一種防治煙草青枯病的青霉xfsf-8菌株及應用
【專利摘要】本發明涉及一種青霉xfsf?8菌株，以及其制備抗煙草青枯病菌劑方面的應用，本發明通過在恩施州健康煙田中取土樣、篩選、分析、培養后得到一株生防青霉xfsf?8，并通過田間實驗驗證：青霉xfsf?8防治煙草青枯病效果好，針對性強，無污染，制成菌劑后可長期保存，方便于田間應用，進一步豐富了放線菌生防菌研究領域的成果，對煙草青枯病的防治具有指導意義。CCTCC NO：M201610020160309
【專利說明】
-種防治煙草青枯病的青霉Wsf-S菌株及應用
技術領域
[0001] 本發明具體設及一種青霉xfsf-8固體發酵條件優化，及其在煙草青枯病防治上的 應用，屬于農業微生物學技術及發酵工程領域。
【背景技術】
[0002] 煙草青枯病是一種±傳性細菌病害，由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum) 引起。青枯病的主要病發特征是病株根部及側根發黑腐爛，莖部可見黑色條斑，該病最典型 的特征是葉片枯萎后仍是綠色，故稱青枯病（周訓軍等2012)。該病在我國煙田中發病率和 致死率高，對煙草的產量和質量影響很大，造成了巨大的經濟損失。目前，仍然很難使用某 種單一的方法徹底根除煙草青枯病，多種生物防治W及農業的措施結合可W減輕青枯病的 危害。
[0003] 目前，青枯病的生物防治W其無污染、效果好、不會產生抗藥性等越來越受到人們 的青睞。例如，印度Anuratha和Gnanamanickam進行了許多青枯病的防治試驗，用巧光假單 胞桿菌（Pseudomonas fIuorescens)進行的試驗取得了良好的防治效果（Trigalet A 1990)。人們從煙草的根或根際±壤中分離并篩選芽抱桿菌，并進行了小區試驗和盆栽試 驗，結果表明，多種芽抱桿菌對青枯病菌都具有較強抑制作用（陳程等2011) nEl-Abyad等將 3個青霉菌株一巧樣巧光青霉（Streptomyces citrecofluorescens)、極美青霉 (S.pulcher)和灰白青霉(S.canescens)分別制成種衣劑，將種子進行處理后，在42~63d時 間內成功的控制了青枯病化I-Abyad 1993)。劉艷霞等將從健康煙草根際±壤中分離篩選 到的短短芽抱桿菌^25(Brevibaci 1 Ius brevis)和類徹氏青霉^9(Streptomyces rochei)，與有機肥結合后制備成微生物肥料使用，對煙草的產量有顯著提高，第一年和第 二年施用生物有機肥處理移栽50天后煙草青枯病的生物防控率分別為82.2 %和96.2 %， 105天后煙草青枯病的生物防控率分別達到75.2%和95.4% ;生物有機肥處理第一年和第 二年煙葉產量分別為2212.51^/血2、1475.51^/11111 2，是對照的2.4和2.6倍。（劉艷霞等2014)。
[0004] 我國煙草青枯病發生嚴重，造成了巨大的經濟損失，所W解決煙草青枯病問題至 關重要。由于環境安全問題的日益突出W及抗藥性的不斷出現，化學農藥的使用受到越來 越多的限制，因而將研究重點逐漸轉移到生物防治上。自然界微生物種類多，為青枯病的生 物防治提供了豐富的微生物資源。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是對青霉xfsf-8固體發酵培養條件進行優化，提高其固體發酵產抱 量。將其施用于煙草根部，對煙草青枯病具有較好的防治效果。
[0006] 本發明提供一種青霉Xf sf-8菌株，其特征在于：所述青霉的分類命名為青霉 Penicillium SP.xfsf-8,保藏在中國典型培養物保藏中屯、CCTCC，保藏編號為CCTCC NO: M2016100;保藏日期2016年3月9日，保藏地址湖北省武漢市洪山區八一路武漢大學中國典 型培養物保藏中屯、，郵政編碼:430072;所述的鏈青霉Xf sf-8菌株基因序列為：
