一組陽離子抗菌肽及其制備方法

一組陽離子抗菌肽及其制備方法
【專利摘要】本發明屬于醫藥領域，具體涉及一組陽離子抗菌肽及其制備方法。本發明在pep-05的基礎上改進得到了一系列HRP5類似物，所涉及的陽離子抗菌肽的通式為Xaa1- Xaa2- Xaa3- Xaa4- Xaa5- Xaa6- Xaa7- Xaa8- Xaa9- Xaa10-Leu- Xaa12- Xaa13- Xaa14。本發明采用固相化學合成技術制備上述線性多肽。本發明制備的陽離子抗菌肽可應用于制備抗大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌、耐藥鮑曼不動桿菌和耐藥銅綠假單胞菌的藥物。
【專利說明】
一組陽離子抗菌肽及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于醫藥領域，具體而言涉及具有較高抗菌活性的陽離子抗菌肽的制備方 法和應用。
【背景技術】
[0002] 抗菌肽（antimicrobial peptide, AMP)是一種廣泛存在于昆蟲、微生物、植物、動 物以及人類的一種多肽，是機體內在防御機制的一部分，具有廣譜抗菌活性，能夠抗革蘭氏 陽性菌和陰性菌，同時具有抗真菌、寄生蟲、病毒和癌癥的能力。大多數AMP以細胞膜為靶 點，少數作用于細胞內分子，AMP通常帶有正電荷，通過靜電相互作用與細胞膜上的陰離子 成分（如脂多糖和磷壁酸）結合，之后折疊成兩親性構象，其疏水面與磷脂頭部相互作用而 造成膜結構的紊亂或破壞，進而造成細胞內容物的流出和細菌死亡。
[0003] 富組蛋白（histidine rich protein，HRPs 或 histatins)是一類存在于靈 長類動物腮腺和頜下腺分泌物中富含組氨酸的陽離子多肽。現已分離出至少12種人 卩8〇11^1-12)，其中!11^1、!11^3及!11^5是主要富組蛋白，占總!11?^的85%-90%。其中 HRP5含有24個氨基酸殘基，分子量為3037D，其氨基酸序列為：
[0004] Asp-Ser-His-Ala-Lys-Arg-His-His-Gly-Tyr-Lys-Arg-Lys-Phe-His-Glu-Lys-H i s_Hi s-Ser-Hi s-Arg-Gly-Tyr 〇
[0005] 路建光等（中國醫藥工業雜志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2013, 44(12))合成了一組HRP5類似物，其中pep-05的氨基酸序列如下所示：Lys-Arg-Leu -Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(SEQ ID NO :1)〇
[0006] 本發明在此基礎之上，經過進一步的改進得到了一系列HRP5類似物。

【發明內容】

[0007] 本發明提供了一種多肽或其藥學上可接受的鹽，所述多肽具有如下氨基酸序列：
[0008] Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal〇-Leu-Xaal2-Xaal3-Xa al4(SEQ ID NO:2)；
[0009] 其中 Xaal 為 Lys、Gly、Dap、Dab 或缺失；
[0010] Xaa2 為 Arg、hArg、Phe 或缺失；
[0011] Xaa3 為 Leu、Phe、Arg 或缺失；
[0012] Xaa4 為 Phe、Thi、Cpa 或 Phe(4-F);
[0013] Xaa5 為 Lys、Dap、Dab 或 Dap (Cap);
[0014] Xaa6 為 Lys、Dap、Dab、Asp、Ser 或 Thr ;
[0015] Xaa7 為 Leu 或 Trp ;
[0016] Xaa8 為 Leu 或 Arg ;
[0017] Xaa9 為 Lys、Dab 或 Dap (Cap);
[0018] XaalO 為 Tyr、Leu、Trp、Lys 或 Arg ;
[0019] Xaal2 為 Arg 或 hArg ;
[0020] Xaal3 為 Lys、Dab 或 Dap (Cap);
[0021] Xaal4 為 Phe、Thi 或 Phe(4_F)。
[0022] 上述多肽或其藥學上可接受的鹽中，其中Xaal優選Dab或缺失；Xaa6優選Lys、 Dab 或 Ser ;Xaa7 優選 Leu ;XaalO 優選 Tyr、Lys 或 Arg ;Xaal4 優選 Phe 或 Phe (4-F)。
[0023] 在某些特定的實施方式中，上述多肽或其藥學上可接受的鹽中，其中Xaa8為Leu ; XaalO 為 Tyr〇
[0024] 更進一步，在某些典型的實施方式中，其中Xaa8為Leu ;XaalO為Tyr ;Xaal為Dab 或缺失；Xaa6 為 Lys、Dab 或 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F) 〇
[0025] 在某些特定的實施方式中，上述多肽或其藥學上可接受的鹽中，其中Xaa3為Leu ; Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;XaalO 為 Tyr〇
