MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑及其制備方法和用圖
【專利摘要】一種MERS?CoV主蛋白酶小分子抑制劑，基于新型冠狀病毒MERS?CoV主蛋白酶晶體結構而設計，本發明還提供了所述小分子抑制劑的合成方法，及其在制備用于治療和預防MERS?CoV感染的藥物中的用途。本發明的MERS?CoV主蛋白酶小分子抑制劑能夠顯著抑制MERS冠狀病毒主蛋白酶的活性，同時，對SARS、MHV等冠狀病毒主蛋白酶也有較好抑制活性，在制備用于治療或者預防冠狀病毒感染的藥物方面具有良好的應用前景。
【專利說明】
MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑及其制備方法和用途
技術領域
[0001]本發明為生物制藥的技術領域，具體說是一種MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑及 其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 冠狀病毒（corona virus，Co V)為有膜單股正鏈RNA病毒，"Ni do viral es"目、 "Coronaviridae"科、"Coronavirinae"亞科，是目前所知最的大RNA病毒。根據血清學特性 和遺傳學差異，冠狀病毒亞科分為α、β、γ、δ4個屬，β屬再分為四個亞群(A-D)。自2012年9月 起，一種β屬C亞群新型冠狀病毒MERS_CoV(Middle East Respiratory Syndrome &31'〇1^￥；[1'118，中東呼吸綜合征），對全球公共衛生安全造成了重大威脅。截止2015年5月25 日，據世界衛生組織(WHO)公布數據顯示，全球累計實驗室確診的感染MERS-CoV病例共1139 例，其中431例死亡(病死率37.8%)。而且，這種病毒已經波及到中國，2015年5月，廣州省惠 州市出現首例輸入性中東呼吸綜合征確認病例。因此針對新型冠狀病毒特效藥物的開發， 已迫在眉睫，這不僅是目前國際藥物開發領域的研究熱點，更是我國傳染病防治工作的重 要組成部分。
[0003] 針對冠狀病毒藥物研發的路程是比較緩慢的。早在非典之前，人們就開始對冠狀 病毒及其抑制劑進行研究，有實驗室發現了 PMSF、TLCK和PefalocS等對人類冠狀病毒229E 主蛋白酶的活性有很強的抑制作用，因其專一性差、毒副作用大而沒有應用于治療。非典期 間，科學家們試圖利用如針對RNA聚合酶、S蛋白、N蛋白等病毒重要組分研發抑制劑來阻斷 病毒的入侵、復制及轉錄，但開發新藥風險大、臨床試驗用時長，至今仍無對應靶點的特效 藥物。
[0004] 目前已對MERS-CoV的同族病毒SARS的轉錄、復制及增殖的過程有了相當深入的了 解。冠狀病毒作為單股正鏈病毒，編碼約16個非結構蛋白介導自身的轉錄復制過程。這其 中，nsp5(即主蛋白酶)參與將冠狀病毒基因組編碼的復制酶多蛋白酶切水解為病毒基因組 復制所必需的16個非結構蛋白的過程，因而在冠狀病毒的轉錄復制中發揮了至關重要作 用。并且在人體內不存在nsp5的同源蛋白，因而nsp5蛋白是一個良好的抗冠狀病毒革巴點。而 且，酶學實驗進一步證實了冠狀病毒主蛋白酶的底物結合位點是保守的。如果能夠抑制 MERS冠狀病毒主蛋白酶的水解作用，那么將會有效地抵御MERS冠狀病毒對人體的侵染。因 此，冠狀病毒主蛋白酶是抗新型冠狀病毒藥物設計的理想靶標。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑及其制備方法和用途。
[0006] 本發明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑，結構通式為如下通式⑴所示：
[0007]
I、I. I ^ J
[0008]
[0009] X為NH、0或S中任一種；
[0010] 心選自如下基團構成的組心~以的烷基羰基或者環烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲 酰基、異噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑 基幾基、啦陡基幾基、二氣甲基幾基
[0011] R2
選自如下基團構成的組:Ci~〇5的烷基或者環烷基、氣原子、苯基、芐基、對甲基 tJ· 苯基、氟代苯基、氟代芐基、羥甲基
|R3選自如下基團構成的組:&~C 5 的烷基或者環烷基、氫原子、苯基、芐基、羥基、對甲基苯基、氟代苯基、氟代芐基、 * ? ·* ?