[0007]
[000引
[0009]本發明一種青霉Xf sf-8菌株，其特征在于在制備抗煙草青枯病菌劑中的應用。 [0010]本發明一種青霉Xf sf-8菌株，其特征在于青霉Xf sf-8菌株的青枯病防治使用方 法:將青霉Xf sf-8固體發酵培養后，獲得的發酵液，對煙草苗進行莖基部噴淋，單株煙草苗 所噴淋的發酵液含有的青霉xfsf-8數量大于等于10 7CFU/ml。
[0011] 本發明的有益效果:提供了一種青霉xfsf-8菌株W及其在防治煙草青枯病方面的 應用，本發明通過在恩施州健康煙田中取上樣、篩選、分析、培養后得到一株青霉xfsf-8,并 通過田間實驗驗證:上述青霉使用時，防治煙草青枯病效果好，針對性強，無污染，方便于田 間應用，對W后煙草青枯病的防治具有指導意義。
[0012] 本發明一種青霉xfsf-8菌株與現有技術相比，本發明具有W下優點：從長勢良好 的健康煙草植株根際±壤中分離出多種真菌，并通過抗青枯雷爾氏菌的括抗實驗篩選到青 霉xfsf-8,該菌株對青枯雷爾氏菌有較高抗菌活性。對青霉xfsf-8的固體發酵條件進行優 化，通過單因素試驗、實驗、最睹爬坡實驗、中屯、組合實驗等得到最適發酵條件。發酵菌劑 施用于煙田，結果表明青霉xfsf-8對煙草青枯病有較好的防治效果。
【附圖說明】
[0013] 圖1為青霉xfsf-8對青枯雷爾氏菌的抗性平板實驗；
[0014] 圖2為青霉Xf sf-8固體發酵最適碳源和介質的篩選；
[0015] 圖3為青霉xfsf-8固體發酵最適氮源的篩選；
[0016] 圖4為青霉xfsf-8固體發酵最適無機鹽的篩選；
[0017] 圖5為青霉xfsf-8固體發酵最適含水量的篩選；
[0018] 圖6為青霉xfsf-8固體發酵最適接種量的篩選；
[0019] 圖7為青霉xfsf-8固體發酵最適pH值的篩選；
[0020] 圖8為青霉xfsf-8固體發酵最適生長因子的篩選；
[0021] 圖9為青霉xfsf-8固體發酵最適培養周期的篩選；
[0022] 圖10為青霉xfsf-8固體發酵最適瓶裝量的篩選；
[0023] 圖11為青霉xfsf-8固體發酵吐溫-80最適含量的確定；
[0024] 圖12為酵母粉和含水量對青霉產抱量影響的等高線圖；
[0025] 圖13為酵母粉和含水量對青霉產抱量影響的響應曲面圖；
[0026] 圖14為酵母粉和吐溫-80對青霉產抱量影響的等高線圖；
[0027] 圖15為酵母粉和吐溫-80對青霉產抱量影響的響應曲面圖；
[00%]圖16為含水量和吐溫-80對青霉產抱量影響的等高線圖；
[0029] 圖17為含水量和吐溫-80對青霉產抱量影響的響應曲面圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但發明的實施方式不限于此。
[0031] 本發明實施例所述技術方案，如未特別說明，均為常規技術，所用試劑如未特別說 明，均來源于商業化渠道。
[0032] 實施例1檢測青霉xfsf-8對青枯雷爾氏菌的抗性
[0033] 挑取從健康煙草植株根際±壤中分離純化出的青霉xfsf-8接種于PDA液體培養 基，于28°C，180rpm/min搖床培養5d，發酵液經過濾后在無菌操作臺用直徑0.22皿的過濾器 過濾除菌。
[0034] 從LB平板上挑取青枯雷爾氏菌單菌落接種于LB液體培養基中，于37°C，ISO^m/ min搖床培養2地，取適量菌液稀釋至OD值0.2左右，涂布于LB平板。將已滅菌的濾紙置于平 板中，用移液器取IOyl無菌的青霉Xfsf-8發酵液浸于濾紙片上，28°C恒溫培養2地后觀察抑 困圈。
[0035] 結果顯示：如圖1，濾紙周圍有明顯的抑菌圈，青霉xfsf-8發酵液對青枯雷爾氏菌 有明顯的抑制作用。
[0036] 實施例2青霉xfsf-8固體發酵條件的優化
[0037] (1)最適碳源和培養介質的優化
