刺參飼用復合益生菌劑及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種刺參飼用復合益生菌劑及其制備方法，該復合菌劑由3種芽孢桿菌菌液即枯草芽孢桿菌(DL?1)、甲基營養化芽孢桿菌(DL?2)和阿氏芽孢桿菌(DL?3)按照一定添加比例混合而成。將它們分別培養后，按照不同的配比混合后投喂刺參，結果表明：3種菌株最適添加比例為2:3:4，該配比下的復合菌可有效刺參體腔液中的免疫酶和消化酶的活性。本發明所挑選的3株菌株均為益生菌，將它們以科學的配比混合而成的復合菌劑可用于飼料添加劑使用，對刺參的免疫能力及抗應激能力可產生積極的刺激效果。CGMCC No.1125720150820CGMCC No.1125820150820CGMCC No.1125920150820
【專利說明】
刺參飼用復合益生菌劑及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及飼料添加劑技術，具體涉及刺參飼用復合益生菌劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 益生菌(Probiotics)又譯為益生元或益菌素，是通過對有益微生物進行鑒定、篩 選、培養、干燥等一系列工藝制成的一種新型活菌制劑，廣泛用于人類、動物和植物。因其本 身具有無毒副，無殘留、安全性好等特點，因而也常作為一種較好的生長促進劑，添加至動 物飼料中，為養殖動物帶來有益的影響，如促進生長、防治疾病等。近年來，隨著水產養殖業 的快速發展，許多傳統的抗微生物藥物已不能有效防止疾病的發生，這使得益生菌制劑在 水產養殖方面得到了迅速的發展。
[0003] 益生菌在水產養殖中所發揮的作用主要包括以下幾個方面:1)抑制有害微生物的 生長，消除水中過多的有害物質;2)有效調節養殖水體中的微生物群系，制衡有害微生物的 優勢繁殖和發展，使其達到種群相對平衡;3)提高養殖動物的營養水平，增強其免疫力以及 對病害的抵抗能力，從而減少藥物的使用，使養殖形成良性循環，進而達到健康養殖且成活 率高的目的。現今，益生菌株作為水產詞料添加劑，使我們可以利用其特殊代謝能力，解決 當今飼料及養殖業的諸多難題，有效的提高了水產動物生產性能和健康水平，能夠獲得較 好的社會效益和經濟效益。因而將其作為水產飼料添加劑十分符合可持續發展的要求，同 時也是目前飼料業發展的必然方向。
[0004] 然而，目前益生菌雖廣泛應用于養殖生產，但在制備技術上存在諸多問題：1)生產 菌種來源不明，大多數企業生產用的菌種相互轉接，沒有經過分離選育，菌種退化嚴重，生 理活性降低；2)益生菌飼料所含的菌種略顯單一，表現在完全替代抗生素的過程中抗病毒 效果不明顯，在污染嚴重的水質環境中，促生長效果不理想；3)某些現今存在的復合菌種， 配伍缺乏科學依據，單一菌株，雙菌株，甚至多菌株隨意配比，不能說明菌株間配伍的合理 性，達不到菌株優良性狀。
【發明內容】
[0005] 為了解決以上益生菌制劑存在的配伍不科學、協同效果差的問題，本發明提供了 一種配伍科學合理，益生作用更為明顯的飼用復合益生菌劑，能夠廣泛應用于刺參養殖過 程中，并能夠有效刺激刺參體內相關消化酶和免疫酶的活性，促進刺參生長的同時提高刺 參自身的免疫能力，增強其對有害菌的抵抗能力。
[0006] 本發明所述的刺參飼用復合益生菌劑是由3種益生菌分別培養后進一步制備所 得，所述的刺參飼用復合益生菌劑的制備方法，具體為:將保藏編號為CGMCC No. 11257的枯 草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，保藏編號為CGMCC No. 11258的甲基營養化芽孢桿菌 (Bacillus me thy lotrophicus)和保藏編號為CGMCC No · 11259的阿氏芽抱桿菌（Bacillus aryabhattai)分別培養后，離心收集菌體并稱重，再按重量比為2:3:4的比例混合。
