一株表達維生素D<sub>3</sub>-25羥化酶的基因工程菌株的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種表達維生素D3?25羥化酶的基因工程菌株，該菌株是先將編碼維生素D3?25羥化酶的基因進行克隆，并將其重組到能夠穩定分泌維生素D3?25?羥化酶的畢赤酵母菌株載體中，獲得維生素D3?25羥化酶畢赤酵母工程菌，然后對維生素D3?25羥化酶畢赤酵母工程菌誘導培養，分離出表達的目標產物D3?25羥化酶，最后利用該D3?25羥化酶羥化維生素D3使其轉變成25?OH?D3。本發明使能夠獲得穩定多量維生素D3?25?羥化酶成為可能，使得后續的誘導表達以及工業擴大生產簡單許多，為簡化V?D3的生物轉化途徑探索了便捷方法，為新型食品添加劑和營養藥物的研究提出一個研究思路。
【專利說明】
一株表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株
技術領域：
[0001] 本發明屬于生物技術制藥領域的基因工程藥物，具體是一種表達維生素 D3-25羥 化酶的基因工程菌株。
【背景技術】：
[0002] 維生素 D3(V_D3)是維生素 D家族成員中最重要的成員之一，并且與人體及動物健康 緊密聯系。但是維生素 D3須經過肝臟和腎臟的一系列轉化，形成活性形式25-OH-D3或1，25_ (OH)2-D3才能被利用，在這個轉化過程中是最關鍵的一步就需要D3-25-羥化酶的參與。近年 來對微生物轉化V-D3的研究得到了快速的發展，但是轉化率較低，所以提高活性V-D3產量的 關鍵就在于快速有效的得到大量的V-D3的關鍵代謝酶D3-25-羥化酶。傳統合成25-OH-D 3的 方法是化學合成法，需要進行多步的基團保護和脫保護，然后經光照反應、開環和異構化得 至Ij25-OH-D3。此種合成方法步驟繁瑣，分離純化復雜，且回收率低，從而阻礙了活性維生素 D3無法在臨床上大量使用。所以，利用生物轉化法制備活性維生素 D3受到了人們的廣泛重視。 為此，本申請利用生物轉化法將編碼維生素 D3-25羥化酶的基因克隆，重組到畢赤酵母表達 載體中，構建可表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株。
【發明內容】
：
[0003] 本發明的目的是克服現有技術存在的問題，提供一種表達維生素 D3-25羥化酶的 基因工程菌株。
[0004] 本發明還提供所述的一種表達維生素 D3_25羥化酶的基因工程菌株的構建方法。
[0005] 本發明采取以下技術方案：
[0006] 本發明的一種表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株為巴斯德畢赤酵母X33,保 藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號為M2015396。
[0007] 該菌株是先將編碼維生素 D3-25羥化酶的基因進行克隆，并將其重組到能夠穩定 分泌維生素 D3-25-輕化酶的畢赤酵母菌株的表達載體中，獲得維生素 D3-25輕化酶畢赤酵母 工程菌，然后對維生素 D3-25羥化酶畢赤酵母工程菌誘導培養，分離出表達的目標產物D3- 25羥化酶，最后利用該D3-25羥化酶羥化維生素 D3使其轉變成25-OH-D3。
[0008] 上述構建一種表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株的方法，包括如下步驟：
[0009] (1)設計合成25-輕化酶保守端堿基序列；
[0010] (2)提取動物肝臟的全基因組，擴增維生素 D3-25-羥化酶基因；
[0011] (3)將維生素 D3-25-羥化酶基因連接至PMD18-T載體上，酶切測序鑒定是否正確；
[0012] (4)將鑒定正確的維生素 D3-25-羥化酶基因導入至畢赤酵母菌株的表達載體上， 再次通過菌落PCR、酶切和測序鑒定；
[0013] (5)將重組質粒轉入至畢赤酵母細胞，并用G418篩選高拷貝的轉化子；
[0014] (6)用終濃度為0.5 %的甲醇對維生素 D3-25-羥化酶進行誘導表達；
[0015] (7)用West-Blot的方法檢測維生素 D3-25-羥化酶表達情況。
[0016] 上述畢赤酵母菌株選用畢赤酵母X33,重組質粒為pPICZaA。
[0017] 上述維生素 D3-25羥化酶基因來源于鼠胚胎干細胞，所述維生素 D3-25羥化酶基因 本身的大小為1521bp。