> - > · ， ，f J
[0012] R4選自如下基團構成的組:Ci~〇6的烷基或者環烷基、氣原子、苯基、芐基、對甲基 苯基、氟代苯基、氟代芐基；
[0013] Rg選自如下基團構成的組:Ci~〇5的烷基或者環烷基、氣原子、苯基、芐基、對甲基 苯基、氟代苯基、氟代芐基。
[0014] 進一步地，
[0015] 辦優選選自如下基團構成的鉅 、，OH
[0016] 糾尤選甲基、輕甲基或Y ! ；
[0017] X 優選喊 NH;
[0018] R3優選異丙基、叔丁基、芐基、苯基、羥基、對氟芐基、 ? %，、、
[0019] R4優選環己基、異丙基、苯基、氫原子；
[0020]抱優選異丁基。
[0021 ]所述抑制劑優選自如下成員構成的組：
[0023]
[0024] 本發明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0025] A、將通式（II)對應化合物中的氨基保護基R6脫除，其中的R6選自如下基團構成的 組:叔丁氧羰基、三氟乙酰基、芐氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基；
[0026] B、在縮合劑的存在下，將步驟A的產物與通式（III)對應化合物進行縮合，得到通 式⑴，
[0027]
[0028] 其中，通式（II)和通式（III)中的辦、1?2、1?3、1]的定義都與通式（1)中的1? 1、1?2、1?3、1]定 義相同。
[0029] MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法中，還包括如下步驟:在有機溶劑中， 使通式（II)對應化合物與酸或堿在室溫下反應2~8小時，脫去氨基的保護基R6,抽去溶劑， 將得到的產物與通式（III)對應化合物溶于非質子性溶劑中，加入縮合試劑和有機堿，在室 溫下反應16~24小時，得到通式（I)對應化合物。
[0030] 所述的酸優選三氟乙酸或者鹽酸；
[0031] 所述的堿優選氫氧化鈉或甲醇鈉；
[0032] 所述有機溶劑優選選自由如下成員構成的組:〇12(：12、1'冊、01^、二氧六環 ；
[0033] 所述的非質子性溶劑優選自如下成員構成的組:〇12(：12、1'冊、01^、二氧六環、二甲 亞砜、苯；
[0034] 所述的縮合劑優選自如下成員構成的組:HATU、HBTU、EDCI、Η0ΒΤ;
[0035]所述的有機堿優選自由如下成員構成的組:LDA、三乙胺、DIEA。
[0036]本發明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑在制備用于治療或者預防冠狀病毒感 染的藥物用途。
[0037] 所述冠狀病毒為中東呼吸綜合征冠狀病毒、SARS冠狀病毒或鼠肝炎病毒中任一 種。
[0038] 本發明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑能夠顯著抑制MERS冠狀病毒主蛋白酶 的活性，同時，對SARS、MHV等冠狀病毒主蛋白酶也有較好抑制活性，在制備用于治療或者預 防冠狀病毒感染的藥物方面具有良好的應用前景。
【附圖說明】
[0039] 附圖不一定是成比例的，其目的僅僅在于更好地解釋本發明，以便于讀者理解。
[0040] 圖1為小分子N3對MERS-CoV Μρ?°的抑制活性曲線；
[0041 ] 圖2為小分子Μ14對MERS-CoV Μ'的抑制活性曲線；
[0042] 圖3為小分子M18對MERS-CoV Μρ?°的抑制活性曲線；
[0043] 圖4為小分子Μ20對MERS-CoV Μρ?°的抑制活性曲線；
[0044] 圖5、圖6、圖7分別是 Μ14的1H-NMR、13C-NMR、MS 圖譜；
[0045] 圖 8、圖 9、圖 10分別是Μ18 的1H-NMR、13C-NMR、MS 圖譜；
[0046] 圖 11、圖 12、圖 13分別是M20 的1H-NMR、13C-NMR、MS 圖譜；
[0047] 附圖中的MERS-CoV Μρ?°代表MERS冠狀病毒主蛋白酶。
【具體實施方式】
[0048] 以下通過附圖和具體實施例對本發明進行進一步詳述：
[0049] 為了敘述上的方便，本文中使用了一些特定的術語，下面逐一對其進行解釋。
[0050] "M14"、"M18"、"M20"是本發明特別優選的小分子抑制劑，其結構式分別為： LUU56J M20的結構式
[0057]化合物N3是已有報道的對SARS主蛋白酶有較好酶活性抑制作用的化合物，其結構 式為
[0058]
[0059] 本文中所使用的術語"MERS冠狀病毒主要蛋白水解酶"、"MERS-CoV Μρκι"、"MERS冠 狀病毒主蛋白酶"等，都是指MERS冠狀病毒的主要蛋白水解酶。
[0060] 的烷基"是指碳原子數在1到6之間的直鏈、支鏈或環烷基，包括但是不限 于：甲基、乙基、正丙基、異丙基、環丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、環戊基、 正己基、異己基、環己基等。
[0061 ] "氟代芐基"包括對氟芐基、間氟芐基、鄰氟芐基等。
[0062] 在部分結構式中，LDA代表二異丙基氨基鋰，Et代表乙基，"Bn"代表芐基，"Boc"代 表叔丁氧羰基。
[0063] "TFA"代表三氟乙酸，"THF"代表四氫呋喃，"DMF"代表N，N-二甲基甲酰胺，"DMS0" 代表二甲基亞砜，
