一種復合磁性納米粒子Fe<sub>3</sub>O<sub>4</sub>/MPS/PAA/NTA-Ni<sup>2+</sup>及其制備方法和其在分離純化組氨酸標 ...的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種復合磁性納米粒子Fe3O4/MPS/PAA/NTA?Ni2+及其制備方法和其在分離純化組氨酸標簽蛋白質中的應用，屬于納米磁性材料和生物分析技術領域。本發明以平均水合粒徑為100～400nm的Fe3O4磁性納米粒為核，采用MPS表面修飾使其表面富含雙鍵，通過PAA包覆得到平均水合粒徑為100～600nm的多羧基結構磁性納米粒子，然后進一步偶聯NTA?Ni2+得到具有快速磁場響應性的復合磁性納米粒子Fe3O4/MPS/PAA/NTA?Ni2+。本發明制得的復合磁性納米粒子可在納米尺度上控制包覆層的厚度，制得的復合磁性納米粒子尺寸分布均勻，磁性強，成本低，具有較高的富集和分離純化組氨酸標簽蛋白質的能力，對組氨酸標簽蛋白質的純化效率可高達40～70μg/mg復合磁性納米粒子，且可重復使用。
【專利說明】
一種復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-N i2+及其制備方法 和其在分離純化組氨酸標簽蛋白質中的應用
技術領域
[0001 ]本發明屬于納米磁性材料和生物分析技術領域，具體涉及一種復合磁性納米粒子 Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni2+及其制備方法和其在分離純化組氨酸標簽蛋白質中的應用。
【背景技術】
[0002] 傳統的蛋白質分離純化方法有電泳、層析、離心、透析、過濾等，其中金屬螯合親和 色譜方法被認為是最有效的方法之一。雖然金屬螯合親和色譜方法在組氨酸標簽蛋白質分 離純化方面有很多優勢，但仍存在效率低、成本高、分離純化步驟繁瑣等缺點，從而無法達 到分離要求。金屬螯合親和色譜方法和磁分離技術相結合對蛋白質進行分離純化已成為生 物醫學研究以及生物工程技術領域的一個研究熱點。它是通過對磁性納米顆粒進行表面改 性，與能被目標蛋白質結合的配基偶聯，利用外部磁場實現蛋白質的分離純化。該法具有操 作簡單、快速、高效富集和高重復使用率等優點。
[0003] 核殼結構復合磁性納米粒子因具有分散性和穩定性好、易于表面功能化等優點得 到廣泛應用。徐兵等采用NTA對鉑鐵合金納米顆粒進行表面修飾，再螯合鎳離子應用于分離 純化組氨酸標簽的重組蛋白，結果表明其純化效率相比市售的商業磁性微球大大提高(Xu C，Xu K，Gu H,Zhong X,Guo Z，etal·Nitrilotriacetic Acid-Modified Magnetic Nanoparticles as a General Agent to Bind Histidine-Tagged Proteins · J. Am. Chem. Soc · 2004，126，3392 ·)，但由于合成的鉬鐵合金納米顆粒只有10nm， 磁響應性較低，較難實現在外磁場操控下的快速吸附與移動，從而受到一定限制。美國專利 (USP4654267)公開了一種應用于蛋白質分離純化的高分子磁性微球，但合成過程繁瑣，所 得磁性微球的磁響應程度低。韓國的一個小組合成了修飾鎳離子的磁性納米粒子，成功的 應用于組氨酸標簽蛋白質的分離純化，但它的磁響應性很弱（2emu/g)，不利于提高蛋白質 的分離純化效率。另外，Xie等以PEI為交聯劑，在磁性納米顆粒表面包覆上金殼，然后再用 NTA修飾并與Ni2+螯合，所得納米復合物可以快速、選擇性地分離出組氨酸標簽蛋白質(Xie Η.-Y.,Zhen R.,etal.Fe3〇4/Au Core/Shel1 Nanoparticles Modified with Ni2+- Nitrilotriacetic Acid Specific to Histidine-Tagged Proteins , J. Phys. Chem. C2010,114,4825-4830.)，然而該納米復合物表面單層結合組氨酸標簽蛋白 質，吸附容量不高。
【發明內容】
[0004] 針對上述現有技術存在的不足，本發明的目的在于提供一種復合磁性納米粒子 Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni2+及其制備方法和其在分離純化組氨酸標簽蛋白質中的應用。本發 明制備方法簡單，制得的Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni2+復合磁性納米粒子穩定性高、粒徑分布 窄、可高效富集和快速分離純化組氨酸標簽蛋白質。
[0005] 為了實現本發明的上述第一個目的，本發明采用如下技術方案：
[0006] 本發明的一種復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni 2+，是由磁性Fe3〇4納米粒 子為核，通過MPS在其表面引入雙鍵，再加入丙烯酸單體在Fe3〇4/MPS表面聚合形成聚丙烯酸 殼，最后與NTA-Ni2+偶聯得到，所述復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+的分子結構 式如下式一所示：
[0007]
[0008]其中：所述的MPS為(3_(異丁烯酰氧基)_丙基三甲氧基硅烷），所述的PAA為聚丙烯 酸，所述的NTA為次氮基三乙酸。
[0009] 進一步地，上述技術方案中所述的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni 2+的 平均水合粒徑為100nm~600nm。
[0010] 本發明的另一目的在于提供上述所述的復合磁性納米粒子Fe304/MPS/PAA/NTA- Ni2+的制備方法，所述方法包括如下步驟：
[0011 ]步驟一：溶劑熱法制備磁性Fe3〇4納米粒子，具體步驟如下：將六水合氯化鐵 (FeCl3 · 6H20)、醋酸銨(NH4AC)和檸檬酸鈉溶解于乙二醇中，在170°C下劇烈攪拌lh，冷卻后 轉移至聚四氟乙烯反應釜中，于200°C反應8~16h，冷卻至室溫，磁分離或離心分離，將制得 的磁性Fe3〇4納米粒子用無水乙醇洗滌3~4次后分散在無水乙醇中；