[0038] W玉米粉、小麥粉、教皮、米慷作為碳源，W營養±、賠石±作為培養基質，按1:1的 比例將碳源和培養基質各稱取7.5g混勻后置于培養皿中，12rc滅菌20min備用，共配置8種 培養基。每種碳源設置3個重復。
[0039] 取培養好的青霉xfsf-8固體PDA平板，于無菌操作臺下用無菌水將抱子洗下來制 成抱子懸浮液，用血球計數板測定抱子含量，調整濃度為1.2 X IO7個抱子/ml的抱子懸浮 液。
[0040] 無菌條件下，向培養皿中加入6ml上述抱子懸浮液，混勻后置于28°C恒溫培養箱中 培養觀察計數，并于第五天開始統計各皿抱子含量。
[0041] 抱子量測定:稱取固體發酵培養基Ig,加入內有19ml無菌水的=角瓶中，加入適量 玻璃珠，放至搖床上18化pm/min振蕩30min，獲得抱子懸浮液，用血球計數板計量抱子數，每 個處理3次重復。結果如表1、圖1所示。
[0042] 表1青霉xfsf-8固體培養生長狀況及產抱情況
[0043]
[0044] 結果:如圖1所示，在W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質時，青霉xfsf-8固體發 酵產生的抱子數最多，達到1.77 X 109個/g。因此，確定玉米粉為最適碳源，賠石為最適的培 養基質。
[0045] (2)最適氮源的篩選
[0046] W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，按1:1的比例將玉米粉和賠石各稱取7.5g 混勻后置于培養皿中，121°C滅菌20min備用。共配制4組培養基，每組設置3個重復。
[0047] 取培養好的青霉xfsf-8固體PDA平板，于無菌操作臺下用無菌水將抱子洗脫下來 制成抱子懸浮液，用血球計數板測定抱子含量，調整抱子濃度為1.2X IO7個抱子/ml,此抱 子懸浮液用于接種。
[004引分別W豆巧粉、尿素、硝酸鋼、硝酸鐘、硫酸錠作為氮源，WO. 5%的含量將上述氮 源分別溶于1.2 X IO^ml的抱子懸浮液中，向每組培養皿中加入6ml含有氮源的抱子懸浮 液，混勻后置于28°C恒溫培養箱中培養觀察計數。結果如圖2所示。
[0049] 結果:如圖2所示，在W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源時， 青霉xfsf-8固體發酵產生的抱子數最多，達到1.92X109個/邑。
[0050] (3)最適無機鹽的篩選
[0051] W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，按1:1的比例玉米粉和 賠石各稱取7.5g混勻置于培養皿中，12rc滅菌20min備用，配制4組培養基，每組設置3個重 復。
[0052] 取培養好的青霉xfsf-8固體PDA平板，于無菌操作臺下用無菌水將抱子洗脫下來 制成抱子懸浮液，用血球計數板測定抱子含量，最終定量為1.2 X IO7個抱子/ml的抱子懸浮 液。
[0053] 分別W氯化鐘、硫酸鐵、硫酸儀、硫酸儀作為無機鹽，WO.5%含量的硫酸錠W及上 述無機鹽分別溶于1.2 X IO^ml的抱子懸浮液中，向每組培養皿中加入6ml抱子懸浮液，混 勻后置于28°C恒溫培養箱中培養觀察計數。結果如圖3所示。
[0054] 結果:如圖3所示，在W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫 酸儀作為無機鹽時，青霉Xfsf-8固體發酵產生的抱子數最多，達到2.43 X 109個/邑。
[0055] (4)最適含水量的篩選
[0056] W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫酸儀作為無機鹽，按 1:1的比例玉米粉和賠石各稱取7.5g混勻置于培養皿中，121°C滅菌20min備用，配制4組培 養基，每組設置3個重復。
