一種菰黑粉菌單倍體菌株uet1及其應用
【專利摘要】一種菰黑粉菌單倍體菌株UET1及其應用，屬于生物技術領域。該菰黑粉菌（Ustilago esculenta）單倍體菌株UET1，保藏號為：CGMCC No.11843。茭白人工育種需要兩種性親和單倍體菌株的共同侵染，該菌株可以作為茭白人工育種的母體菌株，通過篩選得到其性親和的單倍體菌株后，通過人工接種方法即可以實現人工孕茭。同時該單倍體菌株可以進行基因工程改造從而為接下來的茭白品種改良，如提高茭白的環境適應性、控制結茭時間等茭白育種工作提供實施基礎材料。CGMCC No.1184320151207
【專利說明】
一種菰黑粉菌單倍體菌株UET1及其應用
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種菰黑粉菌單倍體菌株UETl及其應用。
【背景技術】
[0002]菰黑粉菌屬于擔子菌亞門黑粉菌屬，是一種典型的二型態真菌，與玉米瘤黑粉菌近源。目前為止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是該專一性寄生的菰黑粉菌與茭白植株互相作用的結果。至今，茭白的種植及保種育種還是采用茭墩分離篩選的方式，人力物力投入較大，而且菰黑粉菌存在多個生理小種，其可能混合存在于茭白植株中，造成茭白品種性狀不穩定，退化明顯。因此采用人工接種方式是茭白育種的發展方向。
[0003]研究表明菰黑粉菌的兩個性親和單倍體混合接種可以使正常開花的野茭植株孕茭，即植株莖基部發生膨大并且不再抽穗開花，而非性親和單倍體菌株混合、雙核菌絲或冬孢子接種均無法使野茭植株孕茭(近源的玉米瘤黑粉菌研究進展亦表明黑粉菌的侵染需要兩個性親和單倍體一起混合接種)，因此，菰黑粉菌性親和單倍體的獲得是保障茭白人工育種的前提。而自然界中菰黑粉菌以二倍體冬孢子或者雙核菌絲存在，沒有單倍體菌株。
【發明內容】
[0004]針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種菰黑粉菌單倍體菌株UETl及其應用的技術方案。
[0005]本發明提供的一種菰黑粉菌(UstiIagoesculenta)單倍體菌株UETl能夠促使菱白人工孕茭和茭白品種改良。該菌株于2015年12月07日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC N0.11843。保藏單位地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。該菌株具有以下性質:
形態特征:短桿狀，成熟的孢子在15-20微米左右，單核無隔膜，進行芽殖(圖2)，似酵母菌，但比酵母菌大。
[0006]培養特性:固體培養(YEPS固體培養基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%瓊脂糖)菌落呈乳黃色，表面光滑，較濕潤，比細菌菌落更大更厚，挑取時比細菌粘稠，類似酵母菌落。液體培養(YEPS液體培養基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉)后菌液均一，如細菌菌液。
生理代謝特性:該菌株偏好還原性糖(圖4)和有機氮源(圖5)作為其生長的碳氮源。
[0007]培養方法:可體外培養，適于在PDA或YEPS固體培養基上進行單菌落劃線培養，在液體培養中培養容易降低該菌活性。另外該菌不適宜繼代三次以上，不適宜7天以上的連續培養或低溫放置，否則易造成活性降低或菌體降解，適宜在-80度20%甘油保藏。
[0008]繁殖方法:芽殖。
[0009]本發明的有益效果:茭白人工育種需要兩種性親和單倍體菌株的共同侵染，該菌株可以作為茭白人工育種的母體菌株，通過篩選得到其性親和的單倍體菌株后，通過人工接種方法即可以實現人工孕茭。同時該單倍體菌株可以進行基因工程改造從而為接下來的茭白品種改良，如提高茭白的環境適應性、控制結茭時間等茭白育種工作提供實施基礎材料。
【附圖說明】
[0010]圖1為UETl單倍體菌株獲得途徑示意圖；
圖2為核定位EGFP蛋白過表達的單倍體菌株芽殖形態圖；
圖3為單倍體菌株固體培養形態圖；
圖4為單倍體菌株在不同碳源培養基中的生長速率變化圖；
圖5為單倍體菌株在不同氮源培養基中的生長速率變化圖；
圖6為野茭植株人工接種菰黑粉菌后孕茭過程中茭白植株莖尖組織切片熒光顯微觀察圖，其中左邊圖為接種液中含有UETl菌株，右邊圖為接種液中不含UETl菌株；
圖7為菌種及交配型基因的PCR鑒定結果圖。
【具體實施方式】
[0011 ]以下結合實施例來進一步說明本發明。
[0012]實施例1:菌株篩選方法