[00?2] 步驟二:采用MPS對磁性Fe3〇4納米粒子進行表面改性，具體步驟如下:將步驟一制 得的Fe3〇4納米粒子進行磁分離后分散在無水乙醇和超純水中，混合攪拌，加入濃氨水和正 硅酸四乙酯(TE0S)，室溫下攪拌2~6h;再加入MPS于70°C下反應3~10h，將所得產物進行磁 分離，得到Fe3〇4/MPS，用無水乙醇洗滌3次后分散在乙腈中，制得Fe3〇4/MPS的乙腈分散液； [0013] 所述的Fe304、TE0S、MPS、濃氨水質量之比為l:0·2~2:2~10:10~60。
[0014] 步驟三:制備核殼Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子，具體步驟如下：取上述步驟二 制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液轉移至三口燒瓶中，超聲分散，依次加入丙烯酸(AA)、N，N-亞 甲基丙稀酰胺(bis-AM)、偶氮二異丁腈(AIBN)，通N2混合攪拌10~20min，然后加熱至40~ 60°C并在此溫度下保持3~6h，將所得產物進行磁分離，得到Fe3〇4/MPS/PAA，再用無水乙醇 洗滌3~4次，最后分散在超純水中；
[0015]所述的Fe304/MPS、丙烯酸、N，N_亞甲基丙烯酰胺、偶氮二異丁腈的質量之比為1:2 ~10:0.1~1:0·01~0·1〇
[0016] 步驟四：Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子與NTA-Ni2+偶聯，具體步驟如下：取步驟 三所述制得的Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圓底燒瓶中，分別加入1-(3-甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)和N-羥基丁二酰亞胺（NHS)，室溫攪拌，再加入次氮基三乙酸 (ΝΤΑ)，室溫攪拌20~28h，然后進行磁分離，將所得產物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)用去離子水洗 滌3次，最后分散在超純水中，最后加入六水合氯化鎳(NiCl2 · 6H2O)，室溫攪拌0.5~4h，磁 分離，用去離子水洗滌3次后分散在結合緩沖液中，于4°C下保存，即制得所述的復合磁性納 米粒子?63〇4/]\0^/?44/犯'4-附2+;
[0017] 所述的？63〇4/]\0^/?厶厶40(：、順5、1^\的質量比為：卩63〇4/]\0^4^厶40(：:順5 :1^\ = 1:2 ~5:2 ~5:0.2 ~1〇
[0018] 進一步地，上述技術方案中步驟一所述制得的磁性Fe3〇4納米粒子的平均水合粒徑 為100~400nm，分布系數(PDI)為0.01~0 · 2，Zeta電位為0~-30mv，制得的磁性Fe3〇4納米粒 子具有較強的磁性，穩定性高，且在水溶液中具有良好的分散性。
[0019] 進一步地，上述技術方案中步驟三所述制得的Fe3〇4/MPS/PAA磁性納米粒子的平均 水合粒徑為100~600nm，PDI為0.1~0.3，Zeta電位為0~-35mv〇
[0020] 進一步地，上述技術方案中步驟四所述制得的Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+復合磁性 納米粒子的平均水合粒徑為100~600nm，PDI為0.1~0.3，Zeta電位為0~-15mv。
[0021 ]進一步地，上述技術方案中步驟四所述的六水合氯化鎳的加入量為Fe3〇4/MPS/ PAA/NTA質量的5~50倍。
[0022]更進一步地，上述技術方案中所述的六水合氯化鎳的濃度為0.1~1.0M。
[0023] 進一步地，上述技術方案中步驟四所述的結合緩沖液為含有500mM NaCl和5mM咪 唑的20mM PBS緩沖液，pH為7.4。
[0024] 本發明還一目的在于提供上述所述復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+在 分離純化組氨酸標簽蛋白質中的應用，具體應用方法為:首先采用結合緩沖液配制lmg/mL 的組氨酸標簽蛋白質溶液，取配制好的蛋白質溶液于EP管中，加入所述Fe3〇4/MPS/PAA/NTA- Ni2+復合磁性納米粒子，室溫孵育0.5~4h，磁分離，采用洗脫緩沖液洗脫2~3次后，收集上 清液，包括原液和洗脫液，分別用SDS-PAGE電泳和紫外分光光度計檢測蛋白質濃度，得到分 離純化效率。
[0025] 所述的洗脫緩沖液為含有500禮他(：1和25〇1111咪唑的2〇1111?83緩沖液，？!1為7.4。
[0026] 所述的復合磁性納米粒子?63〇4/^3^^/1^\-附2+與蛋白質的質量比為1:0.03~ 0.1。
[0027]與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
[0028] (1)本發明是以平均水合粒徑為100~400nm的Fe3〇4磁性納米粒為核，采用MPS表面 修飾使其表面富含雙鍵，通過PAA包覆得到平均水合粒徑為100~600nm的多羧基結構磁性 納米粒子，然后進一步偶聯NTA-Ni2+得到具有快速磁場響應性的復合磁性納米粒子Fe3〇4/ MPS/PAA/NTA-Ni2+；
[0029] (2)本發明的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+的平均水合粒徑為100~ 600nm，通過鎳離子與組氨酸殘基作用實現了對組氨酸標簽蛋白質的高效富集和快速分離 純化，本發明能在30秒內完成蛋白質的磁分離過程，大大簡化了純化操作過程，并且大大提 高了對組氨酸標簽蛋白質的結合效率；
[0030] (3)本發明采用復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+為載體，保證了在外磁 場作用下快速分離特性，使整個分離純化過程簡便、高效;而且，本發明采用了多羧基超支 化聚丙烯酸分子與NTA-Ni2+偶聯，具有更高效螯合金屬離子的能力，從而保證了對組氨酸標 簽蛋白質的高效富集和純化效率;經本發明制備得到的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/ NTA-Ni2+的平均水合粒徑為100~600nm，對組氨酸標簽蛋白質的純化效率可高達40~70yg/ mg復合磁性納米粒子，可作為一種新型高效的純化蛋白載體。
