一種提取瑪咖酰胺類化合物的方法
【專利摘要】本發明公開了一種提取瑪咖酰胺類化合物的方法，該方法為取瑪咖鮮果或干果，切片后干燥，再粉碎得瑪咖粉；將瑪咖粉與有機溶劑混合，超聲提取后，離心取上清液；上清液蒸干后加入有機溶劑溶解，再加入堿性溶液進行反應；將反應液蒸干，加入水和正己烷進行萃取，收集正己烷萃取層分離出咖酰胺類單體化合物。本方法所得到產物的脂肪酸等雜質含量減少，瑪咖酰胺類化合物得率提高，產品的純度高，活性好。
【專利說明】
一種提取瑪咖酰胺類化合物的方法
技術領域
[0001]本發明屬生物技術領域，尤其涉及從瑪咖中提取瑪咖酰胺類化合物的方法。
【背景技術】
[0002]瑪咖(Lepidium meyenii Walp.)為十字花科獨行菜屬，一年或兩年生草本植物，含有豐富的蛋白質、氨基酸、糖、脂肪酸、維生素和礦物質等營養物質，已有數千年的食用歷史。活性成分包括生物堿、芥子油苷及其分解產物、留醇等。瑪咖含有的次級代謝產物，如瑪咖酰胺類化合物等，可以用于預防、診斷、治療或調節人體機能，其主要功效有補腎陽，益精血，用于月經不調、卵巢痿縮、不孕不育、陽痿早泄、失眠多夢、更年期綜合癥、疲勞綜合癥、免疫力低下、記憶力衰退、骨質疏松和貧血等。此外有研究結果表明，瑪咖還具有一定的防癌抗癌作用。
[0003]目前針對瑪咖的研究和開發主要集中在營養成分和整體生物功效上，對瑪咖中所特有的瑪咖酰胺類化合物的研究較少。目前已有的瑪咖酰胺提取方法，活性成分損失嚴重且雜質很難去除，雜質主要包括脂肪酸及其酯類，植物留醇和其他類的生物堿等。本發明中酸堿反應可以除去脂肪酸等雜質，富集瑪咖酰胺類化合物，主要是通過氫氧化鈉和脂肪酸等物質化學反應，形成不溶于有機溶劑的酯類物質，從而除去脂肪酸，由于瑪咖酰胺的化學性質比較穩定，所以選擇好最佳的反應條件，即有效的除去雜質，也富集活性成分，不影響其活性和得率。根據《瑪咖干制品質量標準》(DBS 53/001—2015)，瑪咖中主要包含五種瑪咖酰胺，依次是間甲氧基-芐基-亞麻酰胺(分子量397.60)，芐基-亞麻酰胺(367.57)，間甲氧基-芐基-亞油酰胺(399.62),芐基-亞油酰胺(369.59)和芐基-十六烷酰胺(345.57)。瑪咖酰胺類化合物可以作為瑪咖質量鑒別標準之一，從瑪咖中提取純化瑪咖酰胺，可以為瑪咖的藥理藥效深入研究提供物質基礎，擴大瑪咖的市場用途。
【發明內容】
[0004]為了解決現有技術方法的局限性，本發明通過研究建立了一種可以有效的去除雜質，富集瑪咖酰胺類化合物的方法。
[0005]本發明的目的在于提供一種提取瑪咖酰胺類化合物的方法。
[0006]本發明所采取的技術方案是:
一種提取瑪咖酰胺類化合物的方法，包括以下步驟:
1)取瑪咖鮮果或干果，切片后干燥，再粉碎得瑪咖粉；
2)將瑪咖粉與有機溶劑混合，超聲提取后，離心取上清液；
3)將上步所得上清液蒸干后，加入有機溶劑溶解，再加入堿性溶液進行反應；
4)將上步反應后的溶液蒸干，加入水和正己烷進行萃取，收集正己烷萃取層；
5)從上步收集的正己烷萃取層用液相色譜法分離出瑪咖酰胺類單體化合物，即可。
[0007]進一步的，步驟2)中瑪咖粉與有機溶劑的用量比為Ig:(20~40)mL。
[0008]進一步的，步驟2 )所述有機溶劑選自乙醇、正己烷、乙醚、甲醇、石油醚中的至少一種。
[0009]進一步的，步驟2)所述超聲提取的溫度為35?45°C，時間為25?35 min。
[0010]進一步的，步驟3)所述有機溶劑選自乙醇、正己烷、乙醚、甲醇、石油醚中的至少一種。
[0011 ]進一步的，步驟3)所述有機溶劑的體積用量為4~6 mL每克瑪咖粉。
[0012]進一步的，步驟3)所述堿性溶液的濃度為0.5?1.5mol/L，體積用量為3~6 mL每克瑪咖粉。
[0013]進一步的，步驟3)所述堿性溶液選自氫氧化鈉溶液、氨水、氫氧化I丐溶液、乙酸鈉溶液、亞硫酸鈉溶液、碳酸銨溶液中的至少一種。