[0064] "Et3N"代表三乙胺，"DIEA"代表N，N-二異丙基乙胺，"EDCI"代表1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，"HATU"代表2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'_四甲基脲 六氟磷酸酯，"HBTU"代表0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，"Η0ΒΤ"代表1-羥基苯并三 唑。
[0065] 本發明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑，結構通式為如下通式⑴所示：
.即 '>〇 ,
[0066] 1234 2 X為ΝΗ、0或S中任一種； 3 心選自如下基團構成的組:心~以的烷基羰基或者環烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲 酰基、異噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑 基幾基、啦陡基幾基、二氣甲基幾基
4 辦選自如下基團構成的組的烷基或者環烷基、氫原子、苯基、芐基、對甲基 苯基、氟代苯基、氟代芐基、羥甲基、
J1r3選自如下基團構成的組:(^~ C5的烷基或者環烷基、氫原子、苯基、芐基、羥基、對甲基苯基、氟代苯基、氟代芐基、
[0071] R4選自如下基團構成的組:&~c6的烷基或者環烷基、氫原子、苯基、芐基、對甲基 苯基、氟代苯基、氟代芐基；
[0072]他選自如下基團構成的組:&~C5的烷基或者環烷基、氫原子、苯基、芐基、對甲基 苯基、氟代苯基、氟代芐基。
[0073] 本發明的某些優選化合物符合下述通式，
[0074]
[0075] 進一步地，
[0076] Ri優選選自如下基團構成的組：
[0077] 吣優選甲基、羥甲基或
[0078] X 優選 0 或 NH;
[0079] R3優選異丙基、叔丁基、芐基、苯基、羥基、對氟芐基 v、
- .f、
[0080] R4優選環己基、異丙基、苯基、氫原子；
[0081 ] R5優選異丁基。
[0082]所述抑制劑優選自如下成員構成的組：
[0084]
[0085] 本發明的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法，包括如下步驟：
[0086] A、將通式（II)對應化合物中的氨基保護基R6脫除，其中的R6選自如下基團構成的 組:叔丁氧羰基、三氟乙酰基、芐氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基；
[0087] B、在縮合劑的存在下，將步驟A的產物與通式（III)對應化合物進行縮合，得到通 式⑴，
[0088]
[0089] 其中，通式（II)和通式（III)中的心辦^的定義都與通式⑴中的心上^定 義相同。
[0090] MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法中，還包括如下步驟:在有機溶劑中， 使通式（II)對應化合物與酸或堿在室溫下反應2~8小時，脫去氨基的保護基R6,抽去溶劑， 將得到的產物與通式（III)對應化合物溶于非質子性溶劑中，加入縮合試劑和有機堿，在室 溫下反應16~24小時，得到通式（I)對應化合物。
[0091] 所述的酸優選三氟乙酸或者鹽酸；
[0092] 所述的堿優選氫氧化鈉或甲醇鈉；
[0093] 所述有機溶劑優選選自由如下成員構成的組:〇12(：12、1'冊、01^、二氧六環；
[0094] 所述的非質子性溶劑優選自如下成員構成的組:〇12(：12、1'冊、01^、二氧六環、二甲 亞砜、苯；
[0095] 所述的縮合劑優選自如下成員構成的組:HATU、HBTU、EDCI、Η0ΒΤ;
[0096]所述的有機堿優選自由如下成員構成的組:LDA、三乙胺、DIEA。
[0097] 通式（II)對應化合物的合成可參考文獻：Qingping Tian，Naresh K.Nayyar, Srinivasan Babu,Lijian Chen,Junhua Tao, Steven Lee ,Anthony Tibbetts ,Terence Moran, Jason Liou,Ming Guo and Timothy P.Kennedy Tetrahedron Lett.2001,42, 6808-6809。通式（III)對應化合物合成可參考文獻:Dawei Ma，Weiqing Xie，Bin Zou， Qiong Lei and Duanqing Pei Tetrahedron Lett.2004,45,8103_8105〇
[0098] 在本發明的一些優選實施例中，將通式（II)化合物在有機溶劑中與酸室溫反應4 ~6小時;抽去溶劑，與通式（III)化合物溶于非質子性溶劑中，加入縮合劑，然后加入有機 堿，在室溫下反應12~24小時得到通式（I)化合物。
[0099]其中，上面所述的酸優選為三氟乙酸或鹽酸;優選的有機溶劑選自由下成員構成 的組:0^12、1'冊、1^二甲基甲酰胺、01^0、苯;優選的縮合試劑選自如下成員構成的組 ：撤1'1]、耶1'1]40(：1、0此4;優選的有機堿選自如下成員構成的組:二異丙基乙基胺、三乙胺。