【附圖說明】
[0031]圖1為本發明實施例4制得的Fe3〇4納米粒子的透射電鏡圖；
[0032]圖2為本發明實施例1制得的磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA的透射電鏡圖；
[0033]圖3為本發明實施例1制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的透射電 鏡圖；
[0034]圖4為本發明應用試驗例3中Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+分離純化目標蛋白質得到的 SDS-PAGE圖，其中：Lane M:蛋白質分子量標記物;Lane 1:復合磁性納米粒子進行分離前； Lane 2:復合磁性納米粒子進行分離后;Lane 3:洗脫液;Lane4，5，6，7:重復使用4次的洗脫 液。
【具體實施方式】
[0035]以下通過實施例形式對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理 解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均 屬于本發明的范圍。
[0036] 本發明下述實施例1 -5中的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+，是由磁性 Fe3〇4納米粒子為核，通過MPS在其表面引入雙鍵，加入丙烯酸單體在Fe3〇4/MPS納米粒子表 面聚合形成聚丙烯酸殼，然后與NTA-Ni2+偶聯得到，所述復合磁性納米粒子Fe3〇 4/MPS/PAA/ NTA-Ni2+的分子結構式如下式所示：
[0037]
[0038]其中：所述的MPS為(3_(異丁烯酰氧基)_丙基三甲氧基硅烷），所述的PAA為聚丙烯 酸，所述的NTA為次氮基三乙酸。
[0039] 實施例1
[0040] 本實施例的一種復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的平均水合粒徑為 247.9nm〇
[0041 ] 上述所述的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+采用如下方法制備而成， 包括如下步驟：
[0042] 步驟一：溶劑熱法制備磁性Fe3〇4納米粒子，具體步驟如下：稱取0.2889g六水合氯 化鐵(FeCl3 · 6H20)、0.8248g醋酸銨(NH4AC)和0.0856g檸檬酸鈉于圓底燒瓶中，加入15ml乙 二醇，溶解，在170°C下劇烈攪拌lh，冷卻后轉移至聚四氟乙烯反應釜中，從室溫加熱至200 °C，反應8h，然后冷卻至室溫，離心分離，制得0.2g磁性核Fe3〇4納米粒子，將制得的產物用無 水乙醇洗滌3~4次，最后分散在無水乙醇中；
[0043] 上述制得的磁性核Fe3〇4納米粒子平均水合粒徑為147.6nm，分布系數（PDI)為 0· 126，Zeta 電位為 _24.5mv;
[0044] 步驟二:采用MPS對磁性Fe304納米粒子進行表面改性(修飾），具體步驟如下：取含 30mg上述步驟一制得的Fe3〇4納米粒子的乙醇分散液，進行磁分離后，加入40mL無水乙醇， 10mL去離子水，混合攪拌，加入lmL密度為0.898g/mL的濃氨水和60yL密度為0.93g/mL的正 硅酸四乙酯（TE0S)，室溫下攪拌4h;再加入90yL純度為97 %、密度為1.045g/mL的MPS，在70 °C下反應5h，將所得產物進行磁分離后得到Fe3〇4/MPS，用無水乙醇洗滌3次后分散在乙腈 中，得到濃度為5mg/mL的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液；
[0045] 步驟三:制備核殼Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子，具體步驟如下:將6mL上述步 驟二制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液轉移至三口燒瓶中，超聲分散，依次加入90yL純度2 98%、密度為1.05g/mL的丙烯酸(AA)，0.01g N，N-亞甲基丙烯酰胺(bis-AM)、0.002g偶氮二 異丁腈(AIBN)，通犯混合攪拌15min，然后加熱至50°C并在此溫度下保持4h，將所得產物進 行磁分離，得到(Fe3〇4/MPS/PAA)，再用無水乙醇洗滌3~4次，最后分散在超純水中；
[0046] 上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒徑為207.3腦，^)1為0.196,26丨&電位為- 21.6mv；
[0047] 步驟四：Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子與NTA-Ni2+偶聯，具體步驟如下：取步驟 三所述制得的含l〇mg Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圓底燒瓶中，加入25mg 1-(3-甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)攪拌0.5h，然后加入25mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，攪拌 1.5h，室溫攪拌，再加入4mg NTA，室溫攪拌24h，將所得產物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)進行磁分 離，用去離子水洗滌3次，分散在超純水中，最后加入0.1M六水合氯化鎳20mL，室溫攪拌2h， 磁分離，用去離子水洗滌3次，最后分散在結合緩沖液(20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，5mM 咪唑）中，于4°C下保存，即制得所述的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+;