[0007] 進一步的，所述的刺參飼用復合益生菌劑的制備方法還包括下述步驟：
[0008] 保藏編號為CGMCC No. 11257的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的培養條件 為:采用LB液體培養基，30~35°C ;鹽度為3~5%，pH為7.0~8.0;
[0009] 保藏編號為CGMCC No. 1 1 2 5 8的甲基營養化芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus)的培養條件為:采用LB液體培養基，20~25°C ;鹽度為3~5%，pH為7 · 0 ~8 · 0;
[0010] 保藏編號為CGMCC No. 11259的阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)的培養條 件為:20~25°C ;采用LB液體培養基，最適鹽度為3~5%，最適pH為7.0~8.0。
[0011] 本發明的另一方面保護利用上述方法獲得的刺參飼用復合益生菌劑。
[0012] 本發明的另一方面保護上述刺參飼用復合益生菌劑在飼喂刺參中的應用。所述的 應用即，將刺參飼用復合益生菌劑按刺參體重的0.2%投喂。
[0013] 本發明的有益效果：
[0014] 能夠將3種菌種按照合理的比例科學配伍，且菌株之間的協同性好，能夠通過提高 多種酶的活性進而有效增強刺參的免疫和消化能力，降低發病率。除此之外，3種菌株經檢 測均無毒性，有利于人們的身體健康和環境保護，符合現代化工業的生產標準。
【附圖說明】
[0015] 圖1.菌株DL-1，DL-2和DL-3對刺參免疫酶和消化酶活性的影響。
[0016] 圖2復合菌株與單株菌株對刺參體內消化酶活性的影響。
[0017] 圖3復合菌株與單株菌株對刺參體內免疫酶活性的影響。
【具體實施方式】
[0018] 下述非限定性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以 任何方式限制本發明。
[0019] 如無特殊說明，本申請所用培養基均由常規方法配制或由商業途徑購買獲得。
[0020] 本發明實施例中所使用的餌料為:海泥40% ;海藻粉40% ;魚粉3% ;大豆蛋白3% ; 海帶粉5% ;貝殼粉5%面粉4% ;，此餌料也可以更換為由商業途徑購買的其他用于刺參養 殖的飼料。
[0021] 上述三種菌株均分離自遼東灣地區健康刺身養殖池塘底泥中，且已于2015年8月 20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心地址為:北京市朝 陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
[0022] 菌株DL-1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，菌株保藏編號為CGMCC No.11257；
[0023] 菌株DL-2為甲基營養化芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)，菌株保藏編號 為CGMCC No.11258;
[0024] 菌株DL-3為阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai)，菌株保藏編號為CGMCC No.11259；
[0025] 2216E液體培養基購于青島海博生物科技有限公司。
[0026] 實施例1
[0027] 將3株菌株分別按其最適生長條件進行培養；
[0028] 1 .DL-1菌制劑的制備方法如下：