[0026] 更進一步，在某些典型的實施方式中，其中Xaa3為Leu ;Xaa7為Leu ;Xaa8為Leu ; XaalO 為 Tyr ;Xaal 為 Dab 或缺失；Xaa6 為 Lys、Dab 或 Ser ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F) 〇
[0027] 在某些特定的實施方式中，上述多肽或其藥學上可接受的鹽中，其中Xaal、Xaa2 和 Xaa3 缺失；Xaa4 為 Phe ;Xaa6 為 Lys ;Xaa7 為 Leu ;Xaal2 為 Arg ;Xaal4 為 Phe。
[0028] 更進一步，在某些典型的實施方式中，其中Xaal、Xaa2和Xaa3缺失；Xaa4為Phe ; Xaa6 為 Lys ;Xaa7 為 Leu ;Xaal2 為 Arg ;Xaal4 為 Phe ;XaalO 為 Tyr、Lys 或 Arg〇
[0029] 在某些特定的實施方式中，上述多肽或其藥學上可接受的鹽中，其中Xaal、Xaa2 和 Xaa3 缺失；Xaa5 為 Lys ;Xaa6 為 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;Xaa9 為 Lys ;Xaal2 為 Arg ;Xaal3 為 Lys〇
[0030] 更進一步，在某些典型的實施方式中，其中Xaal、Xaa2和Xaa3缺失；Xaa5為Lys ; Xaa6 為 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;Xaa9 為 Lys ;Xaal2 為 Arg ;Xaal3 為 Lys ;Xaal0 為 Tyr、Lys 或 Arg ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F)。
[0031] 本發明所涉及的氨基酸殘基包括天然氨基酸，也包括非天然氨基酸。本發明所涉 及的天然氨基酸所對應的三字母代碼表如表1所示，本發明所涉及的非天然氨基酸所對應 的代碼表及結構如表2所示。
[0032] 本發明所涉及的所有氨基酸均為L型氨基酸。
[0033] 本發明所涉及的多肽為線性肽時，其C末端既可以是羧酸的形式，也可以是酰胺 的形式，優選以酰胺形式存在。
[0034] 表1 :天然氨基酸三字母代碼表 [0035]
[0036] 表2 :非天然氨基酸和脂肪酸的代碼表及結構
[0037]
[0038]
[0039] 本發明優選的一個實施方式中公開了 一種線性多肽（CAMP-1)，其氨基酸序列為 Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:3)
[0040] 本發明的又一個優選實施方式公開了一種帶脂肪鏈的多肽（CAMP-28)，其氨基酸 序列為：Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID N0:4)
[0041] 本發明另一個優選的實施方式中公開了一組線性多肽（CAMP-2, CAMP-3, CAMP-4， CAMP-5, CAMP-6, CAMP-7, CAMP-8, CAMP-9, CAMP-10, CAMP-11，CAMP-12, CAMP-13, CAMP-14， CAMP-15, CAMP-16, CAMP-17, CAMP-18, CAMP-19, CAMP-20, CAMP-21， CAMP-22, CAMP-23， CAMP-24, CAMP-25, CAMP-26, CAMP-27, CAMP-29, CAMP-30, CAMP-31，CAMP-32, CAMP-33)其氨 基酸序列分別為：
[0042] Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-Arg-Dab-Phe-NH2 (SEQ ID NO :5)
[0043] Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2 (SEQ ID NO :6)
[0044] Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2 (SEQ ID NO :7)
[0045] Dab-Arg-Leu-Thi-Dap-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2 (SEQ ID NO :8)
[0046] Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:9)
[0047] Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQID NO:10)
[0048] Gly-Arg-Leu-Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2 (SEQ ID NO:11)
[0049] Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO:12)