[0057] 取培養好的青霉xfsf-8固體PDA平板，于無菌操作臺下用無菌水將抱子洗脫下來 制成抱子懸浮液，用血球計數板測定抱子含量，最終定量為1.2 X lOVml的抱子懸浮液。
[005引將0.5%含量的硫酸錠和0.5%的含量的硫酸儀分別溶于1.2 X lOVml的抱子懸浮 液中，按照40 %、50 %、60 %、80%的含水量，向每組培養皿中分別加入6ml、7.5ml、9ml、12ml 抱子懸浮液，混勻后置于28°C恒溫培養箱中培養觀察計數。結果如圖4所示。
[0059] 結果:如圖4所示，在W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫 酸儀作為無機鹽，含水量為40%時，青霉xfsf-8固體發酵產生的抱子數最多，達到2.73 X 109個/g。
[0060] (5)最適接種量的篩選
[0061 ] W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫酸儀作為無機鹽，W 40 %的含水量，按1:1的比例玉米粉和賠石各稱取7.5g混勻置于培養皿中，12 rC滅菌20min 備用，共配制6組培養基，每組設置3個重復。
[0062] 取培養好的青霉xfsf-8固體PDA平板，于無菌操作臺下用無菌水將抱子洗脫下來 制成抱子懸浮液，用血球計數板測定抱子含量，分別定量為1.2 X IO^ml、0.6 X IO^ml、1.2 X 10 Vml、2.4 X 10 Vml、4.8 X 10 Vml、1.2 X 1 〇8/ml 的抱子懸浮液。
[0063] 將0.5%含量的硫酸錠和0.5%的含量的硫酸儀分別溶于上述不同含量的抱子懸 浮液，按照40%的含水量分別加到每組培養皿中，混勻后置于28°C恒溫培養箱中培養觀察 計數。結果如圖5所示。
[0064] 結果:如圖5所示，在W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫 酸儀作為無機鹽，含水量為40%，接種量為1.2 X 107/ml時，青霉Xf sf-8固體發酵產生的抱 子數最多，達到2. Ol X 109個/g。
[00化](6)最適pH值的篩選
[0066] W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫酸儀作為無機鹽，W 40%的含水量，1.2 X IO^ml的接種量，按1:1的比例玉米粉和賠石各稱取7.5g混勻置于培 養皿中，12rC滅菌20min備用。共配制5組培養基，每組設置3個重復。
[0067] 取培養好的青霉xfsf-8固體PDA平板，于無菌操作臺下用無菌水將抱子洗脫下來 制成抱子懸浮液，用血球計數板測定抱子含量，定量為1.2 X IO^ml的抱子懸浮液。將抱子 懸浮液分成五等份，用0.5M肥1調節抱子懸浮液抑值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。
[0068] 將0.5%含量的硫酸錠和0.5%的含量的硫酸儀分別溶于上述的抱子懸浮液，按照 40%的含水量分別加到每組培養皿中，混勻后置于28°C恒溫培養箱中培養觀察計數。結果 如圖6所示。
[0069] 結果:如圖6所示，在W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫 酸儀作為無機鹽，含水量為40 %，接種量為1.2 X 107/ml，抱子懸浮液抑為4.0時，青霉Xf Sf-8固體發酵產生的抱子數最多，達到3.36 X 109個/g。
[0070] (7)最適生長因子的篩選
[0071 ] W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫酸儀作為無機鹽，W 40%的含水量，1.2 X IO^ml的接種量，按1:1的比例玉米粉和賠石各稱取7.5g混勻置于培 養皿中，12rC滅菌20min備用。共配制2組培養基，每組設置3個重復。
