一株高產黃柄曲霉素的木豆內生真菌及其應用
【專利摘要】一株高產黃柄曲霉素的木豆內生真菌及其在防治植物病害中的應用，其特征在于該株內生真菌為毛殼菌屬球毛殼菌(Chaetomium globosum)ELP-8，已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No：M 2015001，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2015年1月5日。由于本發明中的木豆內生真菌ELP-8-發酵液所產的黃柄曲霉素，對于鐮刀菌屬病原真菌具有很好的抑制作用，所以該株內生真菌具有生物防治作物類、蔬菜類及林木類等由于鐮刀菌屬侵染引起的植物病害的作用，為微生物源農藥的研發提供了新的路徑和方法。CCTCC No：M 201500120150105
【專利說明】
一株高產黃柄曲霉素的木豆內生真菌及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物工程技術領域，特別涉及一株從木豆中分離獲得的植物內生真 菌，該菌株對由于鐮刀菌屬侵染引起的作物類、蔬菜類及林木類等植物病害具有生物防治 效果。
【背景技術】
[0002] 木豆[Cajanus cajan (L. )Millsp.]，英文名 Pigeon pea，別名鶴豆、豆蓉樹、三葉 豆、樹豆、赤小豆、千年豆、蓉豆等，因其豆莢結于樹冠枝梢上，故稱木豆。木豆屬于豆科、蝶 形花亞科常綠灌木，是木豆屬一年生或多年生木本植物。在木豆屬中，現已發現32個種，木 豆是唯一的一個栽培種，并且是迄今為止世界上唯一的一種食用木本且用途最多的豆類作 物。其根、莖、葉、花、莢全身是寶，綜合價值極高，除了具有很高的經濟、生態利用價值以外， 還具有顯著的藥用價值。近年來，有木豆制劑外敷可促進開放創面愈合、木豆葉可作為"生 脈成骨片"的主要藥味以及從木豆中提取、分離有關藥用成分的報道。木豆葉的水提物對腦 缺血時腦組織中A細胞膜及微管膜的穩定性有一定的保護作用；木豆葉的乙醇粗提取物具 有抗寄生蟲的活性。
[0003] 植物內生菌是指生活史的一定階段或全部階段生活在健康植物各種組織和器官 內部，被其感染的植物（至少暫時）不表現出外在病癥的真菌或細菌類群。植物內生真菌 是植物微生態系統中的重要組成成分，它可以直接面對病菌的侵染，對病菌的致病因子或 者病菌本身發起攻擊，降解其致病因子或菌絲，并且產生拮抗物質或者誘導宿主植物產生 系統抗性抑制病原物，然而宿主植物本身的基因并未發生改變，仍然可以保持天然性狀。因 此，部分內生真菌在一定條件下可以成為詰抗菌。從冬青櫟（Quercus ilex)的一株內生真 菌發酵產物中分離得到sphaeropsidin A，其對植物病原真菌有抑制作用。Clay的研究表 明，麥角菌科（Clavicipitaceous)內生真菌對牧草植物非常有益，其能抑制對牧草植物有 害的一些植物病原真菌。分離自葡萄內生真菌（Alternaria alternata)的三個環二肽化 合物對其寄主植物的病原菌Plasmopara viticola有抑制作用，然而對其寄主植物卻沒有 毒性傷害，目前正被作為潛在的生物農藥進行研究開發。但報道木豆內生真菌的生物防治 應用方面沒有。
[0004] 鐮刀菌屬能夠侵染多種經濟作物，引起大豆、水稻、小麥、玉米、蠶豆、蔬菜等的赤 霉病，黃瓜枯萎病，棉花枯萎病和香蕉枯萎病等。農作物、蔬菜類和林木類等植物受到鐮刀 菌屬侵染所造成的經濟損失已受到人們的廣泛關注。目前針對這些植物病害的防治主要有 兩種方式：一是通過農業防治措施管理，如合理輪作，搞好耕作，適時播種和播種深度，加強 田間管理等，能對病害的防治起到一定的作用，但這類方式費工費時，操作技術缺乏規范， 可操控性差，對病害的防治效率不高；另一種是通過大量、頻繁的使用農藥，雖然短期內能 產生較好的防治效果，但是病原菌容易產生耐藥性，且農藥的大量使用會對人體健康和生 態環境構成極大的危害，同時嚴重破壞了生態平衡。
