90%融合時，用此方法繼續傳代培養。目前細胞已傳代超過100代(圖3)，細胞依然保持著正常上皮細胞的特征。
[0039]實施例3.間接免疫熒光法鑒定細胞類型
[0040]1.鋪板:在24孔細胞培養板孔內放置無菌的蓋玻片0.5cm X 0.6cm，將仔豬口腔黏膜上皮細胞用胰酶消化成單細胞，計數后調整細胞濃度至2X 15個/mL，每孔中接種0.5mL細胞懸液。
[0041 ] 2.固定:待細胞生長至近融合狀態(低密度單層)時，用roS(0.01mol/L，pH 7.4)洗3遍，加入0.4g/L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)，細胞面朝上，室溫固定1min，用PBS洗滌3次，每次3min。
[0042]3.穿透:加入I %的Tri ton穿透液(PBS配制)，37 °C作用15min，用PBS洗滌3次，每次3min。
[0043]4.封閉:5%的脫脂奶粉PBS溶液，37°C，封閉lh。
[0044]5.孵育一抗:用去封閉液，加入1: 300倍稀釋的廣譜角蛋白抗體Ant1-panCytokeratin antibody [PCK-26] (Abcam，貨號ab6401)50yL于蓋玻片上，放入濕盒內4°C過夜。同時滴加等量PBS溶液代替一抗作為陰性對照，用PBS洗滌3次，每次3min。
[0045]6.孵育二抗:棄去PBS，滴加1:100倍稀釋的FITC Goat anti Mouse IgG(H+L)，于37 °C孵育Ih。PBS洗滌3次，每次3min。
[0046]7.核染:用DAPI復染，37 °C、5min。然后立即在熒光顯微鏡下觀察，照相。
[0047]間接免疫熒光結果如圖4所示，細胞被綠色熒光標記，說明仔豬口腔黏膜上皮細胞表達角蛋白，是上皮細胞來源。
[0048]實施例4.核型分析
[0049]1.在培養36h的永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞的細胞瓶中添加秋水仙素溶液，使終濃度為0.2yg/mL，于培養箱中繼續培養5?6h;
[0050]2.倒掉細胞瓶中的培養基，加入2mL 0.25%的胰酶，顯微鏡下觀察細胞變圓脫壁后加入2mL含血清培養基終止消化；
[0051 ] 3.收集細胞于15mL離心管中，1000r/min離心1min;
[0052]4.加入37°C預熱的低滲液(0.075mol/L)5mL，吹打至均勻，37°C水浴15-20min，離心，1200r/min 1min，棄上清;
[0053]5.沿管壁緩慢加入固定液(甲醇:冰乙酸=3:1 )0.5-1.0mL，邊滴加邊震蕩均勻，靜置5min后離心棄上清；
[0054]6.加入3mL固定液，吹打均勻，靜置30min，離心棄上清;再次加入3mL固定液，吹打均勾并靜置30min ；
[0055]7.離心棄上清液，根據細胞數量情況，加入I?2mL固定液，吹打細胞制成懸液，懸液呈微白色時為最佳；
[0056]8.用滴管吸取細胞懸液，高空滴在冰凍玻片(4°C )上，立即在酒精燈的火焰下過火幾次固定，室溫下放置，空氣干燥后，置-20°C保存備用；
[0057]9.Giemsa染色lOmin，清水沖洗染液，用吹風機吹干；
[0058]10.在分裂相區域滴加PBS后，鏡檢，照相，進行核型分析。
[0059]正常豬體細胞有19對染色體。染色體核型分析結果顯示，永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞含有19對38條染色體(圖5、圖6)，沒有發生染色體條數變異，明顯的XY基因型，與細胞取材來源于雄性小豬一致。
[0060]下面結合實驗對本發明的應用效果作詳細的說明。
[0061 ] 細胞致瘤試驗
[0062]動物試驗中使用Hela細胞作為陽性對照，第80代自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞為試驗組進行裸鼠致瘤試驗。具體操作步驟如下:
[0063]1.將處于對數生長期的細胞胰酶消化并計數，調整細胞密度為I X 16個/mL。
[0064]2.用一次性注射器將0.2mL的細胞懸液注射到裸鼠右側后腿臀部。
[0065]3.飼養裸鼠至肉眼可見瘤體。
[0066]4.繼續飼養I?2周，結束實驗，采集數據。