[0048] 上述制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2 +的平均水合粒徑為 247 · 9nm，PDI 為0 · 265，Zeta 電位為-12 · 7mv〇
[0049] 實施例2
[0050] 本實施例的一種復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni 2+的平均水合粒徑為 338nm〇
[0051 ] 上述所述的復合磁性納米粒子Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni 2+采用如下方法制備而成， 包括如下步驟：
[0052] 步驟一：溶劑熱法制備磁性Fe3〇4納米粒子，具體步驟如下：稱取0.2889g六水合氯 化鐵(FeCl3 · 6H20)、0.8248g醋酸銨(NH4AC)和0.0856g檸檬酸鈉于圓底燒瓶中，加入15ml乙 二醇，溶解，在170°C下劇烈攪拌lh，冷卻后轉移至聚四氟乙烯反應釜中，從室溫加熱至200 °C，反應10h，然后冷卻至室溫，離心分離，制得0.2g磁性核Fe3〇4納米粒子，將制得的產物用 無水乙醇洗滌3~4次，最后分散在無水乙醇中；
[0053] 上述制得的磁性Fe3〇4核平均水合粒徑為175.2nm，PDI為0.065,26丨 &電位為_ 27.7mv〇
[0054] 步驟二:采用MPS對磁性Fe304納米粒子進行表面改性(修飾），具體步驟如下：取含 30mg上述步驟一制得的Fe3〇4的乙醇分散液，進行磁分離后，加入40mL無水乙醇，10mL去離子 水，混合攪拌，加入lmL密度為0.898g/mL的濃氨水和60yL密度為0.93g/mL的正硅酸四乙酯 (TE0S)，室溫下攪拌4h;再加入90yL純度為97 %、密度為1.045g/mL的MPS，在70 °C下反應5h， 將所得產物進行磁分離，得到Fe3〇4/MPS，再用無水乙醇洗滌3次后分散在乙腈中，得到濃度 為4.5mg/mL的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液；
[0055] 步驟三：制備核殼Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子，具體步驟如下：將7mL上述步 驟二制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液轉移至三口燒瓶中，超聲分散，依次加入150yL純度2 98%、密度為1.058/!1^的丙烯酸(44)、0.018叱1亞甲基丙烯酰胺(1^8-41〇、0.0028偶氮二 異丁腈(AIBN)，通犯混合攪拌15min，然后加熱至55°C并在此溫度下保持4h，將所得產物進 行磁分離，得到(Fe3〇4/MPS/PAA)，再用無水乙醇洗滌3~4次，最后分散在超純水中；
[0056] 上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒徑為328.5腦，^)1為0.169,26丨&電位為- 30.4mv；
[0057] 步驟四：Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子與NTA-Ni2+偶聯，具體步驟如下：取步驟 三所述制得的含l〇mg Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圓底燒瓶中，加入30mg 1-(3-甲氨基丙 基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)攪拌0.5h，然后加入30mg N-羥基丁二酰亞胺(NHS)，攪拌 1.5h，室溫攪拌，再加入5mg NTA，室溫攪拌24h，將所得產物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)進行磁分 離，用去離子水洗滌3次，分散在超純水中，最后加入0.1M六水合氯化鎳20mL，室溫攪拌 0.5h，磁分離，用去離子水洗滌3次，最后分散在結合緩沖液（20mM PBS，pH = 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，于4°C下保存，即制得所述的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2 + ，
[0058] 上述制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的平均水合粒徑為338nm， 分布系數(PDI)為0.145,26七3電位為-11.811^。
[0059] 實施例3
[0060] 本實施例的一種復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+的平均水合粒徑為 328.5nm〇
[0061 ] 上述所述的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+采用如下方法制備而成， 包括如下步驟：
[0062] 步驟一：溶劑熱法制備磁性Fe3〇4納米粒子，具體步驟如下：稱取0.2889g六水合氯 化鐵(FeCl3 · 6H20)、0.8248g醋酸銨(NH4AC)和0.0856g檸檬酸鈉于圓底燒瓶中，加入15ml乙 二醇，溶解，在170°C下劇烈攪拌lh，冷卻后轉移至聚四氟乙烯反應釜中，從室溫加熱至200 °C，反應12h，然后冷卻至室溫，離心分離，制得0.2g磁性核Fe3〇4納米粒子，將制得的產物用 無水乙醇洗滌3~4次，最后分散在無水乙醇中；
[0063] 上述制得的磁性Fe3〇4核平均水合粒徑為215.8隨1，？01為0.022,26七3電位為- 9.79mv；