[0100] 本發明挑選化合物M14、M18、M20合成來對本發明的合成方法及應用進行說明，但 不意味著限制本發明其余化合物的應用范圍：
[0101] 為了更加詳細地解釋本發明，下面將結合附圖給本發明的具體實施例。在對這些 實施例進行描述時，沒有對公知的實驗方法、儀器、試劑和材料等進行詳細的描述，以避免 喧賓奪主。
[0102] 實施例1:
[0103] 將 300m
容解在 3mL
[0104] 干燥CH2C12中，加入0.49g碳酸氫鈉，之后加入1.23g戴斯馬丁試劑，室溫下反應8~
12小時，用硫代硫酸鈉溶液淬滅反應，飽和食鹽水洗滌后旋干得： 。用干燥THF
? 5ml溶解后待用。將| 溶于5ml干燥THF中，-78°C冷卻攪拌，之后加入60% NaH 0.078g攪拌lh，隨即緩慢加入待用的
液，關閉制冷，反應12h，用飽和氯 化銨淬滅反應，旋干體系中的T H F，用E A萃取產物。快速硅膠柱層析，得到8 2 m g產物
將得到的產物溶于lmL CH2C12,加入58yL TFA，室溫攪拌反應2小時， 抽干浴刑得到脫除Boc保護的產物，之后將其溶解在5ml的CH2C12中，加入158mg
[0105] 以及257uL DIEA，之后加入220mg HATU。體系于室溫下反應12小時，依次用1M HC1、飽和NaHC03水溶液、飽和食鹽水洗滌，之后收集有機相，無水Na2S〇4干燥，將Na 2S〇4過濾 出去，有機相減壓蒸去溶劑，快速硅膠柱層析，得到5 0 m g產物Μ 1 4
[0106] 產物氫譜以及質譜數據如下：
[0107] = 8.01-8.08(m，lH，NH)，7.86-7.95(m，lH，NH)，7.52-7.66(m，lH，NH)，6.77-6.88(m，lH，= CH)，6.54(d，J = 7.1Hz，lH，=CH)，5.75-5.89(m，lH，=CH)，4.89-4.98(m，lH，CH)，4.48- 4.57(m，2H，2CH),4.12-4.30(m，2H，2CH),3.01-3.18(m，2H，CH2)，2.46(s，3H，CH 3) ,2.10- 2.33(m，2H，CH2)，1.91-1.98(m，lH，CH)，1.78-1.90(m，lH，CH)，1.53-1.68(m，2H，CH2) ,1.40- 1.49(m,3H,CH2,CH),1.30(d J = 7.1Hz,3H,CH3) ,1.21(d J = 6.0Hz,6H,2CH3) ,0.91(d,J = 6.6Hz,3H,CH3),0.83(t J = 5.9Hz,9H,3CH3)〇
[0108] 13C-MlR(101MHz，DMS0-d6):Sl78.77(s)，172.11(s),172.03(s)，171.74(s)， 171.04(s),165.53(s),159.06(s),158.66(s),149.61(s),120.48(s),101.78(s),67.71 (s),57.87(s),51.86(s),49.12(s),47.73(s),41.19(s),38.00(s),35.45(s),31.25(s), 30.89(s),29.47(s),27.81(s),24.72(s),23.16(s),22.29(s),22.08(s),19.53(s),18.53 (s),18.44(s),12.29(s)〇
[0109] ESI-MS calcd for[C3iH48N608,M+H]+:633.35,Found:633.49〇
[0110] 實施例2:
[0111] 將
i 于 3ml CH2CI2 中，加入 220μ1 DIEA 和 140mg
常溫攪拌12h，硅膠柱層析得到1
[0112] 將得到的產物溶于lmL CH2C12,加入58yL TFA，室溫攪拌反應2小時，抽干溶劑得到 脫除Boc保護的產物，之后將其溶解在3ml的CH2C12中，加入192m:
[0113] 以及320ul DIEA，之后加入380mg HATU。體系于室溫下反應12小時，依次用1M HC1、飽和NaHC03水溶液、飽和食鹽水洗滌，之后收集有機相，無水Na2S〇4干燥，將Na 2S〇4過濾 出去，有機相減壓蒸去溶劑，快速硅膠柱層析，得到80mg產物Ml
[0114] 產物氫譜以及質譜數據如下：
[0115] 4 匪R(400MHz，DMS0-d6) :δ8.59((1, J = 7.5Hz，ΙΗ,ΝΗ)，8· 18-8 ·28(ι?，ΙΗ,ΝΗ)， 7.98-8.09(m，lH，NH)，7.89-7.97(m，lH，NH)，7.57(s，lH，NH)，7.13-7.46(m，4H，-Ph)，6.82- 6.93(m，1H，=CH)，6· 55(s，1H，=CH)，5.83-5.92(m，2H，=CH，CH) ,4.42-4.64(m，2H，2CH)， 4.14-4.31(m,2H,2CH),2.98-3.20(m,2H,CH2),2.47(s,3H,CH 3) ,2.22-2.36(m,lH,CH), 2.04-2.20(m,1H,CH),1.76-2.00(m,2H,CH2),1.60-1.71(m,lH,CH),1.39-1.58(m,7H, 2CH2,CH3),1.24-1.35(d,3H,CH3),0.88-0.94(m,3H,CH 3),0.78-0.85(m,9H,3CH3)〇