[0005] 毛殼菌是自然界中廣泛存在的子囊菌，球毛殼菌（Chaetomium globosum)是毛殼 菌屬的一種，因其對植物病害生物防治的作用而受到關注并得到較為深入的研究。楊謙等 對球毛殼菌和角毛殼菌生物防治效果以及對多菌靈抗性進行研究，并與Soytong等合作， 成功研制出毛殼菌生物防治制劑。從木豆分離出的毛殼屬球毛殼菌內生真菌可特異性產生 黃柄曲霉素，可應用于由于鐮刀菌屬侵染引起的作物類、蔬菜類及林木類植物病害的生物 防治，為微生物源農藥的開發利用拓展了新資源。
[0006] 近年來，用生物防治的方法來預防和處理植物病害的發生，越來越引起人們的關 注。這類方法的優點是安全、環保、成本低廉，同時大量減少農藥的使用。而植物內生真菌 類是一類應用前景廣闊的資源微生物，近年來已成為生防研制開發的熱點，利用植物內生 真菌進行生物防治是生態農業可持續發展的一個重要方面。因此，研究高效安全且經濟實 用的植物病害的防治方法就顯得非常重要。
【發明內容】
[0007] 本發明提供了一株高產黃柄曲霉素的木豆內生真菌及其在防治植物病害中的應 用。
[0008] 本發明一株高產黃柄曲霉素的木豆內生真菌及其在防治植物病害中的應用，其特 征在于該木豆內生真菌為毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8,已在中國典型培 養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No :M 2015001，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日 期為2015年1月5日。它在PDA固體培養基上培養3天后有菌落生長，菌落開始為白色薄 絮狀，生長約兩周后菌落直徑達到8cm，菌落表面呈灰褐色并開始出現大量的黑色小顆粒， 背面呈琥珀色。
[0009] 本發明木豆內生真菌菌株，它為毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8， 其ITS序列提交至NCBI網頁，通過BLAST搜索與所得到的序列相似性高的序列比對，并通 過MEGA4. 1軟件構建系統進化樹，ELP-8菌株的ITS序列與毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum，編號JN 582329)菌株的相似性達到了 99%，結合形態學觀察結果，確定內生真 菌ELP-8為毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)。
[0010] 本發明木豆內生真菌毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum) ELP-8,采用HPLC 法分析木豆內生真菌ELP-8的發酵液，結果在內生真菌ELP-8的發酵液中發現有黃柄曲霉 素。并通過ESI-MS/MS鑒定該化合物是黃柄曲霉素，同時采用1D-NMR譜分析進一步確認該 化合物的結構。
[0011] 本發明的木豆內生真菌毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP-8保藏編號 為CCTCC No :M 2015001，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2015年1月5日，具有 特異性產生黃柄曲霉素的能力，試驗表明該黃柄曲霉素對鐮刀菌屬病原真菌有很好的抑制 作用。
[0012] 本發明木豆內生真菌毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum) ELP-8,其發酵液中 產生黃柄曲霉素，可用于防治由于鐮刀菌屬侵染引起的作物類、蔬菜類及林木類等植物病 害。
【附圖說明】
[0013] 圖1為毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum) ELP-8的菌落形態圖和抱子顯微 結構圖；
[0014] 圖2為毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8的PCR擴增的電泳圖，其中 Μ泳道表示Marker，1泳道表示ELP-8 ;