[0072] 取培養好的青霉xfsf-8固體PDA平板，于無菌操作臺下用無菌水將抱子洗脫下來 審IJ成抱子懸浮液，用血球計數板測定抱子含量，定量為1.2Xl〇Vml、pH4的抱子懸浮液。
[0073] W酵母粉、蛋白腺作為生長因子，分別按照0.5%含量添加至上述的抱子懸浮液， 按照40%的含水量分別加到每組培養皿中，混勻后置于28°C恒溫培養箱中培養觀察計數。 結果如圖7所示。
[0074] 結果:如圖7所示，在W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，酵 母粉作為生長因子，硫酸儀作為無機鹽，含水量為40 %，接種量為1.2 X 107/ml，抱子懸浮液 抑為4時，青霉Xfsf-8固體發酵產生的抱子數最多，達到4.27 X 109個/邑。
[0075] (8)最適培養周期的確定
[0076] W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫酸儀作為無機鹽，酵 母粉作為生長因子，W40%的含水量，1.2X IO^ml的接種量，按1:1的比例玉米粉和賠石各 稱取7.5g混勻置于培養皿中，121°C滅菌20min備用。
[0077] 取培養好的青霉xfsf-8固體PDA平板，于無菌操作臺下用無菌水將抱子洗脫下來 審IJ成抱子懸浮液，用血球計數板測定抱子含量，定量為1.2Xl〇Vml、pH4的抱子懸浮液。
[0078] 將0.5%含量的硫酸錠、0.5%的含量的硫酸儀，0.5%的含量酵母粉溶于上述的抱 子懸浮液，按照40%的含水量分別加到每組培養皿中，混勻后置于28°C恒溫培養箱中培養 觀察計數。連續培養IOcU從第6d開始測定培養基抱子含量。結果如圖8所示。
[0079] 結果:如圖8所示，在W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，酵 母粉作為生長因子，硫酸儀作為無機鹽，含水量為40 %，接種量為1.2 X 107/ml，抱子懸浮液 pH為4,培養周期為8加寸，青霉xfsf-8固體發酵產生的抱子數最多，達到4.90X 109個/邑。
[0080] (9)最適瓶裝量的確定
[0081 ] W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫酸儀作為無機鹽，酵 母粉作為生長因子，W40%的含水量，1.2 X 107/ml的接種量，按1:1的比例玉米粉和賠石各 稱取5肖、7.5肖、10肖混勻后置于培養皿中，121°(：滅菌2〇111111備用。配制3組培養基，每組設置3 個重復。
[0082] 取培養好的青霉xfsf-8固體PDA平板，于無菌操作臺下用無菌水將抱子洗脫下來 審IJ成抱子懸浮液，用血球計數板測定抱子含量，定量為1.2Xl〇Vml、pH4的抱子懸浮液。
[0083] 將0.5%含量的硫酸錠、0.5%的含量的硫酸儀0.5%的含量酵母粉溶于上述的抱 子懸浮液，按照40%的含水量分別加到每組培養皿中，混勻后置于28°C恒溫培養箱中培養 8d后觀察計數。
[0084] 結果:如圖9所示，在W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，酵 母粉作為生長因子，硫酸儀作為無機鹽，含水量為40%，接種量為1.2 X 107/ml，抱子懸浮 液pH為4、培養周期為8d，瓶裝量為IOg時，青霉Xf sf-8固體發酵產生的抱子數最多，達到 1.43X1010 個/邑。
[00化](10)吐溫-80最適含量的確定
[0086] W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，硫酸儀作為無機鹽，酵 母粉作為生長因子，W40%的含水量，1.2X IO^ml的接種量，按1:1的比例玉米粉和賠石各 稱取5g混勻置于培養皿中，12rC滅菌20min備用。準備5組培養基，每組設置3個重復。