[0050] Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH 2(SEQ ID NO:13)
[0051] Cpa-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH 2(SEQ ID NO:14)
[0052] Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:15)
[0053] Phe(4_F)-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4_F)_NH2 (SEQ ID NO:16)
[0054] Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:17)
[0055] Phe-Phe-Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:18)
[0056] Phe-Dab-Thr-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:19)
[0057] Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:20)
[0058] Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Arg-Lys-Thi-NH 2(SEQ ID NO:21)
[0059] Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Trp-Leu-Arg-Lys-Thi-NH 2(SEQ ID NO:22)
[0060] Thi-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH 2(SEQ ID NO:23)
[0061] Thi-Dab-Ser-Trp-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH 2(SEQ ID NO:24)
[0062] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO :25)
[0063] Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:26)
[0064] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO :27)
[0065] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Arg-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO :28)
[0066] Phe-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO :29)
[0067] Arg-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO:30)
[0068] Phe-Dap (Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO:31)
[0069] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Dap(Cap)-Phe-NH 2 (SEQ ID NO:32)
[0070] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2 (SEQ ID NO:33)
[0071] Phe-Dap(Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe_NH 2 (SEQ ID NO :34)
[0072] Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Dap(Cap)-Phe-NH2 (SEQ ID NO:35)
[0073] 本發明還提供了上述線性多肽或其藥學上可接受的鹽在制備抗大腸桿菌、銅綠假 單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌、耐藥鮑曼不動桿菌和耐藥銅綠假單 胞菌的藥物中的應用。
[0074] 本發明還提供了上述線性多肽的制備方法，可以采用固相化學合成技術制備線性 肽，制備步驟如下：
[0075] (1)在樹脂上固相合成多肽；
[0076] (2)將步驟（1)的產物在三氟乙酸或氫氟酸中進行裂解，優選三氟乙酸；并加入側 鏈保護基清除劑，然后用5-20倍體積的冰乙醚沉淀多肽，離心，棄上清，再用冰乙醚反復洗 滌沉淀4-5次，真空干燥，得到粗肽。
[0077] 本發明所涉及的多肽C末端若為羧酸形式，則步驟（1)采用Wang樹脂進行合成； 本發明所涉及的多肽c末端若為酰胺形式，則步驟（1)采用Rink Amide MBHA樹脂進行合 成。