[0116] 13C NMR(101MHz,DMS0-d6):5178.76(s),172,02(s),171.74(s),171,04(s), 165.21(s),159.07(s),158.65(s),151.93(s),139.64(s),128.51((1,C-F),125.37(s), 120.04(s),115.78(2),115.57(2),101.78(s),71.60(s),57.86(s),51.88(s),49.12(s), 47.76(s),41.18(s),38.00(s),34.84(s),31.27(s),30.89(s),29.48(s),24.73(s),23.08 (s)，22.55(s)，21.49(s)，19.52(s)，18.54(s)，14.41(s)，12.29(s)。
[0117] ESI-MS calcd for[C36H49FN608，M+H]+:713.36，Found:713.43 〇
[0118] 實施例3
[0119] 來
§于3mlCH2Cl2中，加入220yLDIEA和 140mg
常 溫攪拌12h，硅膠柱層析得到98n
[0120] 將得到的產物溶于lmL CH2C12,加入58yL TFA，室溫攪拌反應2小時，抽干溶劑得 到脫除Boc保護的產物，之后將其溶解在5ml的CH2C12中，加入192mg
[0121] 以及320yL DffiA，之后加入380mg HATU。體系于室溫下反應12小時，依次用1M HC1、 飽和NaHC03水溶液、飽和食鹽水洗滌，之后收集有機相，無水Na2S04干燥，將Na 2S04過濾出去， 有機相減壓蒸去溶劑，快速硅膠柱層析，得到82mg產物M2I
[0122] 產物氫譜以及質譜數據如下：
[0123] 匪R(400MHz，DMS0-d6) :δ8.58((1, J = 7.5Hz，ΙΗ,ΝΗ)，8· 17-8 ·32(ι?，ΙΗ,ΝΗ)， 8.06(d，J = 7.6Hz，lH，NH)，7.93(d，J = 8.8Hz，lH，NH)，7.58(s，lH，NH)，7.26-7.39(m，5H，- Ph),6.82-6.96(m,lH,=CH),6.55(s,lH,=CH),5.90(d ,J=15.7Hz,lH,=CH),5.61-5.70 (m,lH,CH),4.47-4.60(m,2H,2CH),4.17-4.32(m,2H,2CH),2.96-3.19(m,2H,CH2),2.47(s, 3H,CH3),2.26-2.34(m,lH,CH),2.05-2.14(m,lH,CH),1.77-1.98(m,4H,2CH 2) ,1.53-1.70 (m, 2H, CH2), 1.42-1.50(m,3H,CH2,CH),l. 31 (d,J = 7.1Hz,3H,CH3), 0.89-0.96(m,3H,CH3), 0.80-0.86(m,12H,4CH3)〇
[0124] 13C-NMR(101MHz,DMS0-d6):5178.76(s),172.01(s),171.73(s),167.43(s), 159.07(s),158.65(s),150.33(s),132.20(s),132.03(s),129.11(s),128.91(2),128.81 (2),126.61(s),126.55(s),101.78(s),67.87(s),57.85(s),51.90(s),49.12(s),47.77 (s),41.22(s),38.56(s),30.88(s),30.27(s),28.83(s),23.72(s),22.86(s),19.52(s), 19.29(s),18.54(s),18.46(s),14.33(s),12.28(s),11.25(s),10.12(s)〇
[0125] ESI-MS calcd for[C37H52N608，M+H]+:709.38，Found:709.46。
[0126] 以上實施例均可由以下反應過程進行概括，本專利中其余化合物均可由相同或近 似過程進行制備：
[0127]
....
[0128] 在對以上實施例彳進行合成時，參考了如下的反應式 U ·
,，、. 、一 (其中化合物下方的一位或二位阿拉伯數字為其編號）：
[0129
[0130」化合物2的制備：
[0131] 將lg氫氧化鈉溶于lOmL水中，加入5mL 1，4-二氧六環，在冰浴下冷卻后，加入lg化 合物1，然后加入1.83g(Boc)2〇,室溫下攪拌8~12小時，用1M鹽酸調節pH4-5,之后用乙酸乙 酯萃取，收集乙酸乙酯相，無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發除去乙酸乙酯得1.67g化合物2,產率 95%〇
[0132] 化合物3的制備：
[0133] 將1.67g化合物2溶于25mL DMF，加入2g無水碳酸鉀，反應體系置于冰浴下冷卻，然 后加入lmL溴化芐，室溫攪拌8~12小時，然后加入少量水，室溫攪拌30分鐘，將反應體系過 濾，收集濾液，將體系用二氯甲烷稀釋，水洗滌，收集有機相，無水硫酸鈉干燥，旋轉蒸發除 去溶劑得2.09g化合物3，產率90 %。
[0134] 化合物5的制備：
[0135] 將2.044g化合物3溶于20ml二氯甲烷，然后加入5mL TFA室溫攪拌2~4小時，將溶劑減 壓蒸去，油栗抽干，得到的油狀物溶于20ml二氯甲烷中，反應體系置于冰浴中，冷卻后加入 5mL三乙胺，然后加入1.92!