[0064]步驟二:采用MPS對磁性Fe304納米粒子進行表面改性(修飾），具體步驟如下：取含 30mg上述步驟一制得的Fe3〇4的乙醇分散液，進行磁分離后，加入40mL無水乙醇，10mL去離子 水，混合攪拌，加入0.5mL密度為0.898g/mL的濃氨水和30yL密度為0.93g/mL的正硅酸四乙 酯(TE0S)，室溫下攪拌4h;再加入120yL純度為97 %、密度為1.045g/mL的MPS，在70 °C下反應 7h，將所得產物進行磁分離，得到Fe3〇4/MPS，再用無水乙醇洗滌3次后分散在乙腈中，得到濃 度為4.2mg/mL的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液；
[0065] 步驟三:制備核殼Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子，具體步驟如下:將7mL上述步 驟二制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液轉移至三口燒瓶中，超聲分散，依次加入150yL純度2 98%、密度為1.058/!1^的丙烯酸(44)、0.018叱1亞甲基丙烯酰胺(1^8-41〇、0.0028偶氮二 異丁腈(AIBN)，通犯混合攪拌15min，然后加熱至50°C并在此溫度下保持4h，將所得產物進 行磁分離，得到(Fe3〇4/MPS/PAA)，再用無水乙醇洗滌3~4次，最后分散在超純水中；
[0066] 上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒徑為321.7腦，^)1為0.169,26丨&電位為- 21.2mv；
[0067] 步驟四：Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子與NTA-Ni2+偶聯，具體步驟如下：取步驟 三所述制得的含l〇mg Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圓底燒瓶中，加入30mg(3-甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)攪拌0.5h，然后加入30mg N-羥基丁二酰亞胺（NHS)，攪拌 1.5h，室溫攪拌，再加入5mg NTA，室溫攪拌24h，將所得產物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)進行磁分 離，用去離子水洗滌3次，分散在超純水中，最后加入0.1M六水合氯化鎳10mL，室溫攪拌 0.5h，磁分離，用去離子水洗滌3次，最后分散在結合緩沖液（20mM PBS，pH = 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，于4°C下保存，即制得所述的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2 + ，
[0068] 上述制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2 +的平均水合粒徑為 328.5歷，分布系數(？01)為0.231，26七3電位為-6.311^。
[0069] 實施例4
[0070] 本實施例的一種復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+的平均水合粒徑為 433.9nm〇
[0071 ] 上述所述的復合磁性納米粒子Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni 2+采用如下方法制備而成， 包括如下步驟：
[0072] 步驟一：溶劑熱法制備磁性Fe3〇4納米粒子，具體步驟如下：稱取0.2889g六水合氯 化鐵(FeCl3 · 6H20)、0.8248g醋酸銨(NH4AC)和0.0856g檸檬酸鈉于圓底燒瓶中，加入15ml乙 二醇，溶解，在170°C下劇烈攪拌lh，冷卻后轉移至聚四氟乙烯反應釜中，從室溫加熱至200 °C，反應16h，然后冷卻至室溫，離心分離，制得0.2g磁性核Fe3〇4納米粒子，將制得的產物用 無水乙醇洗滌3~4次，最后分散在無水乙醇中；
[0073] 上述制得的磁性Fe3〇4核平均水合粒徑為322.3nm，PDI為0.137，Zeta電位為- 13.39mv；
[0074]步驟二:采用MPS對磁性Fe304納米粒子進行表面改性(修飾），具體步驟如下：取含 30mg上述步驟一制得的Fe3〇4的乙醇分散液，進行磁分離后，加入40mL無水乙醇，10mL去離子 水，加入1.5mL密度為0.898g/mL的濃氨水)和50yL密度為0.93g/mL的正硅酸四乙酯(TE0S)， 室溫下攪拌4h;再加入150yL純度為97 %、密度為1.045g/mL的MPS，在70 °C下反應4h，將所得 產物進行磁分離，得到Fe3〇4/MPS，再用無水乙醇洗滌3次后分散在乙腈中，得到濃度為 4.5mg/mL的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液；
[0075] 步驟三:制備核殼Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子，具體步驟如下:將7mL上述步 驟二制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液轉移至三口燒瓶中，超聲分散，依次加入180yL純度2 98%、密度為1.058/!1^的丙烯酸(44)、0.018叱1亞甲基丙烯酰胺(1^8-41〇、0.0028偶氮二 異丁腈(AIBN)，通犯混合攪拌15min，然后加熱至50°C并在此溫度下保持6h，將所得產物進 行磁分離，得到(Fe3〇4/MPS/PAA)，再用無水乙醇洗滌3~4次，最后分散在超純水中；
[0076] 上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒徑為426.4nm，roi為0.212，Zeta電位為- 20mv;