[0078] 步驟（1)是在液相環境中進行，具體包括：浸泡樹脂一脫除氨基保護基一洗滌一 監測一偶聯氨基酸一監測一洗滌一脫除氨基保護基（順序偶聯剩余氨基酸）一干燥樹脂。
[0079] 其中氨基保護基是指為保護參與縮合反應的氨基而引入的化學基團。所述的氨基 保護基包括但不限于叔丁氧羰基（Boc)、芐氧羰基（Z)或9-芴基-甲基羰基（Fmoc)，優選 9_荷基-甲基羰基（Fmoc)。
[0080] 固相多肽合成中，對部分氨基酸的側鏈可以引入化學基團進行保護，例如Arg或 hArg可以采用五甲基苯并呋喃-5-磺酰基（Pbf)保護；Lys及Trp可以采用叔丁氧羰基 (Boc)保護；Tyr可以采用叔丁基（tBu)保護；Dap可以采用Mtt或B0C保護；Dab可以采用 B0C保護；本發明中，Fmoc-L-Dap(Mtt)-〇H具有如下所示的結構：
[0081]
[0082] 所述的保護基團不限于此，可以根據本領域常規方案進行合理選擇。
[0083] 步驟⑴的液相環境所用溶劑選自：二甲基甲酰胺（DMF)或二氯甲烷（DCM)，優選 DMF。
[0084] 步驟（1)中脫除氨基保護基需要加入氨基保護基的脫除劑，氨基保護基的脫除劑 選用哌啶（PIP)的二甲基甲酰胺溶液，濃度為10-40% (PIP體積/DMF體積），脫除時間為 20-50min ;優選濃度為20-25% (PIP體積/DMF體積），脫除時間25-35min。
[0085] 步驟（1)中氨基酸的偶聯需要加入偶聯試劑，偶聯試劑由：碳二亞胺型試劑或者 苯并三氮唑鐺鹽型試劑和1-羥基苯并三唑（HOBt)組成。
[0086] 碳二亞胺型試劑包括但不限于二環己基碳二亞胺（DCC)、二異丙基碳二亞胺 (DIC)或N-二氨基丙基-N-乙基碳二亞胺（EDC)。
[0087] 苯并三氮唑鐺鹽型試劑包括但不限于2-(1Η-苯并三偶氮L-1-基）_1，1，3, 3-四 甲基脲四氟硼酸酯（TBTU)、0-苯并三唑-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟磷酸鹽（HBTU)、六氟磷 酸苯并三唑-1-氧基三（二甲氨基）磷（Β0Ρ)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷 基磷（PyBOP)。
[0088] 偶聯試劑優選二異丙基碳二亞胺（DIC)和1-羥基苯并三唑（HOBt)，或2- (1H-苯 并三偶氮L-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲四氟硼酸酯（TBTU)和1-羥基苯并三唑（HOBt)，進 一步優選DIC (二異丙基碳二亞胺）和1-羥基苯并三唑（HOBt)。
[0089] 步驟（1)中的"監測"采用茚三酮檢測法監測多肽的縮合反應。
[0090] 步驟（1)中的順序連接氨基酸是指根據多肽氨基酸序列從C端向N端逐個連接氨 基酸。
[0091] 步驟（2)所述的側鏈保護基清除劑包括但不限于茴香硫醚、三異丙基硅烷、苯酚、 水、1，2-乙二硫醇、間甲酚或上述任意兩種或者兩種以上的組合，并與三氟乙酸或氫氟酸按 5-20% (V/V)進行配制得到。優選三氟乙酸（TFA):茴香硫醚：75%苯酚：水=85:5:5:5。 [0092] 本發明的制備方法中，可以進一步包含正辛酸的偶聯。具體而言，若制備的多肽為 帶脂肪鏈的多肽，則當偶聯到帶脂肪鏈氨基酸位置時，先偶聯相應的不帶脂肪鏈的氨基酸， 再加入正辛酸和偶聯劑，監測至反應完成時，再偶聯下一個氨基酸。
[0093] 特別有益的是為滿足醫藥用途的質量要求，本發明所提供的多肽制備方法還可以 進一步包括純化步驟。所采用的純化方法包括但不限于反相色譜法或離子交換色譜法，優 選反相色譜法。
[0094] 本發明所涉及多肽的體外抗菌活性可以通過測定其最低抑菌濃度（MIC)來鑒定。 美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS)推薦采用微量肉湯稀釋法來測定各抗菌肽的最低 抑菌濃度（MIC)，培養基采用Mueller-Hinton(MH)肉湯培養基以及改良型RPMI-1640培養 基。以兩性霉素 B、硫酸多黏菌素 E及鹽酸萬古霉素作為陽性對照。體外活性測定表明，本發 明提供的抗菌肽具有更高的抗菌活性，特別抗陰性菌（如銅綠假單胞菌）或抗耐藥菌（如 耐藥鮑曼不動桿菌、耐藥銅綠假單胞菌）的活性得到顯著改善。
[0095] 以下實施例僅代表本發明闡述的一個方面，不是本發明主題的局限。
【具體實施方式】
[0096] 實施例1 :CAMP_1的制備及純化
[0097] 氨基酸序列：Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi- NH2((SEQ ID NO :3)
[0098] (1)材料及試劑
[0099] Rink Amide MBHA 樹脂，取代值 0· 65mmol/g。
[0100] 氛基酸為：Fmoc-L-3-(2-Thienyl) L-alanine-OH、Fmoc-L-Dab (Boc)-OH、 Fmoc-L_hArg(pbf)-〇H、 Fmoc-L-Leu-OH、 Fmoc-L_Tyr(tBu)-〇H、 Fmoc-L-Phe-OH、 Fmoc-L-Dap(Boc)-OH。
