一種高通量細胞聯合培養芯片的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高通量細胞聯合培養芯片，包括N組培養平臺，N≥1，多組培養平臺呈圓形發散狀分布，N組培養平臺之間或相對獨立，或每組之間通過微橋依次連通，或選擇性的相鄰兩組至相鄰（N?1）組之間通過微橋連通；每組培養平臺包括三層結構，由內向外依次連接的內層營養液灌注單元、中間層生物膠灌注單元和外層細胞培養單元，三者之間通過微橋連通；每組培養平臺中包括1?10個細胞培養單元，相鄰細胞培養單元之間通過微橋連通；本發明的細胞聯合培養芯片，多種細胞不接觸，使得細胞的生長環境更接近于體內的生長環境，且操作方便，便于臨床應用。
【專利說明】
一種高通量細胞聯合培養芯片
技術領域
[0001]本發明屬于細胞生物醫學領域，具體涉及一種能夠實現高通量的細胞聯合培養芯片。
【背景技術】
[0002]微流控芯片具有成本低、設備小、高度集成、樣本消耗少等優點，被廣泛應用到細胞生物領域。細胞生物學研究正從對單種細胞的觀察和研究，發展到對多種細胞相互作用的觀察和研究。對于復雜的生物學體系，需要多種細胞同時存在的平臺才能更好的模擬真實存在的細胞微環境。從而更全面深入的探索細胞之間的復雜網絡以及介導它們之間相互作用的信號通路等。細胞聯合培養是研究細胞與細胞之間相互作用比較常用的方法。
[0003]常規的細胞混合培養，雖可解決離體狀態下多細胞間相互作用問題，同時起到了一定的模擬體內環境的作用，但當前，基于細胞培養的微流控芯片多限于兩種或四種細胞聯合培養，或一種目標細胞與其他多種細胞混合培養，一種芯片上可同時培養的細胞種類較少，通量小、效率低，此狀態下，離體細胞表型與離體前差異較大，限制了對微環境中各細胞組分進行觀察，若對此狀態下的細胞進行化療藥物的敏感性檢測，則會限制對結果判定的準確性，無法更真實的模擬體內真實環境。另外，當前用于藥篩的微流控芯片的培養室灌流通道與營養液灌注通道及藥物灌注通道之間無微橋一類的連接結構，多為兩條相對獨立平行的通道，限制了營養液灌注通道及藥物灌注通道與細胞培養室的接觸面積。
【發明內容】
[0004]本發明為了克服一種芯片上可同時培養的細胞種類較少、通量小的技術缺陷，涉及一種高通量細胞聯合培養芯片，包括N組培養平臺，N 2 I，多組培養平臺呈圓形發散狀分布，N組培養平臺之間或相對獨立，或每組之間通過微橋依次連通，或選擇性的相鄰兩組至相鄰(N-1)組之間通過微橋連通;每組培養平臺包括三層結構，由內向外依次連接的內層營養液灌注單元、中間層生物膠灌注單元和外層細胞培養單元，三者之間通過微橋連通;每組培養平臺中包括1-1 O個細胞培養單元，相鄰細胞培養單元之間通過微橋連通。
[0005]所述內層營養液灌流單元包括依次連接的進液口、液體流道、液體池、液體流道、出液口；為了增大液體池的面積，增大營養液的儲存容量，為細胞持續提供營養，所述液體池采用三角形漏斗形狀，多個培養平臺中的液體池的頂點指向同一圓心。
[0006]進一步的，所述細胞培養單元包括細胞進口，一端封閉，另一端通過細胞流道連接細胞培養室;所述培養室的另一端通過細胞流道連接細胞出口 ；所述培養室為方形。
[0007]進一步的，所述中間層生物膠灌注單元設有進膠口、膠體流道和出膠口；所述膠體流道上與所述細胞培養室接觸的地方設有微橋。
[0008]為了增加細胞培養室與生物膠灌注單元及營養液灌注單元的接觸面積，所述膠體流道包括一條主道和(N-1)條分支，主道形成整個生物膠灌注單元的框架，跨過整個細胞培養單元，首端和末端分別連接進膠口和出膠口；分支位于每兩個細胞培養單元之間，用于將相鄰的細胞培養單元通過微橋連通，首端與主道連通，末端連接出膠口。
[0009]為了保證膠體流道中的基質膠可以剛好充滿微橋，由于表面張力的作用，基質膠不會溢出微橋，所述微橋長為400-1000μπι，寬為50-100μπι，兩個微橋的間距為400-600μπι。
[0010]優選的，細胞培養單元與生物膠灌注單元之間及生物膠灌注單元與營養液灌注單元之間的微橋長為400-500μπι，寬為50-60μπι，兩個微橋的間距為400-500μπι。