[0018] 本發明的有益效果在于:本發明利用基因工程技術克隆出D3-25-羥化酶基因，并 將其構建入能夠穩定分泌維生素 D3-25-羥化酶的畢赤酵母菌株中，獲得基因工程菌株，對 菌株誘導培養，分離出表達的目標產物D3-25-羥化酶，利用該酶能夠羥化維生素 D3使其轉變 成可以利用的25-OH-D3這一生物學特性，為臨床提高維生素 D3生物利用度探索了更加便捷 的途徑。同時，本發明使能夠獲得穩定多量維生素 D3-25-羥化酶成為可能，使得后續的誘導 表達以及工業擴大生產簡單許多，為簡化V-D3的生物轉化途徑探索了便捷方法，為新型食 品添加劑和營養藥物的研究提出一個研究思路。
【附圖說明】：
[0019] 圖1:維生素 D3-25羥化酶在培養上清和菌體表達情況的SDS-PSGE結果；
[0020]圖2:維生素 D3-25羥化酶在培養上清和菌體表達情況的Western Blot結果；
[0021] 圖3 :PH誘導的SDS-PSGE分析圖。
【具體實施方式】：
[0022]下面結合具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。
[0023] 一種表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株，是先將編碼維生素 D3-25羥化酶的 基因進行克隆，并將其重組到能夠穩定分泌維生素 D3-25-羥化酶的畢赤酵母菌株的表達載 體中，獲得維生素 D3-25羥化酶畢赤酵母工程菌，然后對維生素 D3-25羥化酶畢赤酵母工程菌 誘導培養，分離出表達的目標產物D3-25羥化酶，最后利用該D3-25羥化酶羥化維生素 D3使其 轉變成25-OH-D3。
[0024]上述一種表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株的構建方法，具體如下：
[0025] 一、維生素 D3-25羥化酶畢赤酵母工程菌的構建
[0026]提取動物肝臟的全基因組，擴增維生素 D3-25-羥化酶基因，并將其連接至PMD18-T 載體上，酶切測序鑒定是否正確；
[0027]將鑒定正確的基因導入至畢赤酵母表達載體上，再次通過菌落PCR、酶切和測序鑒 定；
[0028]將重組質粒轉入至畢赤酵母細胞使其表達，用West-Blot的方法檢測VD3-25-羥化 酶表達情況。
[0029] 1.目的基因片段的獲取
[0030] 本實驗中選用的菌株為畢赤酵母X33,質粒為pPICZaA，維生素 D3-25羥化酶基因來 源于鼠胚胎干細胞，維生素 D3-25羥化酶基因本身的大小為1521bp。
[0031] 為了能夠使鼠維生素 D3-25羥化酶在畢赤酵母中更好的表達，本實驗對維生素 D3- 25羥化酶基因做了畢赤酵母的密碼子的優化。由于在做優化時，基因后面的終止密碼子沒 有去掉，所以又設計引物PCR進行擴增以去除終止密碼子并在基因3'端加上EK酶切位點。使 用優化好的基因作為模板，通過PCR獲得DNA片段，然后將目的基因插入酵母表達載體pPICZ aA分泌信號下游得到重組質粒。
[0032] 經畢赤酵母密碼子優化后的D3-25羥化酶基因：
[0033] actcaggctgttaagttggcttccagagttttccacagaatccacttgccattgcagttggacgcttca
[0034] ttgggttccagaggttctgagtctgttttgagatccttgtccgacattccaggtccatccactttgtctttcttggc tgagttgttctgtaagggtggtttgtccagattgcacgagttgcaagttcatggtgctgctagatacggtccaattt ggtctggttccttcggtactttgagaactgtttacgttgctgacccaactttggttgagcagttgttgagacaagag tcccactgtccagagagatgttctttctcttcttgggctgaacacagaagaagacaccagagagcttgtggtttgtt gactgctgatggtgaagagtggcagagattgagatctttgttggctcctttgttgttgagaccacaggctgctgctg gttacgctggtactttggataacgttgttagagacttggttagaagattgagaagacagagaggtagaggttccggt ttgccaggtttggttttggatgttgctggtgagttctacaagttcggtttggagtccatcggtgctgttttgttggg