[0101] 試劑：H0Bt、DIC、DMFJ；^^。
[0102] (2)儀器
[0103] PSI300型多肽合成儀、Waters600半制備型高效液相色譜儀、磁力攪拌器。
[0104] (3)操作步驟（以0· 15mmol為例）
[0105] a.固相化學合成多肽
[0106] 稱取Rink Amide MBHA樹脂0. 23g，置于多肽合成儀反應器中，加入lOmLDMF， 浸泡2h，然后加入20 % PIP/DMF溶液10mL，混合30min脫除氨基保護基，DMF洗滌樹脂7 次，然后向反應器中加入177mg Fmoc-L-3- (2-Thienyl) L-alanine-ΟΗ、等摩爾的偶聯試劑 DIC(0. 3mol/L)和H0Bt(0. 3mol/L)進行反應，反應溫度為室溫，以茚三酮反應監測反應進 程，監測無色則為反應完成，用DMF洗滌樹脂5次。當第一個氨基酸偶聯到樹脂上后，即可 按照上述方法繼續進行下一個氨基酸的偶聯反應，如此循環，直至全部氨基酸偶聯完成。
[0107] b.裂解及沉淀
[0108] 肽合成結束后，真空干燥樹脂，稱重。按照lmL裂解試劑/100mg樹脂的比例加入 裂解試劑，試劑配比為TFA:茴香硫醚：75%苯酚：水= 85:5:5:5,室溫攪拌反應3小時，抽 濾。之后向裂解抽濾液中加入10倍體積的冰乙醚沉淀多肽，離心，棄上清，再用冰乙醚反復 洗滌沉淀4~5次，真空干燥，稱重粗肽。
[0109] c.反相色譜純化
[0110] 用制備型HPLC，采用反相色譜法，純化上述粗肽。
[0111] 1 制備
[0112] 色譜柱：YMC-pack ODS-AQ C18 制備柱（lOmmX 250mm, 10 μ m)
[0113] 流速：5mL/min
[0114] 檢測波長：215nm
[0115] 流動相：A :含0· 1 % TFA水溶液
[0116] B :含 0. 1% TFA 的乙腈
[0117] 梯度洗脫程序如表3:
[0118] 表3梯度洗脫表
[0119]
[0120] 2 分析
[0121] 色譜柱：YMC_pack ODS-AQ C18分析柱（4. 6mmX 250mm, 5 μ m)
[0122] 流速：lmL/min
[0123] 檢測波長：215nm
[0124] 流動相：A :含0· 05 % TFA水溶液
[0125] B :含 0. 05% TFA 的乙腈
[0126] 梯度洗脫程序如表4:
[0127] 表4梯度洗脫表
[0128]
[0129] 收集目標肽純度大于95%的部分，然后38°C減壓濃縮至干。經ESI-MS測定，該肽 的分子量為1730,理論值為1732. 6。
[0130] 實施例2 :帶脂肪鏈多肽CAMP-28的制備及純化
[0131] 氨基酸序列：Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap (Cap)-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO :4)
[0132] (1)材料及試劑
[0133] Rink Amide MBHA 樹脂，取代值 0· 65mmol/g。
[0134] 氨基酸為：Fmoc-L-Dap (Mtt)-OH、Fmoc-L-Arg (Pbf)-OH、Fmoc-L-Leu-OH、 Fmoc-L-Tyr(tBu) -〇H、Fmoc-L-Phe-OH、Fmoc-L-Lys(Boc)-〇H。
[0135] 試劑：!1(?丨、01(：、01^、哌啶、正辛酸。
[0136] (2)儀器
[0137] PSI300型多肽合成儀、Waters600半制備型高效液相色譜儀、磁力攪拌器。
[0138] (3)操作步驟（以0· 15mmol為例）
[0139] 按照實施例1中的操作步驟a合成序列Tyr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Lys(Boc)_Ph e-Rink Amide MBHA，然后加入20 % PIP/DMF溶液10mL，混合30min脫除氨基保護基，用 01^洗滌樹脂7次，加入 26211^?111〇(3-1^-03?(]\1?)-0!1、等摩爾偶聯試劑01(：(0.3111〇1/1)和 HOBt (0. 3mol/L)，反應3h，再雙縮3h (因為此步反應無法用茚三酮監測，顯色結果始終為 紫紅色）。用DMF洗滌5次，再用DCM洗滌5次，真空干燥之后稱重，按照100mg樹脂加入 lml2% TFA/DCM，攪拌反應lh。用DMF洗滌7次，加入65mg正辛酸，以及等摩爾的偶聯試劑 DIC(0. 3mol/L)和H0Bt(0. 3mol/L)反應，以茚三酮反應監測反應進程，監測為無色即可偶 聯下一個氨基酸，之后的氨基酸偶聯反應按照實施例1中的操作步驟a進行。之后按照實 施例1中操作步驟b-c進行裂解和純化，收集純度大于95 %的部分，然后38°C減壓濃縮至 干。該肽的分子量為1565,理論值為1566. 41。
[0140] 實施例3 :表5中其余CAMP系列抗菌肽的制備及純化