[0077] 步驟四：Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子與NTA-Ni2+偶聯，具體步驟如下：取步驟 三所述制得的含l〇mg Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圓底燒瓶中，加入40mg(3-甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)攪拌0.5h，然后加入40mg N-羥基丁二酰亞胺（NHS)，攪拌 1.5h，室溫攪拌，再加入7mg NTA，室溫攪拌28h，將所得產物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)進行磁分 離，用去離子水洗滌3次，分散在超純水中，最后加入0.1M六水合氯化鎳15mL，室溫攪拌lh， 磁分離，用去離子水洗滌3次，最后分散在結合緩沖液(20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，5mM 咪唑）中，于4°C下保存，即制得所述的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+;
[0078] 上述制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni2 +的平均水合粒徑為 433 · 9nm，PDI 為0 · 287，Zeta 電位為-4.3mv〇
[0079] 實施例5
[0080] 本實施例的一種復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni2+的平均水合粒徑為 561nm〇
[0081 ] 上述所述的復合磁性納米粒子Fe304/MPS/PAA/NTA-Ni2+采用如下方法制備而成， 包括如下步驟：
[0082] 步驟一：溶劑熱法制備磁性Fe3〇4納米粒子，具體步驟如下：稱取0.2889g六水合氯 化鐵(FeCl3 · 6H20)、0.8248g醋酸銨(NH4AC)和0.0856g檸檬酸鈉于圓底燒瓶中，加入15ml乙 二醇，溶解，在170°C下劇烈攪拌lh，冷卻后轉移至聚四氟乙烯反應釜中，從室溫加熱至200 °C，反應16h，然后冷卻至室溫，離心分離，制得0.2g磁性核Fe3〇4納米粒子，將制得的產物用 無水乙醇洗滌3~4次，最后分散在無水乙醇中；
[0083] 上述制得的磁性Fe3〇4核平均水合粒徑為285.6nm，PDI為0.176,26七&電位為_ 15.4mv；
[0084] 步驟二:采用MPS對磁性Fe304納米粒子進行表面改性(修飾），具體步驟如下：取含 30mg上述步驟一制得的Fe3〇4的乙醇分散液，進行磁分離后，加入40mL無水乙醇，10mL去離子 水，加入lmL密度為0 · 898g/mL的濃氨水)和60yL密度為0 · 93g/mL的正硅酸四乙酯(TE0S)，室 溫下攪拌4h;再加入150yL純度為97 %、密度為1.045g/mL的MPS，在70 °C下反應6h，將所得產 物進行磁分離，得到Fe3〇4/MPS，再用無水乙醇洗滌3次后分散在乙腈中，得到濃度為4.3mg/ mL的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液；
[0085] 步驟三:制備核殼Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子，具體步驟如下:將7mL上述步 驟二制得的Fe3〇4/MPS的乙腈分散液轉移至三口燒瓶中，超聲分散，依次加入200yL純度2 98%、密度為1.058/!1^的丙烯酸(44)、0.028叱1亞甲基丙烯酰胺(1^8-41〇、0.0028偶氮二 異丁腈(AIBN)，通犯混合攪拌15min，然后加熱至60°C并在此溫度下保持4h，將所得產物進 行磁分離，得到(Fe3〇4/MPS/PAA)，再用無水乙醇洗滌3~4次，最后分散在超純水中；
[0086] 上述制得的聚丙烯酸包覆后平均水合粒徑為517.1nm，roi為0.227,2〇丨&電位為_ 24.5mv；
[0087] 步驟四：Fe3〇4/MPS/PAA復合磁性納米粒子與NTA_Ni2+偶聯，具體步驟如下：取步驟 三所述制得的含l〇mg Fe3〇4/MPS/PAA的水分散液于圓底燒瓶中，加入50mg(3-甲氨基丙基)- 3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC)攪拌0.5h，然后加入50mg N-羥基丁二酰亞胺（NHS)，攪拌 1.5h，室溫攪拌，再加入10mg NTA，室溫攪拌24h，將所得產物(Fe3〇4/MPS/PAA/NTA)進行磁分 離，用去離子水洗滌3次，分散在超純水中，最后加入0.1M六水合氯化鎳20mL，室溫攪拌2h， 磁分離，用去離子水洗滌3次，最后分散在結合緩沖液(20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，5mM 咪唑）中，于4°C下保存，即制得所述的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+;
[0088] 上述制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的平均水合粒徑為561nm， PDI 為0 · 265，Zeta 電位為_3 · 39mv。
[0089] 應用試驗例1
[0090] 將上述實施例1制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA_Ni 2+應用于分離純 化組氨酸標簽蛋白質，具體應用方法如下:取lmg組氨酸標簽蛋白質，溶解于lmL結合緩沖液 中（20mM PBS，pH= 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，制得濃度為lmg/mL的組氨酸標簽蛋白質 溶液;取50yL所述組氨酸標簽蛋白質溶液于EP管中，加入上述實施例1制得的含lmg復合磁 性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的懸浮液，室溫孵育2h，磁分離，用洗脫緩沖液（20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，250mM咪唑)洗脫2~3次，收集上清液包括原液和分離液，分別用 SDS-PAGE電泳和紫外分光光度計(NANODROP 2000c，Thermo，U. S.A)檢測蛋白質濃度。