[0011]優選的，相鄰兩組培養平臺之間的微橋長為900-1000μπι，寬為50-80μπι，間距為500_600ymo
[0012]為了保證營養液中的營養成分足夠滿足細胞培養數量，所述細胞聯合培養芯片包括4-8組培養平臺，每組培養平臺中包括3-10個細胞培養單元，相鄰細胞培養單元之間通過微橋連通。優選的，包括四組培養平臺，呈十字分布，四組培養平臺之間或相對獨立，或依次全部連通，或兩兩連通;每組培養平臺中包括三個細胞培養單元，相鄰細胞培養單元之間通過微橋連通
與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:本發明可以根據培養平臺和細胞培養單元的數量，形成多種細胞共培養，高通量，可實時連續觀察多種細胞間的相互影響，更真實的模擬體內環境。根據培養平臺之間是否連通，可自由組合成幾組共培養平臺，根據不同實驗需求進行相應操作，實現多種實驗操作的功能。不同組合的共培養平臺上可以進行對照實驗，方便觀察實驗結果，可避免外界環境因素對對照實驗結果的影響。
[0013]
【附圖說明】
[0014]圖1為實施例1中12種細胞共培養芯片的微結構示意圖；
圖2為實施例1中2組6種細胞共培養芯片的微結構示意圖；
圖3為實施例1中4組3種細胞共培養芯片的微結構示意圖；
圖4為實施例1單個細胞培養平臺的微結構示意圖；
圖5為圖4中單組營養液灌注單元示意圖；
圖6為圖4中多組營養液灌注單元示意圖；
圖7為圖4中生物膠灌注單元示意圖；
圖8為圖4中細胞培養單元示意圖；
圖9為實施例1中細胞共培養芯片三維示意圖；
圖中標注:1.營養液灌注單元，1.1進液口，1.2液體流道，1.3液體池，1.4出液口；
2.生物膠灌注單元，2.1進膠口，2.2膠體流道，2.3出膠口；3.細胞培養單元，3.1細胞進口，3.2細胞流道，3.3細胞培養室，3.4細胞出口；4.微橋;5.進液柱;6.負壓吸引裝置;10.培養平臺。
[0015]
【具體實施方式】
[0016]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下將結合附圖和實施例，對本發明作進一步詳細說明。
[0017]本實施例提出了一種高通量細胞聯合培養芯片，多種細胞不接觸，使得細胞的生長環境更接近于體內的生長環境，且操作方便，便于臨床應用。
[0018]所述細胞聯合培養芯片，包括殼體、載體和微結構;所述殼體與載體封接而成，殼體材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)，該材料具有可塑性好、理化性質穩定、無毒無味、透明、通氣性良好的優良性能，適宜作為本發明的殼體材料。所述殼體的厚度為3_5mm。所述載體的材料為玻璃。
[0019]所述微結構位于殼體內表面，所述微結構為腔道，所述腔道的高度為50-100μπι。所述微結構包括N組培養平臺10，Ν 2 I，多組培養平臺10呈圓形發散狀分布，N組培養平臺之間或相對獨立，或每組之間通過微橋4依次連通，或選擇性的相鄰兩組至相鄰(N-1)組之間通過微橋4連通，例如可以是相鄰的兩組連通、或相鄰的三組連通、或相鄰的(N-1)組連通。
[0020]如圖4所示，每組培養平臺10包括三層結構，由內向外依次連接的內層營養液灌注單元1、中間層生物膠灌注單元2和外層細胞培養單元3，三者之間通過微橋4連通;每組培養平臺中包括1-10個細胞培養單元3，相鄰細胞培養單元之間通過微橋連通。
[0021]如圖5所示，所述內層營養液灌流單元I包括進液口1.1、液體流道1.2、液體池1.3和出液口 1.4;為了方便進液和出液，所述進液口和出液口均穿過殼體將腔道與外界連通；所述液體流道和液體池位于殼體和載體之間。所述營養液灌流單元I的形狀是圍繞其內部的細胞培養單元和生物膠灌注單元所形成的形狀而定，其形狀設定要求既可以為細胞培養室持續提供營養又能夠方便不同組織間的連接，本實施例的液體池采用三角形漏斗形狀，多個培養平臺呈圓形發散狀分布，即培養平臺中的液體池的頂點指向同一圓心，如圖6所示，有利于增大液體池的面積，增大營養液的儲存容量，為細胞持續提供營養。