ttcaagattgggttgtttggaggctgaagttccaccagacactgagactttcattcacgctgttggttccgttttcg tttctactttgttgacaatggctatgccaaactggttgcaccacttgattccaggaccatgggctagattgtgtaga gactgggatcagatgttcgctttcgctcaaagacacgttgagttgagagaaggtgaggctgctatgagaaaccaggg taagcctgaagaagatatgccatctggtcatcacttgactcactttttgttcagagaaaaggtttccgttcagtcca tcgttggaaacgttacagagttgttgttggctggtgttgacactgtttccaacactttgtcctggactttgtacgag ttgtccagacacccagacgttcaaactgctttgcactccgaaatcactgctggtactagaggttcttgtgctcatcc acatggtactgctttgtcccagttgcctttgttgaaggctgttatcaaagaggttttgagattgtacccagttgttc caggtaactccagagttccagacagagacatcagagttggtaactacgttattccacaggacactttggtttctttg tgtcactacgctacttccagagatccaactcaattcccagacccaaactccttcaacccagctagatggttgggtga aggtcctactccacatccatttgcttcattgccattcggtttcggtaagagatcctgtatcggaagaagattggctg aattggagttgcagatggctttgtctcagatcttgacacacttcgaggtttt
[0035] gccagaaccaggtgctttgccaatcaagccaatgactagaacagttttggttcctgagagatccatcaacttgcagt tcgttgacaga
[0036] (1)引物序列：
[0037] ①上游引物PKF，帶有一個信號肽Kex2 signal cleavage的切割位點：
[0038] 5,ccg(保護喊基）ctcgag(Xho I)cgg(保護喊基）aaaaga(Kex2signal cleavage) actcaggctgttaagttggcttcc 3'
[0039] ②下游引物 PRIPrimer:
[0040] 5 'gc (保護堿基）tctaga(Xba I )gc (保護堿基）1:1^81^31^31^31：(3^1(酶切位點） tctgtcaacgaactgcaagttg 3'
[0041 ] (2)PCR 擴增體系：
[0042]模板 0.5 μ-L PKF 1pL PR1 Primer 1 μ!>
[0043] Taq Mix 25 μL dd H,0 22.5 aL 一 Γ Total 50 μ L
[0044] (3)PCR 擴增程序:94°C 變性，5111丨11;941€458;601€458 ;72°(：，458，共30個循環;721€ 10min〇
[0045] PCR產物于2%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定純度和分子量的大小。
[0046] (4)PCR產物的回收、純化：
[0047]①柱平衡步驟向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500yL的平衡液BL，12， OOOrpm離心lmin，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB2重新放回收集管中；
[0048] ②估計PCR反應液或酶切反應液的體積，向其中加入5倍體積的結合液PB，充分混 勻；
[0049] ③將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室溫放置 211^11，12,000印111離心30-60此(3，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱082放入收集管中。吸附柱 容積為800yL，若樣品體積大于800yL可分批加入；
[0050] ④向吸附柱CB2中加入600yL漂洗液PW，12,000rmp離心30-60sec，倒掉收集管中的 廢液，將吸附柱CB2放入收集管中；