[0091]經紫外分光光度計檢測蛋白質的濃度，得到分離純化效率為40yg/mg磁性納米粒 子。
[0092] 應用試驗例2
[0093] 將上述實施例2制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+應用于分離純 化組氨酸標簽蛋白質，具體應用方法如下:取lmg組氨酸標簽的蛋白質，溶解于lmL結合緩沖 液中（20mM PBS，pH=7 · 4，500mM NaCl，5mM咪唑）中制得濃度為lmg/mL的組氨酸標簽蛋白質 溶液;取50yL所述組氨酸標簽蛋白質溶液于EP管中，加入含lmg上述實施例2制得的復合磁 性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的懸浮液，室溫孵育3h，磁分離，用洗脫緩沖液（20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，250mM咪唑)洗脫2~3次，收集上清液包括原液和分離液，分別用 SDS-PAGE電泳和紫外分光光度計(NANODROP 2000c，Thermo，U. S.A)檢測蛋白質濃度。
[0094]經紫外分光光度計檢測蛋白質的濃度，得到分離純化效率為47yg/mg磁性納米粒 子。
[0095] 應用試驗例3
[0096] 將上述實施例3制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni 2+應用于分離純 化組氨酸標簽蛋白質，具體應用方法如下：
[0097] 取lmg組氨酸標簽的蛋白質，溶解于lmL結合緩沖液中（20mM roS，pH = 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，制得濃度為lmg/mL的組氨酸標簽蛋白質溶液;取50yL所述組氨酸標簽蛋 白質溶液于EP管中，加入含lmg上述實施例3制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA- Ni2+的懸浮液，室溫孵育4h，磁分離，用洗脫緩沖液（20mM PBS，pH = 7.4，500mM NaCl，250mM 咪唑)洗脫2~3次，收集上清液包括原液和分離液，分別用SDS-PAGE電泳和紫外分光光度計 (NANODROP 2000c，Thermo，U· S·A)檢測蛋白質濃度。
[0098]經紫外分光光度計檢測蛋白質的濃度，得到分離純化效率為53yg/mg磁性納米粒 子。
[0099] 應用試驗例4
[0100] 將上述實施例4制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+應用于分離純 化組氨酸標簽蛋白質，具體應用方法如下:取lmg組氨酸標簽的蛋白質，溶解于lmL結合緩沖 液中（20mM roS，pH = 7 · 4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，制得濃度為lmg/mL的組氨酸標簽蛋白 質溶液;取50yL所述組氨酸標簽蛋白質溶液于EP管中，加入含lmg上述實施例4制得的復合 磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的懸浮液，室溫孵育2h，磁分離，用洗脫緩沖液(20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，250mM咪唑)洗脫2~3次，收集上清液包括原液和分離液，分別用 SDS-PAGE電泳和紫外分光光度計(NANODROP 2000c，Thermo，U. S.A)檢測蛋白質濃度。
[0101]經紫外分光光度計檢測蛋白質的濃度，得到分離純化效率為60yg/mg磁性納米粒 子。
[0102] 應用試驗例5
[0103] 將上述實施例5制得的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+應用于分離純 化組氨酸標簽蛋白質，具體應用方法如下:取lmg組氨酸標簽蛋白質，溶解于lmL結合緩沖液 中（20mM PBS，pH= 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑）中，制得濃度為lmg/mL的組氨酸標簽蛋白質 溶液;取50yL所述組氨酸標簽蛋白質溶液于EP管中，加入含lmg上述實施例5制得的復合磁 性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的懸浮液，室溫孵育4h，磁分離，用洗脫緩沖液（20mM PBS，pH=7.4，500mM NaCl，250mM咪唑)洗脫2~3次，收集上清液包括原液和分離液，分別用 SDS-PAGE電泳和紫外分光光度計(NANODROP 2000c，Thermo，U. S.A)檢測蛋白質濃度。
[0104]經紫外分光光度計檢測蛋白質的濃度，得到分離純化效率為65yg/mg磁性納米粒 子。
[0105] 另外，本發明還采用動態光散射(Malvern Zetasizer Nano ZS90)對實施例1制備 的磁性納米粒子的平均粒徑、分布系數和Zeta電位進行測定，結果見表1。表1結果表明，隨 著磁性核Fe3〇4表面被包覆，其平均粒徑逐漸增大，且PDI均小于0.3，這說明該納米粒子尺寸 分布窄，具有單分散性;另外，Zeta電位都為負值，由于靜電相斥作用，該磁性納米粒子不易 聚集，因此具有較好的穩定性。由此可見，本專利所得復合磁性納米粒子具有較好的納米特 性，滿足生物醫學應用的要求。
[0106] 表1實施例1制得的磁性納米粒子的平均粒徑、分布系數(PDI)和Zeta電位
[0107]
【主權項】