[0141] (1)材料及試劑
[0142] Rink Amide MBHA 樹脂，取代值 0· 65mmol/g。
[0143] 氛基酸為：Fmoc-L-3-(2-Thienyl) L-alanine-OH、Fmoc-L-Dab (Boc)-OH、 Fmoc-L-hArg(pbf)-〇H> Fmoc-L-Leu-〇H> Fmoc-L-Tyr(tBu)-〇H> Fmoc-L-Phe-〇H> Fmoc-L-Dap (Boc)-〇H> Fmoc-L-Dap (Mtt)-〇H> Fmoc-L-Arg (Pbf)-〇H> Fmoc-L-Lys (Boc)-〇H> Fmoc-L-Phe(4_cl)-〇H、 Fmoc-L-Phe(4_F)-〇H、 Fmoc-L-Gly-〇H、 Fmoc-L-Trp-〇H、 Fmoc-L-Thr (tBu) -OH、Fmoc-L-Asp (otBu) -OH。
[0144] 試劑：!1(?丨、01(：、01^、哌啶、正辛酸。
[0145] (2)儀器
[0146] PSI300型多肽合成儀、Waters600半制備型高效液相色譜儀、磁力攪拌器。
[0147] (3)操作步驟（以0· 15mmol為例）
[0148] 以類似實施例1中操作步驟a-c的方法制備及純化表5中的多肽，若為帶脂肪鏈 多肽則按照實施例2中的操作步驟a進行制備，收集純度大于95%的部分，然后38°C減壓 濃縮至干。ESI-MS測定值如表5所示。
[0149] 表5CAMP系列抗菌肽
[0150]
?>^
[0151] 實施例4 :體外抗菌活性測定
[0152] 根據美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS)推薦的微量肉湯稀釋法測定各抗菌 肽的最低抑菌濃度（MIC)，細菌培養基采用Mueller-Hint〇n(MH)肉湯培養基，白色念球菌 培養基采用Hyclone改良型RPMI-1640培養基。
[0153] 具體步驟為：
[0154] (1)抗菌藥物貯存液制備：
[0155] 按照路建光等（中國醫藥工業雜志Chinese Journal of Pharmaceuticals 2013, 44 (12))文獻所述的方法制備線性多肽p印-05,精確配制濃度為320 μ g/mL的上述 pep-05、CAMP 1~33和80 μ g/mL陽性對照品兩性霉素 B、硫酸多黏菌素 E及鹽酸萬古霉 素。配制好的各貯存液置于一 20°C環境中保存備用。
[0156] (2)培養基的配制：
[0157] 稱取MH肉湯培養基21g，溶于蒸餾水中并定容至1L，121°C高溫滅菌30min。
[0158] (3)接種物的制備：
[0159] 用接種環挑取形態相似待檢菌落3~5個，接種于4~5mL的MH肉湯中，35°C孵 育12~16h。處于對數生長期得到菌液用MH肉湯校正濃度至0. 5麥氏比濁標準，約含1~ 2 X 10sCFU/mL。用MH肉湯將上述菌懸液進行1 :1000稀釋后備用。
[0160] (4)稀釋抗菌藥物的制備及菌液接種：
[0161] 取一塊96孔板，在第1孔中加入160yL MH肉湯，第2-12孔中各加入100yL MH肉 湯，然后向第1孔加入抗菌藥物原液（320 μ g/mL) 40 μ L，混勻，接著吸取100 μ L至第2孔， 混勻后再從第2孔中吸取100 μ L至第3孔，如此連續倍比稀釋至第10孔，并從第10孔中吸 取100 μ L棄去，然后向第1-10孔及第12孔中加入上述制備好的接種物各100 μ L，使每孔 最終菌液濃度約為〇. 5 X 105CFU/mL。第1-10孔藥物濃度分別為32 μ g/mL、16 μ g/mL、8 μ g/ mL、4 μ g/mL、2 μ g/mL、1 μ g/mL、0. 5 μ g/mL、0. 25 μ g/mL、0. 125 μ g/mL、0. 0625 μ g/mL，第 11 孔為不含抗菌藥物及接種物的空白對照，第12孔為不含抗菌藥物的陰性對照。
[0162] (5)孵育
[0163] 接種細菌的96孔板置于35°C普通空氣孵箱中孵育16~20h，接種真菌的96孔板 置于28°C空氣孵箱中孵育40~50h。
[0164] (6)結果
[0165] 以肉眼觀察，無細菌生長的最低藥物濃度即為該樣品的最低抑菌濃度（MIC)。各抗 菌肽的MIC測定結果如表6所示。
[0166] 表6CAMP系列抗菌肽的MIC測試結果
[0167]
【主權項】