[0022]所述進液口1.1與進液柱5連接，通過進液柱5將營養液注入營養液灌流單元I中。所述出液口 1.4連接負壓吸引裝置6，開始灌液時所述負壓吸引裝置6提供負壓，使得進液柱5內的液體開始流動，當液體從進液口經液體流道進入出液口時，取下負壓吸引裝置6，此時進液柱內的液體會由自身液面高度差的重力作用持續流動，達到持續灌流的目的。所述負壓吸引裝置可以是負壓吸引微量注射器。
[0023]所述進液柱5為上口寬下口窄的瓶體，容量為200_300yL，所述瓶體的下口直徑為0.8-lmm，上口直徑為4_6mm，瓶體高度為40_45mm，灌液時進液柱的液面高度為25_35mm。
[0024]本實施例的營養液灌流單元，操作簡便易行，僅采用負壓吸引裝置及重力作用便可維持灌流液在該系統持續穩定灌流，不需微量栗維持，減少了細胞培養過程中污染的幾率，適合臨床上細胞聯合培養的大規模應用。
[0025]如圖6所示，所述中間層生物膠灌注單元2位于內層營養液灌流單元I與外層細胞培養單元3之間，有進膠口 2.1，膠體流道2.2和出膠口 2.3;所述膠體流道上與所述細胞培養室接觸的地方設有微橋。所述膠體流道2.2包括一條主道和(N-1)條分支，主道形成整個生物膠灌注單元的框架，跨過整個細胞培養單元，首端和末端分別連接進膠口 2.1和出膠口2.3；分支位于每兩個細胞培養單元之間，用于將相鄰的細胞培養單元通過微橋連通，首端與主道連通，末端連接出膠口 2.3。
[0026]所述膠體流道內灌注基質膠;所述基質膠為溫度敏感性生物膠，在O- 4 °C時為液體狀態，此時灌注于生物膠灌注單元中，使其充滿膠體流道及各個微橋，在37 °C維持8-12h，開始呈凝膠狀，具有一定的強度。所述基質膠的濃度以及微橋的長度、寬度以及膠體流道的長度、寬度設計，均為了保證基質膠可以剛好充滿微橋，由于表面張力的作用，基質膠不會溢出微橋。因此，設置微橋長為400-1000μπι，寬為50-100μπι，兩個微橋的問距為400-600μπι，膠體流道的寬度為150-250μηι，能夠滿足要求，優選的，細胞培養單元與生物膠灌注單元之間及生物膠灌注單元與營養液灌注單元之間的微橋長為400-500μπι、寬為50-60μπι、間距為400-500μπι，膠體流道的寬度為200-220μπι;相鄰兩組培養平臺之間的微橋長為900-1000ym，寬為50-80μηι，間距為500-600μηι。凝膠狀的基質膠可以允許營養液灌流通道中的小分子營養物質及化療藥物通過，而不允許細胞通過，從而可以充分保障營養物質和化療藥物彌散至細胞培養室中；也可以允許細胞因子通過，如細胞代謝產生的生物蛋白、小分子有機物及無機物，使得不同細胞培養室內的不同細胞相互影響。
[0027]所述外層細胞培養單元3位于中間層生物膠灌注單元2外側，如圖8所示，包括細胞進口 3.1，一端封閉，另一端通過細胞流道3.2連接細胞培養室3.3;所述培養室3.3的另一端通過細胞流道3.2連接細胞出口 3.4;優選的培養室3.3為方形。每組培養平臺10中的多個細胞培養單元3平行排列，相鄰細胞培養室3.3之間通過膠體流道上的微橋4連通。所述生物膠灌注單元2包圍每個細胞培養單元3，以增大培養室3.3與營養液灌注單元I的接觸面積。
[0028]在所述細胞培養室3.3內灌注稀釋膠和細胞的混合物，所述稀釋膠是使用完全培養液將基質膠稀釋4-8倍后得到的，所述完全培養液是一種在基本培養液內加入一些富含氨基酸、維生素和堿基之類的天然物質，即加入生長因子，可用來滿足微生物的各種營養缺陷型菌株的生長需要。所述稀釋膠使得細胞處于三維培養狀態，細胞在稀釋膠內的濃度為106-107/ml。所述多個細胞培養室中可以培養多種細胞，實現細胞的聯合培養，不同類型細胞彼此間不接觸，但其產生的細胞因子可以通過微橋中的基質膠，彌散到整個體系中，實現更接近實體狀態下的微環境模擬，使得在芯片上培養細胞更接近于體內環境。
[0029]實施例1