[0029]第一步:挑取DL-1單菌落接種到2216E液體培養基中，于27°C150rpm蕩培養24h; [0030]第二步：按照1:20的比例將上述活化后的菌液加入至100mL滅菌的LB液體培養基 中，置于不同溫度條件下（15 °C，20 °C，25 °C，30 °C，35°C )振蕩培養，搖床轉速設定為150rpm， 在培養過程中每隔3h取樣一次，測定菌液于660nm處的吸光值，繪制曲線分析菌體生長的特 性，確定其生長所需的最適溫度。之后，采用同樣的方法分別分析菌體于不同鹽度條件 (3%，5%，7.5%，10%，12.5%)，以及不同？!1環境下(6,6.5,7,8,9)的生長特性，綜合上述 實驗結果確定菌體的最適培養條件。根據繪制的曲線分析:培養DL-1菌株的最適溫度為30 ~35°C ;最適鹽度為3~5%，最適pH為7.0~8.0。
[0031]選取均重為12±0.19g且長勢健康的刺身40頭，暫養一周后將其平均分為兩組即 實驗組和對照組，每組設置一組重復實驗。實驗組須將培養后的DL-1菌株按照每組被試刺 參總體重的0.2%配成干重為0.24g的菌液，添加至餌料中并投喂刺參，餌料的投加量為每 組被試刺參總體重的5%;對照組所投喂的餌料則不添加菌液。連續投喂7天后，分別從實驗 組和對照組中隨機各抽出5頭刺參，反復消毒沖洗后，解剖取其體腔液及腸道，分析每組被 試刺參體內免疫酶和消化酶活性的變化。結果發現，菌株DL-1可有效刺激動物體腔液中相 關消化酶和免疫酶的活性，如實驗組中刺參體內淀粉酶的活性提高了 70%，脂肪酶的活性 提高了5%，而蛋白酶的活性相對于對照組整體提高了 1.5倍;免疫酶中，酸性磷酸酶(ACP) 活性提高了 13%，堿性磷酸酶(AKP)活性提高了 35%、總超氧化物歧化酶(T-S0D)活性提高 了90%，而酸氧化酶(P0)活性提高了84%。
[0032] 2. DL-2菌制劑的制備方法如下：
[0033]第一步：挑取DL-2單菌落并接種到2216E液體培養基中，于27°C 150rpm振蕩培養 24h；
[0034]第二步：按照1:20的比例將上述活化后的菌液加入至100mL滅菌的LB液體培養基 中，置于不同溫度條件下（15 °C，20 °C，25 °C，30 °C，35°C )振蕩培養，搖床轉速設定為150rpm， 在培養過程中每隔3h取樣一次，測定菌液于660nm處的吸光值，繪制曲線分析菌體生長的特 性，確定其生長所需的最適溫度。之后，采用同樣的方法分別分析菌體于不同鹽度條件 (3%，5%，7.5%，10%，12.5%)，以及不同？!1環境下(6,6.5,7,8,9)的生長特性，綜合上述 實驗結果確定菌體的最適培養條件。根據繪制的曲線分析:培養DL-2菌株的最適溫度為20 ~25°C ;最適鹽度為3~5%，最適pH為7.0~8.0。
[0035]選取均重為12±0.19g且長勢健康的刺身40頭，暫養一周后將其平均分為兩組即 實驗組和對照組，每組設置一組重復實驗。實驗組須將培養后的DL-2菌株按照每組被試刺 參總體重的0.2%配成干重為0.24g的菌液，添加至餌料中并投喂刺參，餌料的投加量為每 組被試刺參總體重的5%;對照組所投喂的餌料則不添加菌液。連續投喂7天后，分別從實驗 組和對照組中各隨機抽出5頭刺參，反復消毒沖洗后，解剖取其體腔液及腸道，分析每組被 試刺參體內免疫酶和消化酶活性的變化。結果發現，菌株DL-2可有效刺激動物體腔液中相 關消化酶和免疫酶的活性，如實驗組中刺參體內淀粉酶的活性提高了 18 %，脂肪酶的活性 提高了37%，而蛋白酶的活性相對于對照組整體提高了8倍;免疫酶中，酸性磷酸酶(ACP)活 性相對于對照組提高了5倍，、堿性磷酸酶(AKP)活性提高了84.6%、總超氧化物歧化酶(Τ'- sod) 活性提高了 25 % ， 而酚氧化酶 (P0) 活性提高了 68.7 % 。
[0036] 3.DL-3制劑的制備方法如下：
[0037]第一步：挑取DL-3單菌落并接種到2216E液體培養基中，于27°C 150rpm振蕩培養 24h；