1. 一種多肽或其藥學上可接受的鹽，其中所述的多肽氨基酸序列為： Xaal- Xaa2- Xaa3- Xaa4- Xaa5- Xaa6- Xaa7- Xaa8- Xaa9- XaalO-Leu- Xaal2- Xaal3- Xaal4(SEQ ID NO:2)； 其中 Xaal 為 Lys、Gly、Dap、Dab 或缺失； Xaa2 為 Arg、hArg、Phe 或缺失； Xaa3 為 Leu、Phe、Arg 或缺失； Xaa4 為 Phe、Thi、Cpa 或 Phe (4-F); Xaa5 為 Lys、Dap、Dab 或 Dap (Cap)； Xaa6 為 Lys、Dap、Dab、Asp、Ser 或 Thr ; Xaa7 為 Leu 或 Trp ; Xaa8 為 Leu 或 Arg ; Xaa9 為 Lys、Dab 或 Dap (Cap); XaalO 為 Tyr、Leu、Trp、Lys 或 Arg ; Xaal2 為 Arg 或 hArg ; Xaal3 為 Lys、Dab 或 Dap (Cap); Xaal4 為 Phe、Thi 或 Phe (4-F)。2. 權利要求1所述的多肽或其藥學上可接受的鹽，其中Xaal優選Dab或缺失；Xaa6優 選 Lys、Dab 或 Ser ;Xaa7 優選 Leu ;XaalO 優選 Tyr、Lys 或 Arg ;Xaal4 優選 Phe 或 Phe (4-F)。3. 權利要求1所述的多肽或其藥學上可接受的鹽，其中Xaa8為Leu ;XaalO為Tyr ; 優選 Xaa8 為 Leu ;XaalO 為 Tyr ;Xaal 為 Dab 或缺失；Xaa6 為 Lys、Dab 或 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F)。4. 權利要求1所述的多肽或其藥學上可接受的鹽，其中Xaa3為Leu ;Xaa7為Leu ;Xaa8 為 Leu ;XaalO 為 Tyr ; 優選 Xaa3 為 Leu ;Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;XaalO 為 Tyr ;Xaal 為 Dab 或缺失；Xaa6 為 Lys、Dab 或 Ser ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F)。5. 權利要求1所述的多肽或其藥學上可接受的鹽，其中Xaal、Xaa2和Xaa3缺失；Xaa4 為 Phe ;Xaa6 為 Lys ;Xaa7 為 Leu ;Xaal2 為 Arg ;Xaal4 為 Phe ; 優選 Xaal、Xaa2 和 Xaa3 缺失；Xaa4 為 Phe ;Xaa6 為 Lys ;Xaa7 為 Leu ;Xaal2 為 Arg ; Xaal4 為 Phe ;XaalO 為 Tyr、Lys 或 Arg〇6. 權利要求1所述的多肽或其藥學上可接受的鹽，其中Xaal、Xaa2和Xaa3缺失；Xaa5 為 Lys ;Xaa6 為 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;Xaa9 為 Lys ;Xaal2 為 Arg ;Xaal3 為 Lys ; 優選 Xaal、Xaa2 和 Xaa3 缺失；Xaa5 為 Lys ;Xaa6 為 Ser ;Xaa7 為 Leu ;Xaa8 為 Leu ;Xaa9 為 Lys ;Xaal2 為 Arg ;Xaal3 為 Lys ;XaalO 為 Tyr、Lys 或 Arg ;Xaal4 為 Phe 或 Phe (4_F) 〇7. -種多肽或其藥學上可接受的鹽，具體選自： Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:3) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 4) Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-Arg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:5) Dab-hArg-Leu-Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:6) Dap-hArg-Leu-Phe-Dap-Dap-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:7) Dab-Arg-Leu-Thi-Dap-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:8) Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO: 9) Lys-Arg-Leu-Phe-Lys-Asp-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQID NO:10) Gly-Arg-Leu-Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO:11) Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:12) Phe-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH 2(SEQ ID NO:13) Cpa-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH 2(SEQ ID NO:14) Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH 2(SEQ ID