1 .〇g H0BT以及1.46g EDCI，室溫攪拌反應過夜。 將反應體系依次用1M鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌，收集有機相，加 入無水硫酸鈉干燥，之后將硫酸鈉過濾除去，蒸去溶劑，快速硅膠柱層析得到2.64g化合物 5,產率90%。
[0136] 化合物7的制備：
[0137] 將0.61g化合物5溶于5mL二氯甲烷中，加入lmL TFA，室溫攪拌2~4小時，減壓蒸去 溶劑，油栗抽干，得到的油狀物用5mL二氯甲烷溶解，之后加入l.lmL三乙胺以及0.25g
后加入0.21g Η0ΒΤ和0.3g EDCI，體系于室溫下攪拌過夜反應。反應完畢后 依次用1M的鹽酸、飽和碳酸氫鈉水溶液、飽和氯化鈉水溶液洗滌，收集有機相，加入無水硫 酸鈉干燥，之后將硫酸鈉過濾除去，收集有機相蒸去溶劑，快速硅膠柱層析得〇 . 58g化合物 7,產率83%。
[0138] 化合物9的制備：
[0139] 將470mg化合物7溶于2ml二氯甲烷中，加入0.7mL TFA，室溫攪拌2~4小時，反應完 全之后，將溶劑減壓蒸去，油泵抽干，將得到的油狀物溶于2mL二氯甲烷中，之后依次加入 0.8mL三乙胺、0.11
).14g Η0ΒΤ以及0.2g EDCI，體系于室溫下攪拌反應8~12小 時，反應完全之后，依次用1M鹽酸、飽和碳酸氫鈉、飽和食鹽水洗滌，收集有機相，加入無水 硫酸鈉干燥，之后將硫酸鈉過濾除去，收集有機相減壓蒸去溶劑，快速硅膠柱層析得到 〇.418化合物9，產率85%。
[0140] 化合物10的制備：
[0141] 將100mg化合物9溶于lmL THF中，加入9.3mg氫氧化鋰，加入2ml水，之后體系攪拌 過夜反應，反應完全后，加入1M鹽酸酸化，調節pH4-5，之后減壓蒸去溶劑，得到的白色固體 用水洗滌一次，收集固體，真空干燥得l〇〇mg化合物10，產率100%。
[0142] 小分子抑制劑對MERS-CoV ]\Τ°抑制活性研究：
[0143] 一、原理與方法：
[0144] 酶的活性測定：
[0145] 用連續動力學測定冠狀病毒主蛋白酶活性，使用熒光標記底物MCA-AVLQSGFR-Lys (Dnp)-Lys_NH2(純度2 95%，上海吉爾生化有限公司）。用Fluoraskan Ascent焚光儀 (ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)測定焚光強度，激發光和發射光波長分別為320nm 和405nm。
[0146] 酶反應緩沖液體系為50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA。動力學參數是在30°C測 定的。其中Vmax是最大反應速度，[S]是底物的濃度，Km是米氏常數，利用1/V對1/[S]進行線 性擬合即可求得VmajPKm。
[0147] Km的值是指酶促反應速率達到一半時所對應的底物濃度。Km反映的是酶的特性參 數，它的大小與酶濃度無關，只與酶的種類有關，會隨著體系中測定的參數變化而變化。Km 越小，酶對底物的親和力越高。
[0148] 1 /V = 1 /Vmax+Km/Vmax* 1 / [ S]
[0149] 在酶活性參數的實驗中，反應時向同一種蛋白酶體系同時分別加入不同濃度的底 物，由此計算主蛋白酶的KdPVmax，底物濃度一般選取5~8個不同的值，熒光強度對時間曲 線用GraphPad Prism 5程序擬合。
[0150] MERS冠狀病毒主蛋白酶KjPVmax的測定：
[0151] 在酶反應緩沖液中加入0.5μΜ (終濃度）的MERS冠狀病毒主蛋白酶，30 °C孵育lmin， 立即同時加入不同濃度的熒光標記底物[50、40、30、20、10、5、2.5μΜ(終濃度）]，1200rpm/ min，震蕩15s，每4s記錄一次熒光讀數，總時間600s，利用熒光強度對時間曲線用GraphPad Prism5 程序擬合。得到 Km=41 ·02±5.421yM，Vmax=42.84mol/L/s〇
[0152] 抑制劑活性的測定：
[0153] 當初步篩選實驗證明某種抑制劑有效后，我們即開始嚴格的動力學參數測定。將 時間依賴型抑制劑的反應過程曲線按照一階指數形式擬合，即可以得到表觀一級抑制速率 常數(k-。其中Vo是初始反應速率，P是產物的熒光強度，t為時間，D是為了解決零時刻熒光 強度不為零而引入的位移參量。通過公式（1)可求得k〇bs。在公式(2)中，利用1/1^8對1/[1] 進行線性擬合，即可求得KdPK3,我們用心/心表示二級反應速率常數。其中[I]是抑制劑的 濃度，[S]是底物的濃度，Km是米氏常數，K3是抑制劑使酶失活的反應速率常數，Ki是抑制劑 與酶之間非共價結合的平衡常數。
[0154] P = (vo/k〇bs) (1 -exp (-k〇bs t)) +D (1)
[0155]
[0156] 在抑制劑動力學參數測定實驗中，反應時向同一種蛋白酶體系同時分別加入不同 濃度的抑制劑分子(同一抑制劑分子），根據酶活性的高低，底物濃度選擇20μΜ，由此計算不 可逆小分子抑制劑的Ki和Κ3的值。