[0087] 取培養好的青霉xfsf-8固體PDA平板，于無菌操作臺下用無菌水將抱子洗脫下來 審IJ成抱子懸浮液，用血球計數板測定抱子含量，定量為1.2Xl〇Vml、pH4的抱子懸浮液。
[008引將0.25%、0.5%、0.75%、1.00%、1.25%的吐溫-80分別于0.5%含量的硫酸錠、 0.5 %的含量的硫酸儀0.5 %的含量酵母粉混合并溶于上述的抱子懸浮液，按照40 %的含水 量分別加到每組培養皿中，混勻后置于28°C恒溫培養箱中培養8d后觀察計數。
[0089] 結果:如圖10所示，在W玉米粉作為碳源，賠石作為培養基質，硫酸錠作為氮源，酵 母粉作為生長因子，硫酸儀作為無機鹽，含水量為40%，接種量為1.2 X 107/ml，吐溫-80含 量為1.00%，抱子懸浮液pH為4,培養周期為8d，瓶裝量為IOg時，青霉xfsf-8固體發酵產生 的抱子數最多，達到8.73 X 109個/g。（ 11 )Plackett-Bu;rman實驗
[0090] 采用Plackett-Burman實驗，選取碳源玉米粉，氮源硫酸錠，無機鹽硫酸儀，生長因 子酵母粉，含水量，pH，吐溫-80,共7個因素進行實驗，每個因素取高(+1)、低(-1)兩個水平， 利用Des ign-Expert8.0化軟件進行實驗設計和結果分析，實驗設計表見表2，實驗響應值見 表3，各因素效應及顯著性分析見表4。
[0091 ] 圭〇〇1。。^。+ + _化1~1^~。。如遼會曲妾音/正1心巫^&^本
[0092]
[0093]
[0094] 表 3Plackett-Burman 實驗設計
[0095]
[0098] 結果:上述Y為響應值，即抱子量。根據實驗數據，擬合二元一次方程為:Rl = 4.11+ 0.057A+0.35B+0.28C+0.74D-0.66E-0.35F+0.73G，此回歸方程的 F 值是 20.00，P 值為0.484， 表明運個模型是顯著性的，模型中P值小于0.05則表明此因子是顯著性的，即D-酵母粉、E含 水量、G-吐溫-80為顯著性影響因素，且酵母粉和吐溫-80是正效應，含水量為負效應。
[0099] (12)最睹爬坡實驗
[0100] 根據部分因子實驗設計結果確定顯著影響因子后，針對酵母粉、吐溫-80和含水量 的質量濃度進行最睹爬坡實驗，W擬合的回歸方程模型的系數符號和大小設定顯著影響因 素的步長及變化方向，使響應值快速逼近最大相應區域。
[0101 ]設酵母粉的規范變量基本步長A Xl =0.2，則含水量規范變量基本步長A X2 = 0.66/(0.74/ A Xl) =0.18，吐溫-80規范變量基本步長 A X3 = 0.73/(0.74/ A Xl)。酵母粉的 實際步長A U = 0.2*0.5 % = 0.1 %，含水量實際步長A C2 = 0.18*4 = 0.72，吐溫-80實際步 長A C3 = 0.2*0.75 = 0.15 %。最睹爬坡實驗設計及結果見表5。
[0102]表5最睹爬坡實驗設計及結果 「01091
[0104] 結果：由表5可知，青霉Xf sf-8固體發酵產抱量在1+ A (酵母粉0.6 %，水3.28ml，吐 溫-80 0.9 % )是產量最高，達到4.06 X 109個/g。
[0105] (13)響應面實驗設計
[0106] W青霉xfsf-8固體發酵產抱量為主要目標，根據最睹爬坡實驗確定響應面實驗中 屯、點，利用Design-Experts. 0f5b軟件進行響應面Box-Behnken設計BBD實驗，實驗設計及結 果見表6和表7。
[0107] 表6中屯、組合實驗及結果 「01081
[0112] 由方差分析可知，模型P值小于0.0001，表明模型是高度顯著的，同時模型中的參 數八、8、4(：、4~2、8~2是顯著的。<0.05)。模型失擬向項的口值為0.5，表明模型失擬不顯著。 同時軟件分析得到的模型F值為65.998，多員相關系數R2為0.9884，說明模型擬合良好。變 異系數(C.V.)為4.80,說明模型方程能很好地反應真實的實驗值。