[0038]第二步：按照1:20的比例將上述活化后的菌液加入至100mL滅菌的LB液體培養基 中，置于不同溫度條件下（15 °C，20 °C，25 °C，30 °C，35°C )振蕩培養，搖床轉速設定為150rpm， 在培養過程中每隔3h取樣一次，測定菌液于660nm處的吸光值，繪制曲線分析菌體生長的特 性，確定其生長所需的最適溫度。之后，采用同樣的方法分別分析菌體于不同鹽度條件 (3%，5%，7.5%，10%，12.5%)，以及不同？!1環境下(6,6.5,7,8,9)的生長特性，綜合上述 實驗結果確定菌體的最適培養條件。根據繪制的曲線分析:上述DL-3菌株的培養適溫為20 ~25°C ;最適鹽度為3~5%，最適pH為7.0~8.0。
[0039]選取均重為12±0.19g且長勢健康的刺身40頭，暫養一周后將其平均分為兩組即 實驗組和對照組，每組設置一組重復實驗。實驗組須將培養后的DL-3菌株按照每組被試刺 參總體重的0.2%配成干重為0.24g的菌液，添加至餌料中并投喂刺參，餌料的投加量為每 組被試刺參總體重的5%;對照組所投喂的餌料則不添加菌液。連續投喂7天后，分別從實驗 組和對照組中各隨機抽出5頭刺參，反復消毒沖洗后，解剖取其體腔液及腸道，分析每組被 試刺參體內免疫酶和消化酶活性的變化。結果發現，菌株DL-3可有效刺激動物體腔液中相 關消化酶和免疫酶的活性，如實驗組中刺參體內脂肪酶的活性提高了 15.7%，蛋白酶的活 性提高了86%;而免疫酶中，酸性磷酸酶(ACP)活性相對于對照組提高了6倍、堿性磷酸酶 (AKP)活性提高了 79.6%、總超氧化物歧化酶(1'-500)活性提高了80%，而酚氧化酶(？0)活 性提高了 1.2倍。
[0040] 實施例2
[0041 ] 刺參的急毒性試驗
[0042]將均重為12±0.19g的刺參暫養一周，選擇長勢優良的刺參進行試驗。將上述3株 菌株分別培養后，離心收集各自菌體并準確稱量干重，之后，將每種菌株均按比例分別配成 濃度為1〇11^凡、10〇11^凡、50〇11^凡、100〇11^凡和150〇11^凡的菌劑。將所配制的3個菌種不同濃 度菌液依次裝入15個相同的10L玻璃缸內，每個玻璃缸內裝入的菌液體積為5L，并放入5頭 刺參。整個實驗持續96h，期間需提供充足的氧氣且不換水，投餌量仍為被試刺參總體重的 5%。分別于實驗開始后的011、311、611、1211、2411、4811、7211和9611時觀察并記錄刺參的排臟、化 皮和死亡情況，記錄死亡的刺參數量，實驗結果如表1、2和3。每組實驗生物學重復3次。 [0043] 表1 DL-1菌株對刺參的急性毒性試驗結果
[0044]
[0045]
[0046] 表2 DL-2菌株對刺參的急性毒性試驗結果
[0047]
[0048] 表3 DL-3菌株對刺參的急性毒性試驗結果 [0049]
[0050]由表1、2和3可見，三株芽孢桿菌對刺參無任何毒性影響，且在試驗期間，實驗組和 對照組的刺參生長狀況均良好，尚未出現嘴腫、化皮及死亡等癥狀。根據刺參急性毒性試驗 結果和急性毒性試驗國標中對毒性級別的規定，本發明最終確定當飼料中兩株菌株的添加 濃度不超過1500mg/L時，對于刺參自身是無毒性的。
[0051 ] 實施例3
[0052] 制備混合益生菌劑
[0053]將均重為12±0.19g的刺參暫養一周，選擇長勢優良的刺參進行試驗。將上述3株 菌株分別培養后，離心收集各自菌體并準確稱量干重。實驗組中，將3種菌株分別按被試刺 參總體重的0.2%投喂刺參并投餌，對照組則投餌不投菌，投餌量為被試刺身總體重的5%， 連續投喂7天，檢測菌體對刺參體腔液中4種免疫酶和3種消化酶活性的影響。檢測結果如圖 1菌株DL-l，DL-2和DL-3對刺參免疫酶和消化酶活性的影響，通過綜合平衡法，最終確定3種 菌株最適干重比為2:3:4,在此比例下，復合菌對刺參體的免疫和消化功能具有正向刺激作 用，且相對于單株菌株而言，益生效果更為顯著，實驗結果如圖1。制備的混合益生菌劑需密 閉包裝，密封保存。