[0015] 圖3為毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8的系統進化樹圖；
[0016] 圖4為黃柄曲霉素的ESI -級⑷和二級⑶質譜圖；
[0017] 圖5為黃柄曲霉素的1H NMR波譜（A，400MHz，DMS0)和13C NMR波譜 (B, 100MHz, DMS0)；
[0018] 圖6為黃柄曲霉素對鐮刀菌屬菌絲生長的抑制效果；
【具體實施方式】
【具體實施方式】 [0019] 一：
[0020] 本實施方式中高產黃柄曲霉素的木豆內生真菌，它為毛殼屬球毛殼菌 (Chaetomiumglobosum)ELP-8,已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No :M 2015001，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2015年1月5日。
[0021] 本實施方式中毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8,在PDA固體培養基 上培養3天后有菌落生長，菌落開始為白色薄絮狀，生長約兩周后菌落直徑達到8cm，菌落 表面呈灰褐色并開始出現大量的黑色小顆粒，背面呈琥珀色。
[0022] 本實施方式中毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8,該菌株從健康的木 豆葉中分離得到，木豆葉采自東北林業大學植物園，植株年齡3個月，植株健壯，無病蟲害， 其樣本現存于東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室；它按照以下步驟進行分離 培養：
[0023] 取剛采摘的健康的木豆葉，用蒸餾水清洗植株表面，之后依次用75%醫用酒精浸 泡30秒、5%的次氯酸鈉溶液浸泡1分鐘進行表面消毒，滅菌的去離子水沖洗3次；取表 面消毒的植物組織，用滅菌的濾紙吸干其表面的水分后用無菌的剪刀將植物組織分別剪 成2 X 2cm大小的組織塊，用無菌的鑷子將各組織塊接種于PDA培養基表面，置于培養箱中 30°C恒溫培養5-7天；待組織塊周圍長出菌落時，挑取邊緣菌絲接種于PDA培養基表面，置 于培養箱中30°C恒溫培養5-7天；重復操作過程3-5次，得到純化的菌株；將分離到的菌株 編號，接種于PDA斜面，于4°C中保存。
[0024] 結果：從健康的木豆葉中分離出內生真菌ELP-8,根據《真菌分類學》和《真菌鑒定 手冊》進行形態學鑒定，其菌落特征和孢子形態與毛殼屬球毛殼菌的特征極為相近，菌落形 態圖和孢子顯微結構如圖1所示；
[0025] 分子鑒定：內生真菌ELP-8發酵液四層紗布過濾得菌絲體KKTC烘干，提取 總DNA后進行目的片段的PCR擴增，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序；所測 定的核苷酸序列在NCBI數據庫中應用BLAST分析進行同源性比較，并根據分子生物學 研究的基本原理選擇相應種屬代表菌株的ITS序列，應用軟件MEGA4. 1以近鄰結合法 (Neighbor-joining)構建系統發育樹，bootstrap檢驗值彡75% (1000重復），確定目標菌 株的分類地位；
[0026] 內生真菌ELP-8基因組提取后，采用PCR擴增后凝膠成像結果如圖2所示，在 500bp附近得到一個擴增片段，證明已成功從內生真菌ELP-8菌株中提取出其基因組DNA ;
[0027] 根據內生真菌ELP-8的ITS序列提交至NCBI網頁，通過BLAST搜索與所得到的 序列相似性高的序列比對，并通過MEGA4. 1軟件構建系統進化樹（見圖3)，ELP-8菌株 的ITS序列與毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum,編號JN 582329)菌株的相似性 達到了 99%，結合形態學觀察結果，確定內生真菌ELP-8為毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)〇