[0157] 抑制劑濃度一般選取5~8個不同的值，熒光強度對時間曲線用GraphPad Prism 5 程序擬合。
[0158] 化合物N3對MERS-CoV ]\Τ°抑制活性的測定：
[0159] 用緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV ΜρΜ90μ1(主蛋白酶 在終反應體系下終濃度0.5μΜ)，用含有熒光標記底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-LyS-NH2(終 反應體系下終濃度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀釋化合物N3[5，3.75，2.81，2.10，1.58， 1.18，0.88，0· 66,0.50，0·37，0·28，0μΜ(終濃度）]，每個梯度 10μ1，將 90μ1 主蛋白酶溶液 30 °C孵育lmin，迅速同時加入已配制好的梯度濃度化合物Ν3溶液，1200rpm/s，震蕩15s，每6s 記錄一次熒光讀數，總時間600s，利用熒光強度對時間曲線用GraphPad Prism 5程序擬合。 Ki = 0 ·4872±0·0871μΜ，Κ3 = 0· 0151 ±0.00083s-^1(3/1 = 0.031^1^8^
[0160] 化合物M14對MERS-CoV ]\Τ°抑制活性的測定：
[0161] 用緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV ΜρΜ90μ1(主蛋白酶 在終反應體系下終濃度0.5μΜ)，用含有熒光標記底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(終 反應體系下終濃度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀釋化合物M14[5，3.75，2.81，2.10，1.58， 1.18,0.88,0.66,0.50,0.37,0.28，0μΜ(終濃度）]，每個梯度 10μ1，將 90μ1 主蛋白酶溶液 30 °C孵育lmin，迅速同時加入已配制好的梯度濃度化合物Μ14溶液，1200rpm/s，震蕩15s，每6s 記錄一次熒光讀數，總時間600s，利用熒光強度對時間曲線用GraphPad Prism 5程序擬合。 Ki = 0 · 3050±0 ·0528μΜ，Κ3 = 0 ·0244±0· 0011s-^1(3/^ = 0.080241^8^
[0162] 化合物M18對MERS-CoV ]\Τ°抑制活性的測定：
[0163] 用緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV ΜρΓ°90μ1(主蛋白酶 在終反應體系下終濃度0.5μΜ)，用含有熒光標記底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(終 反應體系下終濃度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀釋化合物M18 [3，2.25，1.68，1.26，0.95， 0.71，0.53,0.40,0.30,0.22,0.16，(^]?(終濃度）]，每個梯度1(^1，將9(^1主蛋白酶溶液30 °C孵育lmin，迅速同時加入已配制好的梯度濃度化合物M18溶液，1200rpm/s，震蕩15s，每6s 記錄一次熒光讀數，總時間600s，利用熒光強度對時間曲線用GraphPad Prism 5程序擬合。 Ki = 0 ·2784±0·0508μΜ，Κ3 = 0·0224±0· 0012s-^1(3/^ = 0.080541^8^
[0164] 化合物M20對MERS-CoV ]?_抑制活性的測定：
[0165] 用緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 7.3)，lmM EDTA)配制MERS-CoV ΜρΓ°90μ1(主蛋白酶 在終反應體系下終濃度0.5μΜ)，用含有熒光標記底物MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH2(終 反應體系下終濃度20μΜ)的DMSO溶液依次等梯度稀釋化合物M20 [3，2.25，1.68，1.26，0.95， 0.71，0.53,0.40,0.30,0.22,0.16，(^]?(終濃度）]，每個梯度1(^1，將9(^1主蛋白酶溶液30 °C孵育lmin，迅速同時加入已配制好的梯度濃度化合物M20溶液，1200rpm/s，震蕩15s，每6s 記錄一次熒光讀數，總時間600s，利用熒光強度對時間曲線用GraphPad Prism 5程序擬合。 Ki= 1 · 2087±0 · 2533μΜ, K3 = 0 · 05905±0 · 008083s-^1(3/1^ = 0.048841^8^
[0166] 二、結果與分析
[0167] M14、M18、M20對MERS-CoV Mpr。的抑制活性