[0051]⑤重復操作步驟④；
[0052]⑥將吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱 CB2置于室溫放置數分鐘，徹底地晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗；
[0053]⑦將吸附柱CB2放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30-50yL洗 脫緩沖液EB，室溫放置2min，12，OOOrpm離心2min收集DNA溶液。洗脫液的體積不應少于30μ L，體積過少會影響回收的效率。溶液重新加回離心吸附柱中，室溫放置2min，12，OOOrpm離 心2min，將DNA溶液收集到離心管中。保存于-20°C備用。
[0054] 2.克隆載體的構建及鑒定
[0055] (1)對回收的質粒進行PCR，回收PCR反應產物，然后用Xho I和Xba I對回收的PCR 產物進行雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳后目的基因雙酶切產物，確定連接體系比例后，加入 T4DNA連接酶，4 °C反應過夜。將連接產物轉化感受態DH5a，LLB+Zeoc in，平板篩選。挑選陽性 克隆，提取質粒DNA，Xho I和Xba I雙酶切，PCR驗證后送測序。
[0056] Xho I和Xba I雙酶切反應體系： kf 50 μΙ 2 x Tango 14 科乙
[0057] 2 V Xball 4 μL. Xhoi 2 μL Total 70 μL,
[0058] (2)pPICZaA及維生素 D3-25羥化酶重組質粒的線性化
[0059] 有三種線性化酶(Sac I，Pme I和BstX I)可供選擇，用軟件查維生素 D3-25羥化酶 基因序列后，發現維生素 D3-25羥化酶基因中有Pme I和BstX I位點，所以選用Sac I使質粒 線性化。
[0060] 線性化反應體系如下： kf: 50 |iL Sac I: 2
[0061 ] Sac I Buffer: .8 μΙ. dd H20: 20. pL Total: 8.0 jiL
[0062] 37°C水浴2h，瓊脂糖凝膠電泳（1%)檢測。回收線性化的表達載體，回收方法同前 面的步驟；回收線性化質粒后，用1/10體積的3M NaAc和2.5倍體積的無水乙醇-20°C過夜沉 淀后12000rpm，10min，重懸于10μLTE緩沖液。
[0063] (3)維生素 D3-25羥化酶重組質粒轉化畢赤酵母感受態細胞X33 [0064]接種畢赤酵母感受態細胞X33到YH)平板上，30°C培養2-3天。用YNB基本培養基和 含有His的補充培養液做分離純化挑選在補充培養基生長而基本培養基不生長的單菌落劃 YPD平板，4°C保存。在制作畢赤酵母感受態細胞時，從平板上挑取單菌落于5mL YH)液體培 養基，30°C，200rmp振蕩過夜，即可再接種用于感受態細胞的制作。
[0065] ①接種lmL畢赤酵母于YH)培養基中30°C過夜；
[0066] ②接種〇.2mL過夜培養物于100mL YPD中，培養至0D600 = 1.3-1.5;
[0067] ③4°C，400rmp離心2min，收集菌體；
[0068] ④用100mL預冷的無菌水重懸菌體，4°C、400rmp離心2min。并且重復一次；
[0069] ⑤用20mL預冷的1M山梨醇混懸4 °C收集菌體；
[0070] ⑥用500yL山梨醇再次混懸；
[0071]⑦加入線性化的質粒到80yL的酵母懸液中放入電轉杯中在冰上放置5min;
[0072] ⑧1500V，25yF，200Q電擊5sc，之后迅速轉移到冷的山梨醇中；
[0073]⑨從電轉杯中取出轉化物于15mL試管30 °C培養1 -2小時；
[0074] ⑩涂布50-200yL產物到加有博來霉素(Zeocin)Yro平板中30°C培養。
[0075] (4)PCR鑒定酵母轉化子
[0076]用滅菌的牙簽直接挑單菌落作為模板，混入PCR體系中，進行PCR擴增。PCR結果證 明，線性化的pPICZaA-kf確實轉入到了畢赤酵母X33中，PCR得到的片段大小與目的基因理 論值相符，隨機挑取的10個克隆確實為重組子。
[0077]二、維生素 D3-25羥化酶畢赤酵母工程菌的培養
[0078]畢赤酵母的常規培養使用YH)培養基，但誘導表達使用BMGY和BMMY培養基。
[0079] 1.維生素 D3-25羥化酶畢赤酵母工程菌的誘導表達實驗