[0067]飼養Sd后，Hela細胞對照組裸鼠接種部位有瘤體形成，而自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞接種的裸鼠，臀部無瘤體形成。通過組織切片，可以看出，實驗組組織仍保持著正常組織的紋理(圖7);對照組細胞成彌散樣分布，排列紊亂，可見大量核分裂相(圖8)。結果表明，自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系沒有致瘤性。
[0068]細胞周期分析
[0069]應用流式細胞術分析自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系第95代的生長周期。具體步驟如下:
[0070]1.將待測細胞樣本制成單細胞懸液，然后1000r/min離心5min，棄上清。
[0071]2.用4°C預冷的70%乙醇固定，4°C保存，至少固定18h。
[0072]3.調整細胞濃度為16個/mL，取ImL細胞懸液，用I3BS洗3次，細胞重懸于ImL PI染液(終濃度為50yg/mL)中，37°C孵育30min，進行流式細胞儀分析。
[0073]細胞周期檢測結果如圖9所示，細胞處于Gl期、S期、G2期的比例分別是67.96%、24.13%、7.91% d期直接反映增殖過程的本質——具有一定時間跨度的大量合成細胞物質以備緊接而至的細胞等分的顯著胞內變化，排除人為的周期阻滯，S期所占比例越多說明細胞的增殖活性越好。由此可知S期所占24.13%的自發永生化細胞具有旺盛的分裂增殖能力。
[0074]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法，其特征在于，所述自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法包括: 首先將未哺乳的仔豬麻醉后，心臟采血致死。酒精消毒，剪取面頰部位對應的口腔上皮組織，無菌條件下PBS漂洗數遍，PBS含600IU/ml雙抗，5yg/mL的兩性霉素B;除去肉眼可見的非上皮組織，將口腔上皮組織剪成組織塊，移入離心管中，加入2.5mg/mL Dispase II溶液； 將表皮組織剪成小塊，PBS漂洗，離心，接種于培養板，加入原代培養用生長液，置于370C,5% CO2條件下培養，每日觀察細胞形態及生長情況； 原代細胞生長至80 %?90 %融合時，吸去培養液，PBS洗一遍，加入0.25 %胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓脫落時，加入含10%血清的培養基終止消化，消化后的細胞按1: 2或1:3的比例進行傳代，置于37 °C、5 % CO2條件下培養，當細胞再次生長至80 %?90 %融合時，繼續傳代培養，當傳代細胞能夠傳代超過50代時，獲得自發永生化的細胞系。2.如權利要求1所述的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法，其特征在于，所述PBS含600IU/ml雙抗，5yg/mL的兩性霉素B。3.如權利要求1所述的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法，其特征在于，所述加入2.5mg/mL Dispase II溶液，4°C消化18?20h; 所述PBS漂洗3遍，1000r/min離心5min，接種于96孔培養板，靜置1min。4.如權利要求1所述的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法，其特征在于，所述置于37 °C,5% CO2培養箱中進行培養，24h觀察有無細菌污染，每3d換一次液，每日動態觀察細胞形態及生長增殖情況，培養7-12d。5.一種如權利要求1?4任意一項所述自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系的建立方法建立的自發永生化仔豬口腔黏膜上皮細胞系。
【文檔編號】C12N5/071GK105838662SQ201610027035
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年1月15日
【發明人】張彥明, 崔紅杰, 郭抗抗
【申請人】張彥明