[0113] 響應面分析及最佳培養基成分:確定通過回歸方程繪制分析圖，考察擬合的響應 曲面形狀，響應面立體分析圖和響應面等高線圖見圖12-17。運用ped 8.0化軟件對回歸方 程進行分析，得到酵母粉0.6 %，水3.28ml，吐溫-80 0.9 %時青霉Xf sf-8固體發酵產抱量最 大達到4.74 X 109個/g。
[0114] (14)驗證實驗
[0115] 為確定建立的模型與實驗結果是否符合，通過進一步的實驗對模型的可靠性進行 驗證。在初始條件(僅有碳源和培養介質)和優化條件下分別進行3批次的固體發酵實驗，測 定青霉Xf sf-8固體發酵產抱量，測得初始條件下得抱子產量為達到1.12 X 109個/g，優化條 件下的抱子產量達到6.86X 109個/g,結果表明青霉xfsf-8固體發酵條件優化后的培養基 產抱量較初始條件有顯著提高。
[0116] 試驗例
[0117] 2015年在湖北省恩施州宣恩縣曉關鎮煙田進行。該試驗地歷年種植煙草，青枯病 發生嚴重，±壤屬黃棟壤，肥力中等，地勢平坦，光照條件較好。供試品種為云煙87。。
[0118] 試驗共設置3個處理，即：處理1:72%硫酸鏈霉素稀釋1000倍(河北=農農用化工 有限公司）；處理2:青霉xfsf-8菌劑(華中農業大學）；處理3:CK (灌清水）；W上處理在煙苗 移栽后10天、移栽后30天和50天進行根部灌淋，每株灌根200ml，共3次。
[0119] 在移栽后60天，調查各處理青枯病的發病情況，并計算發病率、病情指數、相對防 效。結果見表8。
[0120] 表8不同藥劑對煙草青枯病的防效 「/"H
[0122] 煙草青枯病及其他病害的調查標準均參照中華人民共和國國家標準GB/T3222- 2008。煙草青枯病病情分級標準(W株為單位）：
[0123] 0級:全株無病；
[0124] 1級:莖部偶有稱綠斑，或病側二分之一 W下葉片調萎；
[0125] 3級:莖部有黑色條斑，但不超過二分之一，或病側二分之一至=分之二葉片調萎；
[01%] 5級：莖部黑色條斑超過二分之一，但未到達莖頂部，或病側=分之二W上葉片調 萎；
[0127] 7級:莖部黑色條斑到達莖頂部，或病株葉片全部調萎：
[01巧]9級:病株基本枯死。
[0129] 防效計算；
[0130] 病情指數=[(各級病株數X該病級指數)/(調查總株數X最高級指數）]X 100
[0131] 防效=(空白對照區病指-處理區病)/空白對照區病指X 100%
[0132] 從表8可W看出，青霉xfsf-8菌劑對青枯病的防效效果顯著，防效為87.15%，顯著 降低了煙草青枯病的發病率和病情指數，其效果優于硫酸鏈霉素。
【主權項】
1. 一種青霉xfsf-8菌株，其特征在于：所述青霉的分類命名為青霉Penici 11 ium sp. xfsf-8，保藏在中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號為CCTCC NO: M2016100。2. 按照權利要求1所述的一種青霉xfsf-8菌株，其特征在于在制備抗煙草青枯病菌劑 中的應用。3. 按照權利要求2所述的一種青霉xfsf-8菌株，其特征在于青霉xfsf-8菌株的青枯病 防治使用方法:將青霉xfsf-8固體發酵培養后，獲得的發酵液，對煙草苗進行莖基部噴淋， 單株煙草苗所噴淋的發酵液含有的青霉xfsf-8數量大于等于10 7CFU/ml。
【文檔編號】A01P1/00GK105838627SQ201610307739
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月10日
【發明人】王瑞, 趙秀云, 施河麗, 韓非, 譚軍, 任加慶, 祁高富, 姜乾坤, 潘廣為, 向必坤
【申請人】湖北省煙草公司恩施州公司