1. 一種復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2%其特征在于:所述復合磁性納米粒 子是由磁性Fe3〇4納米粒子為核，通過MPS在其表面引入雙鍵，再加入丙締酸單體在Fe3〇4/ MPS表面聚合形成聚丙締酸殼，最后與NTA-Ni2+偶聯得到，所述復合磁性納米粒子Fe3〇4/ MPS/PAA/NTA-Ni2+的分子結構式如下式一所示：其中：所述的MPS為(3-(異下締酷氧基)-丙基Ξ甲氧基硅烷），所述的PAA為聚丙締酸， 所述的NTA為次氮基Ξ乙酸。2. 根據權利要求1所述的復合磁性納米粒子化3化/MPS/PAA/NTA-Ni2%其特征在于:所述 的復合磁性納米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的平均水合粒徑為100皿~600皿。3. -種根據權利要求1或2所述的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的制備方 法，其特征在于:所述方法包括如下步驟： 步驟一:溶劑熱法制備磁性Fe3〇4納米粒子，具體步驟如下：將六水合氯化鐵、醋酸錠和 巧樣酸鋼溶解于乙二醇中，在170°C下劇烈攬拌化，冷卻后轉移至聚四氣乙締反應蓋中，于 200°C反應8~16h，冷卻至室溫，磁分離或離屯、分離，將制得的磁性化3〇4納米粒子用無水乙 醇洗涂3~4次后分散在無水乙醇中； 步驟二:采用MPS對磁性Fe3〇4納米粒子進行表面改性，具體步驟如下:將步驟一制得的 Fe3化納米粒子進行磁分離后分散在無水乙醇和超純水中，混合攬拌，加入濃氨水和正娃酸 四乙醋，室溫下攬拌2~化;再加入MPS于70°C下反應3~lOh，將所得產物進行磁分離，得到 化304/MPS，用無水乙醇洗涂3次后分散在乙臘中，制得化304/MPS的乙臘分散液； 所述的化3〇4、了605、]\0^、濃氨水質量之比為1:0.2~2:2~10:10~60。 步驟Ξ:制備核殼化地4/MPS/PAA復合磁性納米粒子，具體步驟如下：取上述步驟二制得 的化304/MPS的乙臘分散液轉移至Ξ口燒瓶中，超聲分散，依次加入丙締酸、N，N-亞甲基丙締 酷胺、偶氮二異下臘，通化混合攬拌10~20min，然后加熱至40~60°C并在此溫度下保持3~ 6h，將所得產物進行磁分離，得到Fe3〇4/MPS/PAA，再用無水乙醇洗涂3~4次，最后分散在超 純水中； 所述的化3化/MPS、丙締酸、N，N-亞甲基丙締酷胺、偶氮二異下臘的質量之比為1:2~10: 0.1 ~1:0.01 ~0.1。 步驟四：Fe3化/MPS/PAA復合磁性納米粒子與NTA-Ni2+偶聯，具體步驟如下：取步驟Ξ所 述制得的化304/MPS/PAA的水分散液于圓底燒瓶中，分別加入1-(3-甲氨基丙基)-3-乙基碳 二亞胺鹽酸鹽和N-徑基下二酷亞胺，室溫攬拌，再加入次氮基Ξ乙酸，室溫攬拌20~2她，然 后進行磁分離，將所得產物化3〇4/mps/paa/nta用去離子水洗涂3次，最后分散在超純水中， 最后加入六水合氯化儀，室溫攬拌0.5~4h，磁分離，用去離子水洗涂3次后分散在結合緩沖 液中，于4°C下保存，即制得所述的復合磁性納米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+; 所述的Fe3〇4/MPS/PAA、l-(3-甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-徑基下二酷亞 胺、次氮基Ξ乙酸的質量比分別為1:2~5:2~5:0.2~1。4. 根據權利要求3所述的復合磁性納米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的制備方法，其特 征在于:步驟一所述制得的磁性化3〇4納米粒子的平均水合粒徑為100~400nm，分布系數PDI 為 0.01 ~0.2，Ze1:a 電位為 0 ~-30mv。5. 根據權利要求3所述的復合磁性納米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的制備方法，其特 征在于:步驟Ξ所述制得的化304/MPS/PAA磁性納米粒子的平均水合粒徑為100~600nm，分 布系數PDI為0.1~0.3，Ze化電位為0~-35mv。6. 根據權利要求3所述的復合磁性納米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的制備方法，其特 征在于:步驟四所述制得的Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+復合磁性納米粒子的平均水合粒徑為 100~600nm，分布系數PDI為0.1~0.3，Ze化電位為0~-15mv。7. 根據權利要求3所述的復合磁性納米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+的制備方法，其特 征在于:步驟四所述的六水合氯化儀的加入量為化304/MPS/PAA/NTA質量的5~50倍。8. -種根據權利要求1所述的復合磁性納米粒子Fe3化/MPS/PAA/NTA-Ni2+在分離純化組 氨酸標簽蛋白質中的應用，其特征在于:首先采用結合緩沖液配制Img/mL的組氨酸標簽蛋 白質溶液，取配制好的蛋白質溶液于EP管中，加入所述化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+復合磁性納 米粒子，室溫解育0.5~地，磁分離，采用洗脫緩沖液洗脫2~3次后，收集上清液，包括原液 和洗脫液，分別用SDS-PAGE電泳和紫外分光光度計檢測蛋白質濃度，得到分離純化效率。9. 根據權利要求8所述的復合磁性納米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+在分離純化組氨酸 標簽蛋白質中的應用，其特征在于：所述的洗脫緩沖液為含有500mM化C1和250mM咪挫的 20mM PBS緩沖液，pH值為7.4。10. 根據權利要求8所述的復合磁性納米粒子Fe3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+在分離純化組氨 酸標簽蛋白質中的應用，其特征在于:所述的復合磁性納米粒子化3〇4/MPS/PAA/NTA-Ni2+與 蛋白質的質量比為1:0.03~0.1。
【文檔編號】C08F222/38GK105837766SQ201610163717
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月22日
【發明人】郭惠玲
【申請人】湖北工業大學