[0168] 由附圖1至附圖13可以看出，M14、M18、M20對MERS-CoV Μρ?°都有顯著的抑制活性， 結合K3/Ki的值進行比較，本專利中的優選分子對MERS-CoV ΜΡΜ抑制活性均高于Ν3化合物。
[0169] 本文中所涉及的參考文獻，包括專利文件、學術論文、出版物等，均以引用的方式 將其全部內容包括在本文中。應當注意，本發明中所涉及的各種實驗操作，均為本領域的常 規技術，如果在文中沒有特別說明，則本領域的普通技術人員可以參照本發明申請日之前 的各種常用工具書、科技文獻或相關的說明書、手冊等加以實施。本文中所涉及的各種實驗 用品（包括但不限于:化學試劑、生物制品、細胞、生物體、儀器等)之中，對于那些特殊的或 者不宜獲得的，文中均已注明了制造商、參考文獻或詳細的制備方法;未經特別說明的，均 為常規實驗用品，在本發明申請日之前，可以通過各種方式(例如購買、自行制備等)很方便 地獲得。
[0170]應當理解，在不偏離本發明的精神和范圍的情況下，本領域的普通技術人員可以 在形式和細節上對其做出各種改變和改進，而這些均被認為落入了本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑，其特征在于，結構通式為如下通式(I)所示：其中蝸X為NH、0或S中任一種； Ri選自如下基團構成的組:Cl~C6的烷基幾基或者環烷基幾基、叔下氧幾基、苯甲酯基、 異嗯挫基幾基、巧喃基幾基、化咯基幾基、嚷吩基幾基、咪挫基幾基、化挫基幾基、嚷挫基幾 基、化晚基幾基、Ξ氣甲基幾基R2選自如下基團構成的組:Cl~C5的烷基或者環烷基、氨原子、苯基、芐基、對甲基苯基、 氣代苯基、氣代芐基、徑甲基R3選自如下基團構成的組:Cl~C5的烷基或者環烷基、氨原子、苯基、芐基、徑基、對甲基 苯基、氣代苯基、氣代芐基，R4選自如下基團構成的組:Cl~C6的烷基或者環烷基、氨原子、苯基、芐基、對甲基苯基、 氣代苯基、氣代芐基； Rs選自如下基團構成的組:Cl~C5的烷基或者環烷基、氨原子、苯基、芐基、對甲基苯基、 氣代苯基、氣代芐基。2. 根據權利要求1中所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑，其特征在于： Ri優選選自如下基團構成的組：化優選甲基、徑甲基或X優選0或NH; R3優選異丙基、叔下基、芐基、苯基、徑基、對氣芐基R4優選環己基、異丙基、苯基、氨原子； 化優選異下基。3.根據權利要求2中所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑，其特征在于:所述抑制劑 優選自如下成員構成的組：4. 一種權利要求1所述MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法，包括如下步驟： A、 將通式(II)對應化合物中的氨基保護基R6脫除，其中的R6選自如下基團構成的組:叔 下氧幾基、Ξ氣乙酷基、節氧幾基、贊甲氧幾基、締丙氧幾基； B、 在縮合劑的存在下，將步驟A的產物與通式（III)對應化合物進行縮合，得到通式 (I)，其中，通式（II)和通式（III)中的化、R2、R3、U的定義都與通式（I)中的化、R2、R3、U定義相 同。5. 根據權利要求4所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法，包括如下步驟： 在有機溶劑中，使通式（II)對應化合物與酸或堿在室溫下反應2~8小時，脫去氨基的保護 基R6，抽去溶劑，將得到的產物與通式（III)對應化合物溶于非質子性溶劑中，加入縮合試 劑和有機堿，在室溫下反應16~24小時，得到通式(I)對應化合物。6. 根據權利要求4所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的制備方法，其特征在于： 所述的酸優選Ξ氣乙酸或者鹽酸； 所述的堿優選氨氧化鋼或甲醇鋼； 所述有機溶劑優選選自由如下成員構成的組:C出札、1^、01。、二氧六環； 所述的非質子性溶劑優選自如下成員構成的組:C此〇2、1'邸、01。、二氧六環、二甲亞諷、 苯； 所述的縮合劑優選自如下成員構成的組:HATU、皿TU、EDCI、冊BT; 所述的有機堿優選自由如下成員構成的組:LDA、S乙胺、DIEA。7. 權利要求1~3中的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑在制備用于治療或者預防冠狀 病毒感染的藥物用途。8. 根據權利要求7所述的MERS-CoV主蛋白酶小分子抑制劑的用途，其中所述冠狀病毒 為中東呼吸綜合征冠狀病毒、SARS冠狀病毒或鼠肝炎病毒中任一種。
【文檔編號】A61K31/4025GK105837487SQ201610153875
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月17日
【發明人】饒子和, 傅晟, 楊海濤, 楊誠, 蔡巖, 王喆, 劉賀, 李爽, 徐楊
【申請人】天津國際生物醫藥聯合研究院