[0054] 從圖1A，C和E可看出，與對照組相比，單獨飼喂菌株DL-1后對刺參體內ACP的活性 并明顯影響；但卻可有效提高ΑΚΡ、Ρ0和S0D的活性;而單獨飼喂菌株DL-2或DL-3后，刺參體 腔液中的ACP、AKP、T-S0D和P0活性均大幅度提高。
[0055] 除此之外，從圖IB，D和F可看出，菌株DL-1、DL-2和DL-3對刺參腸道內3種不同消化 酶的影響也不同。菌株DL-1對刺參腸道脂肪酶無明顯刺激作用，但卻能有效提高淀粉酶和 蛋白酶活性;菌株DL-3對刺參腸道內淀粉酶無明顯刺激作用，但卻能有效提高脂肪酶和蛋 白酶活性;而相比之下，菌株DL-2對3種消化酶的活性均具有正向的刺激作用，且對蛋白酶 的活性影響最大。
[0056] (4)根據刺參體腔中的各種免疫酶和消化酶的活性，進而確定3株菌株之間的最佳 配比，結果見表4。
[0057]表4三種菌株能對刺參產生正向刺激作用的最佳配比
[0058]
[0059] 從表4可看出，通過對不同種酶活性的刺激結果，最終所確定的菌株之間的最佳配 比會呈現差異，因此，在本發明中通過利用綜合平衡法直觀分析比較極差和K值，最終確定 了3株菌株之間的最佳組合為:A2B3C4。為了進一步檢測該復合菌株對刺參的益生效果，本 發明繼而分析了復合菌株對刺參體內酶活性的影響。從圖2和圖3可看出，與對照組和三種 單株菌株相比，對刺參投喂復合菌株后，可更為有效提高動物體內的消化酶和免疫酶的活 性，間接促進動物生長，增強其對外界不良環境的抵抗能力。
【主權項】
1. 一種刺參飼用復合益生菌劑的制備方法，其特征在于：將保藏編號為CGMCC No. 11257的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，保藏編號為CGMCC No. 11258的甲基營養 化芽抱桿菌(Bacillus methylotrophicus)和保藏編號為CGMCC No· 11259的阿氏芽抱桿菌 (Bacillus aryabhattai)分別培養后，離心收集菌體并稱重，再按重量比為2:3:4的比例混 合。2. 如權利要求1所述的刺參飼用復合益生菌劑的制備方法，其特征在于： 保藏編號為CGMCC No. 11257的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的培養條件為:采 用LB液體培養基，30~35°C ;鹽度為3~5 %，pH為7.0~8.0; 保藏編號為CGMCC No. 11258的甲基營養化芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)的 培養條件為:采用LB液體培養基，20~25°C ;鹽度為3~5%，pH為7.0~8.0; 保藏編號為CGMCC No.11259的阿氏芽孢桿菌(Bacillus aryabhattai)的培養條件為： 20~25°C ;采用LB液體培養基，最適鹽度為3~5%，最適pH為7.0~8.0。3. 如權利要求1所述方法獲得的刺參飼用復合益生菌劑。4. 如權利要求3所述刺參飼用復合益生菌劑在飼喂刺參中的應用。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于:權利要求3所述的刺參飼用復合益生菌劑 按刺參體重的0.2 %投喂。
【文檔編號】C12N1/20GK105838640SQ201610057334
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年1月27日
【發明人】關曉燕, 董穎, 周遵春, 陳仲, 姜冰, 王擺, 楊愛馥, 蔣經緯, 姜北
【申請人】遼寧省海洋水產科學研究院