如圖1-3所示的細胞聯合培養芯片包括四組培養平臺，呈十字形分布，每組培養平臺包括三個細胞培養單元。每組培養平臺中的膠體流道2.2包括一條主道和兩條分支，兩條分支分別在三個細胞培養單元之間，將三個細胞培養單元通過微橋連通。本實施例中細胞培養單元與生物膠灌注單元之間及生物膠灌注單元與營養液灌注單元之間的微橋長為400μηι、寬為50μηι、間距為400μηι，膠體流道的寬度為200μηι;相鄰兩組培養平臺之間的微橋長為900μηι，寬為50μηι，間距為500μηι。
[0030]四組培養平臺的液體池1.3之間也可以通過微橋依次連通，如圖1所示，可實現12種細胞共培養，高通量，同時觀察12種細胞間的相互影響，更真實的模擬體內環境。四組培養平臺中可以通過微橋兩兩連通，如圖2所示，可實現2組6類細胞共培養。四組培養平臺之間可以相互獨立，如圖3所示四組培養平臺之間沒有連通，可實現4組3類細胞共培養。后兩種情況不僅可以模擬人體內環境，同時還可以在一張芯片上做對照試驗，使觀察結果一目了然。
[0031]以上實施例僅是本發明若干種優選實施方式中的幾種，應當指出，本發明不限于上述實施例;對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換;而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1.一種高通量細胞聯合培養芯片，其特征在于，包括N組培養平臺，N 2 I，多組培養平臺呈圓形發散狀分布，N組培養平臺之間或相對獨立，或每組之間通過微橋依次連通，或選擇性的相鄰兩組至相鄰(N-1)組之間通過微橋連通;每組培養平臺包括三層結構，由內向外依次連接的內層營養液灌注單元、中間層生物膠灌注單元和外層細胞培養單元，三者之間通過微橋連通;每組培養平臺中包括1-10個細胞培養單元，相鄰細胞培養單元之間通過微橋連通。2.根據權利要求1所述的高通量細胞聯合培養芯片，其特征在于，所述內層營養液灌流單元包括依次連接的進液口、液體流道、液體池、液體流道、出液口 ；所述液體池采用三角形漏斗形狀，多個培養平臺中的液體池的頂點指向同一圓心。3.根據權利要求1所述的高通量細胞聯合培養芯片，其特征在于，所述細胞培養單元包括細胞進口，一端封閉，另一端通過細胞流道連接細胞培養室;所述培養室的另一端通過細胞流道連接細胞出口 ；所述培養室為方形。4.根據權利要求3所述的高通量細胞聯合培養芯片，其特征在于，所述中間層生物膠灌注單元設有進膠口、膠體流道和出膠口 ；所述膠體流道上與所述細胞培養室接觸的地方設有微橋。5.根據權利要求4所述的高通量細胞聯合培養芯片，其特征在于，所述膠體流道包括一條主道和(N-1)條分支，主道形成整個生物膠灌注單元的框架，跨過整個細胞培養單元，首端和末端分別連接進膠口和出膠口；分支位于每兩個細胞培養單元之間，用于將相鄰的細胞培養單元通過微橋連通，首端與主道連通，末端連接出膠口。6.根據權利要求1所述的高通量細胞聯合培養芯片，其特征在于，所述微橋長為400-.1000μπι，寬為50-100μπι，兩個微橋的間距為400-600μπι。7.根據權利要求6所述的高通量細胞聯合培養芯片，其特征在于，細胞培養單元與生物膠灌注單元之間及生物膠灌注單元與營養液灌注單元之間的微橋長為400-500μπι，寬為.50-60μπι，兩個微橋的間距為400-500μπι。8.根據權利要求6所述的高通量細胞聯合培養芯片，其特征在于，相鄰兩組培養平臺之間的微橋長為900-1000μπι，寬為50-80μπι，間距為500-600μπι。9.根據權利要求1所述的高通量細胞聯合培養芯片，其特征在于，包括4-8組培養平臺，每組培養平臺中包括3-10個細胞培養單元，相鄰細胞培養單元之間通過微橋連通。10.根據權利要求9所述的高通量細胞聯合培養芯片，其特征在于，包括四組培養平臺，呈十字分布，四組培養平臺之間或相對獨立，或依次全部連通，或兩兩連通;每組培養平臺中包括三個細胞培養單元，相鄰細胞培養單元之間通過微橋連通。
【文檔編號】C12M3/00GK105838606SQ201610400086
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】牛海濤, 王云超, 王建寧
【申請人】牛海濤