[0028] 本實施方式中毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum) ELP-8,該菌株中的黃柄曲 霉素，通過ESI-MS/MS鑒定該化合物是黃柄曲霉素，同時采用1D-NMR譜分析進一步確認該 化合物的結構。該化合物的理化性質和ESI-MS/H-NMR以及13C-NMR的結果如下：黃色結 晶（甲醇），三氯化鐵反應呈現綠色說明含有酚羥基，紫外254nm吸收明顯。ESI-MS在負 離子掃描模式下，得到分子離子峰[m/z 195. l(M-H)]。當設定儀器的碰撞以及誘導解離 電壓（CE)為-27V時，通過二級質譜分析獲得的主要碎片離子為：m/z 166. 9,從而確定其 分子式為C9Hs05。采用1D-NMR譜分析進一步確認該化合物的結構， 1H-NMR(400MHz，DMS0): δ η 10. 3 (s，1H，H-CH0)，10. 2 (s，1H，H-CH0)，2. 5 (s，3H，Η-Me) ;13C 匪R(100MHz，DMS0) : δ ^ 194. 9 (d，C-CH0)，193. 4 (d，C-CH0)，150. 3 (s，C-l)，150. 2 (s，C-3)，136. 1 (s，C-2)，128. 2 (s， C-5)，122. 3 (s，C-6)，113. 0 (s，C-4)，10. 5 (q，C-Me)。上述波譜數據與文獻報道的黃柄曲霉素 一致，因此確定該化合物為黃柄曲霉素（見圖4和圖5)。
[0029] 本實施方式中采用牛津杯法測定黃柄曲霉素對鐮刀菌屬菌絲生長的影響。將尖孢 鐮刀菌和鐮刀枯萎菌在PDB液體培養基中培養3天，過濾除去菌絲，用無菌水將鐮刀菌屬孢 子懸浮液的濃度調為1X 105cfu/mL。取鐮刀菌孢子懸浮液lmL加入已滅菌且放置至50°C的 PDA培養基10mL中，混勻。在已經鋪好的水瓊脂培養基上擺放5個牛津杯（外徑8. 0mm，內 徑6. 0mm，高度10. 0mm)，倒入含有病原真菌的PDA培養基，靜置，凝固。分別向牛津杯中加 入100 yL黃柄曲霉素溶液（10、20、40、80 yg/mL)，3組平行，設空白對照。28°C下培養24h， 觀察并測量抑菌圈大小。
[0030] 如圖6所示，黃柄曲霉素對鐮刀菌屬菌絲生長具有明顯的抑制作用，并且隨著濃 度的增加，抑菌圈直徑增大，說明黃柄曲霉素對鐮刀菌屬表現出了很高的拮抗活性。
【具體實施方式】 [0031] 二：
[0032] 本實施方式中毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum) ELP-8,該菌株中的黃柄曲 霉素對農作物根腐病的盆栽防治效果測定如下：
[0033] 高粱粒100g放入250mL三角瓶中用水浸泡12h，濾干，高壓滅菌。每瓶中接種5mm 已活化的尖孢鐮刀菌5塊，28°C培養5天，制成干粉備用。
[0034] 土壤取自東北林業大學植物園，土壤經2次高壓滅菌（121 °C )，每次滅菌時間為2 小時，相隔1天處理。
[0035] 充分混勻10g尖孢鐮刀菌粉劑和250g已滅菌的土壤后，放入培養缽中（外直徑 6. 5cm，高8cm)。把經表面消毒的大_&、小麥、玉米種子播于培養缽中，每個培養缽10粒 種子，每組處理3個營養缽。進行灌根處理，黃柄曲霉素濃度為20、40、80、100 μ g/mL，以 多菌靈為對照，以清水處理為空白對照，每組用藥量20mL，放置于溫室培養（晝夜溫度： 24/17Γ，光照時間：14h，相對濕度：70%以上）。每隔3天對其進行同樣的灌根處理，3次重 復。培養15天考察各組處理以及對照的發病情況，計算防治效果。
[0036] 農作物根腐病分級標準：
[0037] 0 =主根、須根健全，均無病斑；
[0038] 1 =主根上有零星病斑，但不連片，須根上無病斑；
[0039] 2 =主根病斑連片，但小于根部周長的1/4,須根略有發病；
[0040] 3 =主根病斑大于根部周長的1/4,但小于1/2,須根病斑較多，但不成片；
[0041] 4 =主根病斑大于根部周長的1/2,但小于3/4,須根略微發病，部分須根脫落；
[0042] 5 =整個根部均有病斑包圍，根部腐爛，須根近無。
[0043] 發病率（％ ) = Σ發病株數/調查總株數X 100%