NO:15) Phe(4-F)-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe(4-F)-NH2(SEQ ID NO:16) Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:17) Phe-Phe-Phe-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH 2(SEQ ID NO:18) Phe-Dab-Thr-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Phe-NH2(SEQ ID NO:19) Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:20) Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2(SEQ ID NO:21) Thi-Lys-Ser-Leu-Leu-Lys-Trp-Leu-Arg-Lys-Thi-NH2 (SEQ ID NO:22) Thi-Dab-Ser-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:23) Thi-Dab-Ser-Trp-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2(SEQ ID NO:24) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO :25) Phe-Dab-Dab-Leu-Leu-Dab-Tyr-Leu-hArg-Dab-Thi-NH2 (SEQ ID NO:26) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO :27) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Arg-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO :28) Phe-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO :29) Arg-Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:30) Phe-Dap (Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2 (SEQ ID NO:31) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Tyr-Leu-Arg-Dap (Cap)-Phe-NH2 (SEQ ID NO:32) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Dap(Cap)-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH 2(SEQ ID NO:33) Phe-Dap(Cap)-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Lys-Phe-NH2(SEQ ID NO:34) Phe-Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Arg-Dap(Cap)-Phe_NH2(SEQ ID N0:35)。8. 權利要求1-7任一項多肽或其藥學上可接受的鹽的制備方法，包括以下步驟： (1) 在樹脂上固相合成多肽； (2) 將步驟（1)的產物在三氟乙酸或氫氟酸中進行裂解，并加入側鏈保護基清除劑，然 后用5-20倍體積的冰乙醚沉淀多肽，離心，棄上清，再用冰乙醚反復洗滌沉淀4-5次，真空 干燥，得到粗肽。9. 權利要求8所述的制備方法，其中步驟（1)是在液相環境中進行，具體包括：浸泡樹 脂一脫除氨基保護基一洗滌一監測一偶聯氨基酸一監測一洗滌一脫除氨基保護基一順序 偶聯剩余氨基酸一干燥樹脂。10. 權利要求8所述的制備方法，其中步驟（2)所述的側鏈保護基清除劑包括茴香硫 醚、三異丙基硅烷、苯酚、水、1，2-乙二硫醇、間甲酚或上述任意兩種或者兩種以上的組合， 并與三氟乙酸或氫氟酸按5-20% (V/V)進行配制得到；優選三氟乙酸（TFA):茴香硫醚： 75% 苯酚：水=85:5:5:5。11.權利要求1-7任一項多肽或其藥學上可接受的鹽在制備抗大腸桿菌、銅綠假單胞 菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念球菌、耐藥鮑曼不動桿菌和耐藥銅綠假單胞菌 的藥物中的應用。
【文檔編號】C07K1/06GK105837675SQ201510015227
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月12日
【發明人】馮軍, 夏江華, 張喜全, 路建光, 夏春光, 王巖, 楊桂英
【申請人】正大天晴藥業集團股份有限公司, 上海醫藥工業研究院