[0080] (1)挑選一單菌落，置于裝有25ml BMGY培養基的250ml搖瓶中，于28-30°C/250- 300rpm培養至0D600 = 2-6(~16-18h);
[0081 ] (2)室溫下1500~3000g離心5min，收集菌體，用BMMY重懸菌體，使0D600 = 1.0左右 (約 100 ~200ml);
[0082] (3)將步驟2所得的菌液置于1L的搖瓶中，用雙層紗布或粗棉布封口，放置于28-30 °C/250-300rpm的搖床上繼續生長；
[0083] (4)每24h向培養基中添加100 %甲醇至終濃度為0 · 5~1 · 0 % ;
[0084] (5)按時間點分別取菌液樣品，取樣量為lml，置于1.5ml EP管中，最大轉速離心2 ~3min，分別收集上清和菌體，分析目的蛋白的表達量和菌液最佳收獲時間。時間點一般 取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h;
[0085] (6)對分泌表達，分離樣品的上清液;對胞內表達，分離樣品的菌體沉淀，帶檢測樣 品用液氮或干冰速凍后，于_80°C保存備用；
[0086] (7)可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性實驗檢測與鑒定重組蛋白的表達。
[0087] 實驗過程：
[0088] 1)取KF、KSF兩組不同的畢赤酵母培養上清，每支lml原液共取8支，使用100%的硫 酸銨飽和溶液冰上緩慢加入畢赤酵母培養上清中，邊攪拌邊加入，配比為硫酸銨終濃度為 分別為40%，50%，60%，70%的混合液；
[0089] 2)冰上沉淀混合液4h，18，000 X g離心30min，棄上清，使用50μ1 PBS重懸沉淀，加 入 10μ1 6 XProtein Loading Buffer混勾，以上樣品沸水浴 10min，12000rpm離心5min; [0090] 3)取 10μ1 上清點樣至 10%SDS-PAGE 膠，200V 恒壓電泳 50min;
[0091 ] 4)考馬斯亮藍染液染膠，脫色，觀察結果；
[0092] 5)取變性后的蛋白樣品1 ΟμL點樣進行SDS-PAGE電泳，膠濃度為10 %，200V恒壓電 泳45min;
[0093] 6)轉膜：200mA 恒流 120min;
[0094] 7)5%脫脂牛奶封閉lh;
[0095] 8)加入Anti-His Mouse Monoclonal Antibody(HT501) -抗孵育lh，抗體稀釋比 例為 1:5000;
[0096] 9)TBST振蕩洗滌10min，重復3次；
[0097] 10)加入Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，HRP Conjugate(HS201)-抗孵育lh，抗體稀 釋比例為1:5000;
[0098] 11) TBST振蕩洗滌10min，重復3次；
[0099] 12)ECL 發光液孵育 lmin;
[0100] 13)X-光片曝光30s，顯影、壓片。
[0101] 實驗結果：
[0102] (1)如圖1所示，SDS-PAGE電泳結果顯示：
[0103]沉淀濃縮樣品中有多條條帶，其中58kD左右存在條帶，符合預期目標蛋白大小，可 進行下游Western Blot實驗檢測。
[0104] (2)如圖2所示，Western Blot結果顯示：
[0105] KF組及KSF組酵母菌體對照58kD均存在His標簽蛋白，但雜帶較多，而濃縮上清無 目的條帶，同時陽性對照蛋白強烈曝光，抗體及實驗條件正常。
[0106] 實驗結論：
[0107] 在本實驗中同時檢測培養上清和菌體，來看維生素 D3-25羥化酶的表達情況，通過 SDS-PSGE和Western Blot結果證明，以及PH誘導的SDS-PSGE分析，如圖3所示，維生素 D3-25 羥化酶在培養上清中沒有檢測到，而是表達在菌體中。
[0108] 2.畢赤酵母表達常用溶液及緩沖液的配制
[0109] (1)各種母液的配制
[0110] 10*YNB (含有硫酸銨、無氨基酸的13.4%酵母基礎氮源培養基)4°(：保存。348酵母 基礎氮源培養基(無硫酸銨)+l〇〇g硫酸銨，溶于l〇〇〇ml水中，過濾除菌。
[0111] 500*B(0.02%生物素 Biotin)4°C保存保存期為1年。20mg的生物素溶于100ml水 中，過濾除菌。
[0112] 10*GY(10%Glycerol甘油)保存期為1年以上。將100ml甘油和900ml水混勻后，高 壓滅菌或過濾除菌。