[0044] 病情指數=100X Σ (每個病級的植株數X級別數V(調查總植株數X發病最 高級別數）
[0045] 防治效果（％) =(對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數X 100%
[0046] 本實施方式中毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8,該菌株中的黃柄曲 霉素對農作物根腐病的盆栽防治效果測定結果如表1所示，試驗結果表明，黃柄曲霉素可 顯著地降低農作物根腐病病情指數（P〈〇. 05)。
[0047] 表1黃柄曲霉素和多菌靈的施用對農作物根腐病的防治效果
[0048]
【具體實施方式】 [0049] 三：
[0050] 本實施方式中毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8,該菌株中的黃柄曲 霉素對蔬菜枯萎病的盆栽防治效果測定如下：
[0051] 高粱粒100g放入250mL三角瓶中用水浸泡12h，濾干，高壓滅菌。每瓶中接種5mm 已活化的鐮刀枯萎菌5塊，28°C培養5天，制成干粉備用。
[0052] 土壤取自東北林業大學植物園，土壤經2次高壓滅菌（121 °C )，每次滅菌時間為2 小時，相隔1天處理。
[0053] 充分混勻10g鐮刀枯萎菌粉劑和250g已滅菌的土壤后，放入培養缽中（外直徑 6. 5cm，高8cm)。把經表面消毒的黃瓜、辣椒、前子種子播于培養缽中，每個培養缽10粒 種子，每組處理3個營養缽。進行灌根處理，黃柄曲霉素濃度為20、40、80、100 μ g/mL，以 多菌靈為對照，以清水處理為空白對照，每組用藥量20mL，放置于溫室培養（晝夜溫度： 24/17Γ，光照時間：14h，相對濕度：70%以上）。每隔3天對其進行同樣的灌根處理，3次重 復。培養15天考察各組處理以及對照的發病情況，計算防治效果。
[0054] 蔬菜枯萎病分級標準：
[0055] 0級，無病癥；
[0056] 1級，莖葉輕微癥狀；
[0057] 2級，植株輕度萎蔫，莖出現壞死斑，葉片黃化；
[0058] 3級，植株中度萎蔫，葉片下垂黃化；
[0059] 4級，植株嚴重萎蔫，倒伏枯死。
[0060] 發病率（％ ) = Σ發病株數/調查總株數X 100%
[0061] 病情指數=100X Σ (每個病級的植株數X級別數V(調查總植株數X發病最 高級別數）
[0062] 防治效果（％) = (對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數X 100%
[0063] 本實施方式中毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8,該菌株中的黃柄曲 霉素對蔬菜枯萎病的盆栽防治效果測定結果如表2所示，試驗結果表明，黃柄曲霉素可顯 著地降低蔬菜枯萎病病情指數（P〈〇. 05)。
[0064] 表2黃柄曲霉素和多菌靈的施用對蔬菜枯萎病的防治效果
[0065]
【具體實施方式】 [0066] 四：
[0067] 本實施方式中毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8,該菌株中的黃柄曲 霉素對林木立枯病的盆栽防治效果測定如下：
[0068] 高粱粒100g放入250mL三角瓶中用水浸泡12h，濾干，高壓滅菌。每瓶中接種5mm 已活化的尖孢鐮刀菌5塊，28°C培養5天，制成干粉備用。
[0069] 土壤取自東北林業大學植物園，土壤經2次高壓滅菌（121 °C )，每次滅菌時間為2 小時，相隔1天處理。
[0070] 充分混勻10g尖孢鐮刀菌粉劑和250g已滅菌的土壤后，放入培養缽中（外直徑 6. 5cm，高8cm)。將健康無病害3月齡的落葉松、紅豆杉、樟子松苗經表面消毒后移栽于培 養缽中，進行灌根處理，黃柄曲霉素濃度為20、40、80、100 μ g/mL，以清水處理為空白對照， 每組用藥量20mL，放置于溫室培養（晝夜溫度：24/17°C，光照時間：14h，相對濕度：70%以 上）。每隔3天對其進行同樣的灌根處理，3次重復。培養15天考察各組處理以及對照的 發病情況，計算相對防治效果。