I.收集冬孢子:從龍茭2號灰茭中(圖1A)直接挑取冬孢子。
[0013]2.冬孢子懸液:將挑取的冬孢子堆置于5 mL無菌水中，經4層滅菌紗布過濾，獲得較純的冬孢子懸液，最后再用無菌水將冬孢子懸液稀釋成終濃度為13個孢子/mL。冬孢子形態如圖1B所示。
[0014]3.冬孢子培養:取100 yL冬孢子懸液涂布于擔孢子分離培養基上，28°C培養約60h，以肉眼可見細小分散的單菌落(圖1C)為標準。擔孢子分離培養基(I L)配方為= K2HPO4 Ig,MgSO4.7H20 0.5 g,FeSO4.7H20 0.01g，KCl 0.5 g，葡萄糖 18 g, (NH4)2SO4 5.28 g，瓊脂10 go
[0015]4.單孢分離培養:挑取單個肉眼可見的菌落至清水中，稀釋成13個孢子/mL，每次取I yL置于顯微操作儀下用毛細吸管吸取單個擔孢子(圖1D)，將分離出的擔孢子在YEPS(2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%瓊脂粉)固體培養基上，28 0C培養4 d。一個單菌落分離5個擔孢子，取3個以上單菌落。擔孢子培養后的菌落形態如圖1E所示。
[0016]5.顯微觀察:對擔孢子形成的菌落形態用光學顯微鏡進行顯微觀察，若菌落邊緣光滑(圖1Π則可初步鑒定為單倍體菌株，若邊緣產生了菌絲(圖1G)，則舍棄。
[0017]6.性親和菌株篩選:將初步鑒定的單倍體菌株編號(圖1E)，并用YEPS液體培養基分別稀釋成濃度為OD6qq為2.0的菌液。通過融合反應實驗對性親和菌株進行初步鑒定。融合反應實驗如圖1H，具體過程為:將I號菌液先在YEPS固體培養基上進行點樣，每個點I uL，總點樣數為分離得到的單倍體菌株數。之后將剩余的各菌液各取I HL分別覆蓋于I號菌株菌點上方，標記菌株號，于28°C培養箱中培養4 d。培養后對菌落形態進行肉眼觀察，若可見白色氣生菌絲，則混合培養的兩個菌株可能為性親和單倍體菌株。如圖1H中所示，I號菌株與
2、3、4、8或11號菌株可能為性親和單倍體菌株。
[0018]7.PCR鑒定:通過對其交配型位點的克隆分析，發現菰黑粉菌中存在3個信息素受體pra基因，分別為pral、pra2和pra3，pral的核苷酸序列如SEQ ID NO: I所示，pra2的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，pra3的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。眾所周知，一個單倍體菌株中只可能存在一個pra基因，而兩個性親和的單倍體菌株中pra基因不一樣。因此設計特異性引物用于進一步對篩選得到的單倍體進行PCR驗證并進一步確認彼此間的性親和性。
[0019]以上述篩選到的12個單倍體菌株為例，提取各菌株的DNA，先通過引物ITSl和ITS4擴增ITS序列并測序進行菌種鑒定，PCR結果如圖7D所示，測序結果經NCBI比對后表明均屬于Ustilago esculenta。
[0020]接下來對各個菌株基因組DNA中的pral，pra2和pra3進行PCR擴增，結果如圖7A，B，C所示，表明2、4號菌株的信息素受體基因為pra3，3、8、ll號菌株的信息素受體基因為pra2，其余菌株的信息素受體基因為pral，即我們篩選得到的菌株I信息素受體基因為pral，與2、
3、4、8或11號菌株的基因型不一樣，因此I號菌株與2、3、4、8或11號菌株為性親和單倍體菌株。PCR擴增反應體系為:10XPCR緩沖液5 yL，dNTP 4 yL，上游引物I yL，下游引物I yL，DNA模板I yL，Taq酶0.5 yL，加ddH20至50 yl^PCR擴增程序為94 °C 4 min；94 °C 30 s，55°C 30 s，72 °C 2 min，30個循環；72 V 10 min；4 °C終止，擴增片段長度均在600 bp上下，引物序列如下:
ITSl:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)， ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示)， pral-F:5’-ATCGGCATCCTCGCTCATTATG-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示)， pral-R:5’-TGCATGCTTGATCTCCGTTGCG-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示)， pra2-F:5’-ACAGCACGCTTCCCACCTTTTC-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示)， pra2-R:5’-GACAAAGCAGCAGTGAACTGCC-3’(核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示)， pra3-F:5’-CACAATTCCCATCACGGTGCTC-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示)， pra3-R:5’-GAGCGAGAGCACTGATGGAAAG-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示)。
[0021 ] 8.確定單倍體菌株:當采用引物pral-F和pral-R擴增后得到長度在600 bp上下擴增片段的菌株確定為單倍體菌株UETl。
[0022]該菌株具有以下性質:
形態特征:短桿狀，成熟的孢子在15-20微米左右，單核無隔膜，進行芽殖(圖2)，似酵母菌，但比酵母菌大。
[0023]培養特性:固體培養(YEPS固體培養基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%瓊脂糖)菌落呈乳黃色，表面光滑，較濕潤，比細菌菌落更大更厚，挑取時比細菌粘稠，類似酵母菌落(圖3)。液體培養(YEPS液體培養基:2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉)后菌液均一，如細菌菌液。
生理代謝特性:該菌株偏好還原性糖(圖4)和有機氮源(圖5)作為其生長的碳氮源。
[0024]培養方法:可體外培養，適于在PDA或YEPS固體培養基上進行單菌落劃線培養，在液體培養中培養容易降低該菌活性。另外該菌不適宜繼代三次以上，不適宜7天以上的連續培養或低溫放置，否則易造成活性降低或菌體降解，適宜在-80度20%甘油保藏。
[0025]繁殖方法:芽殖。
[0026]
實施例2:人工孕茭試驗
通過PEG介導的原生質體轉化技術將過表達EGFP綠色熒光蛋白的載體轉化菰黑粉菌(Ustilago esculenta)單倍體菌株UETl及其性親和菌株(選取實施例1中的2號、3號)，使其過表達EGFP綠色熒光蛋白，通過熒光顯微鏡可檢測獲得的過表達菌株，成功過表達EGFP綠色熒光蛋白的菌株可在熒光顯微鏡下看到綠色熒光信號，如圖2所示。而后進行人工接種實驗，具體人工接種過程如下:
1)將兩個菰黑粉菌性親和單倍體菌株在YEPS液體培養基中28°C搖菌至OD6qq為1.0，離心收集菌體，用0.5 X YEPS液體培養基稀釋成終濃度為OD6qq為3.0的菌液，將兩菌液混合用于接菌；
2)將帶有3個以上完整節間的野茭管狀根進行育苗，25°C溫室培養20天，以萌發有3個以上小苗期植株的管狀根為接種對象，并對苗基部進行扎孔處理；
3)將步驟I)得到的混合菌液用注射器注射管狀根，直到有菌液溢出為止；
4)將處理后的接種苗進行修剪，防止過多的蒸騰作用導致植物萎焉，然后浸置于剩余的混合菌液中，25°C溫室放置12 h;
5)將浸菌后的野茭苗轉移至帶營養土的小盆中進行過渡接種，待土充分濕潤后將混合菌液倒入土中，25°C溫室培養7 d，完成接種；
6)將接種后的苗移植室外或培養箱中進行露天栽培，接種栽培時間控制在3月份，施肥參考正常茭白種植標準。
[0027]結果我們發現該菌株與其性親和菌株3號一起侵染野生茭白植株可以使野生茭白植株莖基部膨大形成茭白，而2號和3號性親和菌株混合(即缺失菌株UETl后)野生茭白植株莖基部不再膨大，即無法孕茭。對接種后兩種表型的茭白植株莖尖生長點取樣，進行組織切片后在熒光顯微鏡下觀察發現:莖基部膨大的植株中可以明顯觀察到帶有綠色熒光的菌絲，而未膨大的植株莖尖無綠色熒光信號(圖6)，表明該孕茭過程需要UETl的參與，即單倍體菌株UETl可應用于人工孕茭。
【主權項】
1.一種菰黑粉菌(Ustilagoesculenta)單倍體菌株UETl，保藏號為:CGMCC Νο.11843。2.如權利要求1所述的一種菰黑粉菌(UstiIagoesculenta)單倍體菌株UETl在菱白人工孕茭中的應用。3.如權利要求1所述的一種菰黑粉菌(UstiIagoesculenta)單倍體菌株UETl在菱白品種改良中的應用。
【文檔編號】A01H1/00GK105838616SQ201610058044
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年1月28日
【發明人】張雅芬, 崔海峰, 葉子弘, 俞曉平
【申請人】中國計量學院