[0113] 1M磷酸鉀溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0)，將lmol/L的K2HP04溶液 132ml與lmol/L的KH2P04溶液868ml混勻，其pH為6.0，如需調節pH，則使用磷酸和氫氧化鉀 調節pH。
[0114] (2)酵母用培養基:YPD [0115] yeast extract 1%
[0116] peptone 2%
[0117] dextrose(glucose)2%
[0118] sorbitol 1M
[0119] +agar 2%
[0120] 不管是液體YPDS培養基，還是YPDS+Zeocin培養基，都必須存放4°C條件下，有效期 1~2周。
[0121] (3)酵母誘導表達培養基:BMGY/BMMY( 1L)
[0122] l%yeast extract
[0123] 2 %peptone
[0124] lOOmM potassium phosphate,pH 6.0
[0125] 1.34%YNB
[0126] 4x l〇-5%biotin
[0127] l%glycerol or 0.5%methanol
[0128]①溶解lOg yeast extract，20g peptone在700ml水中，高壓滅菌。
[0129] ②待冷卻至室溫后加入以下已高壓過的母液：
[0130] 100ml 1M potassium phosphate buffer,pH 6.0
[0131] 100ml 1OX YNB
[0132] 2ml 500X B
[0133] 100ml 1〇X GY
[0134] ③對BMMY來說，添加總量為lOOmL的滅菌水及0.5%甲醇代替甘油。
【主權項】
1. 一株表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株，其特征在于:該菌株為巴斯德畢赤酵 母X33，保藏于武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號為M2015396。2. 根據權利要求1所述的一種表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株，其特征在于:該 菌株是先將編碼維生素 D3-25羥化酶的基因進行克隆，并將其重組到能夠穩定分泌維生素 D3-25-羥化酶的畢赤酵母菌株載體中，獲得維生素 D3-25羥化酶畢赤酵母工程菌，然后對維 生素 D3-25羥化酶畢赤酵母工程菌誘導培養，分離出表達的目標產物D3-25羥化酶，最后利用 該D 3-25羥化酶羥化維生素 D3使其轉變成25-OH-D3。3. 根據權利要求2所述的一種表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株的構建方法，其 特征在于:包括如下步驟： (1) 設計合成25-羥化酶保守端堿基序列； (2) 提取動物肝臟的全基因組，擴增維生素 D3-25-羥化酶基因； (3) 將維生素 D3-25-羥化酶基因連接至PMD18-T載體上，酶切測序鑒定是否正確； (4) 將鑒定正確的維生素 D3-25-羥化酶基因導入至畢赤酵母菌株的表達載體上，再次通 過菌落PCR、酶切和測序鑒定； (5) 將重組質粒轉入至畢赤酵母細胞，并用G418篩選高拷貝的轉化子； (6) 用終濃度為0.5 %的甲醇對維生素 D3-25-羥化酶進行誘導表達； (7) 用West-Blot的方法檢測維生素 D3-25-羥化酶表達情況。4. 根據權利要求3所述的一種表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株的構建方法，其 特征在于:所述畢赤酵母菌株選用畢赤酵母X33。5. 根據權利要求3所述的一種表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株的構建方法，其 特征在于:所述重組質粒為pPICZaA。6. 根據權利要求3所述的一種表達維生素 D3-25羥化酶的基因工程菌株的構建方法，其 特征在于:所述維生素 D3-25羥化酶基因來源于鼠胚胎干細胞。
【文檔編號】C12N15/81GK105838631SQ201511016192
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年12月30日
【發明人】周學章, 高蔚豐, 朱秀春
【申請人】寧夏大學, 寧夏智弘生物科技有限公司