[0071] 感病率=病株/ (病株+健株）X 100%
[0072] 相對防效=(對照感病率-處理感病率）/對照感病率X 100 %
[0073] 本實施方式中毛殼屬球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8,該菌株中的黃柄曲 霉素對林木立枯病的盆栽防治效果測定結果如表3所示，試驗結果表明，黃柄曲霉素可顯 著地降低林木立枯病病情指數（P〈〇. 05)。
[0074] 表3黃柄曲霉素的施用對林木立枯病的防治效果
[0075]
[0076] 序列表 <110>東北林業大學付玉杰 <120>-株高產黃柄曲霉素的木豆內生真菌及其在防治植物病害中的應用 160、1 <210> 1 <211>555 <212>ITSL ITS4 <213>球毛殼菌（C7?"故) ELP-8 <400 1 g gg ga a1111 aggagc t g c a a ae tc cc e t a a ac c a11 gt g a c g ttae Gta 1 age gtt get 6 0 tcggcgggcg gccccggggi Uaccccccg ggcgcccclg ggccccaccg cgggcgcccg i 20 c c g g a g g i c a c c a a a c l c U g a 1 a a li 1 a t g g c c 1 c 1. c 1 g a g i c U c 1 g 1 ac l gaat aag 18 0 teaaaacttt Gaacaacgga t c t c u g g l t ctggcatcga t g a a g aa c g g a g c g a a a i g c 240 g a ? a ι? g i a a l g t g a a Π g c a g a a l ? c a g l g a a i c a i c g a a t c ? 11 g a a c g c a c a i l g c g c 3 0 0 ccgccagca 1 tctggcgggc algcc 1 g11 c gagcgtca li icaaccal ca agccccc ggg 3 60 c t ? g L g 11 g g g g a c c t g c g g clgccgcagg c c c i g a a a a g cagtggcggg cicgclgR'g 42 0 caccgagcgt agtagcatae ate teg etc t ggtcgcgcG g c g g g t i c c g g ccgttaaaec 48 0: accUUaac c c a a g g u g a c c l c g g a l c a gglaggaaga cccgctgaac u a a g c a t a l 540 caalaagcgg aggaa 555
【主權項】
1. 一株高產黃柄曲霉素的木豆內生真菌及其在防治植物病害中的應用，其特征在于它 為球毛殼菌（Chaetomium globosum)ELP_8,已在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號 為CCTCC No :M 2015001，保藏地址為武漢市武漢大學，保藏日期為2015年1月5日。2. 根據權利要求1所述的一株高產黃柄曲霉素的木豆內生真菌及其在防治植物病害 中的應用，其特征在于所述的木豆內生真菌，其發酵液中的黃柄曲霉素具有抑制鐮刀菌屬 病原真菌的活性。3. 根據權利要求1所述的一株高產黃柄曲霉素的木豆內生真菌及其在防治植物病害 中的應用，其特征在于所述的木豆內生真菌具有防治由于鐮刀菌屬侵染所引起的作物類、 蔬菜類及林木類等植物病害的作用。
【文檔編號】A01P3/00GK105838613SQ201510016944
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月14日
【發明人】付玉杰, 姚美玲, 高暢, 孫姣, 王微, 趙春建, 顧成波
【申請人】東北林業大學, 付玉杰