[0014]進一步的，步驟3)所述反應為25?50°C水浴反應40?60 min。
[0015]進一步的，步驟4)所述水和正己烷的體積用量與瑪咖粉的質量比為(10?30)mL:(I~20)mL:I go
[0016]本發明的有益效果是:
本發明方法得到的瑪咖正己烷萃取層中瑪咖酰胺類化合物的含量達到23.21%;瑪咖酰胺的總含量可達23.21%，相對于《瑪咖干制品質量標準》中的提取方法，瑪咖酰胺的相對含量上升了 73.9%，瑪咖酰胺類化合物得率大大提高，雜質含量明顯減少，產品的純度高，活性好，正己烷萃取層可直接通過液相色譜法獲得瑪咖酰胺單體化合物。且本發明方法簡單高效，具用很好的應用前景。
【附圖說明】
[0017]圖1為按照云南省計劃和生育委員會頒布的《瑪咖干制品質量標準》(DBS53/001-2015)中，瑪咖酰胺提取方法得到的高效液相色譜圖；液相色譜條件為:色譜柱= WatersSunFire? C18柱(150X4.6 mm, 5 μπι);流動相:乙腈(B)和水(A)，梯度洗脫程序:O?10min:50%B?85%Β，10?25 min:85%B?95%Β;流速:I mL/min;液相紫外檢測波長:210 nm；
圖2為實施例1中正己烷萃取層上樣后得到的高效液相色譜圖，液相色譜條件同圖1。
【具體實施方式】
[0018]一種提取瑪咖酰胺類化合物的方法，包括以下步驟:
1)取瑪咖鮮果或干果，切片后干燥，再粉碎得瑪咖粉；
2)將瑪咖粉與有機溶劑混合，超聲提取后，離心取上清液；
3)將上步所得上清液蒸干后，加入有機溶劑溶解，再加入堿性溶液進行反應；
4)將上步反應后的溶液蒸干，加入水和正己烷進行萃取，收集正己烷萃取層；
5)從上步收集的正己烷萃取層中采用液相色譜法分離出咖酰胺類單體化合物，即可。
[0019]優選的，步驟I)所述干燥的溫度為30?50°C，時間為6?12 h。
[0020]更優選的，所述干燥的溫度為50°C，時間為12 ho[0021 ]優選的，步驟I)所述瑪咖粉能過40目以上篩。
[0022]優選的，步驟2)中瑪咖粉與有機溶劑的用量比為Ig:(20?40)mL。
[0023]更優選的，步驟2)中瑪咖粉與有機溶劑的用量比為Ig:30 mL。
[0024]優選的，步驟2)所述有機溶劑選自乙醇、正己烷、乙醚、甲醇、石油醚中的至少一種。
[0025]更優選的，步驟2)所述有機溶劑為乙醚。
[0026]優選的，步驟2)所述超聲提取的溫度為35?45°C，時間為25?35 min。
[0027]更優選的，步驟2)所述超聲提取的溫度為40°C，時間為30 min。
[0028]優選的，所述超聲時的條件參數為超聲工作時間1.5S，間隙時間1.0 S，變幅桿Φ6，輸出功率50%。
[0029]優選的，步驟2)所述離心的相對離心力為2500~3500Xg，時間12?18 min。
[0030]優選的，步驟3)所述有機溶劑選自乙醇、正己烷、乙醚、甲醇、石油醚中的至少一種。
[0031]更優選的，步驟3)所述有機溶劑為乙醇。
[0032]優選的，步驟3)所述有機溶劑的體積用量為4?6mL每克瑪咖粉。
[0033]優選的，步驟3)所述堿性溶液的濃度為0.5?1.5 mol/L，體積用量為3~6 mL每克瑪咖粉。
[0034]優選的，步驟3)所述堿性溶液選自氫氧化鈉溶液、氨水、氫氧化I丐溶液、乙酸鈉溶液、亞硫酸鈉溶液、碳酸銨溶液中的至少一種。
[0035]優選的，步驟3)所述反應為25?50°C水浴反應40?60 min。
[0036]更優選的，步驟3)所述反應為30°C水浴反應50 min。
[0037]優選的，步驟4)所述水和正己烷的體積用量與瑪咖粉的質量比為(10?30)mL:(I?20)mL:I go
[0038]更優選的，所述水和正己烷的體積用量與瑪咖粉的質量比為(20?30)mL: (2?15)mL:I g；
最優選的，所述水和正己烷的體積用量與瑪咖粉的質量比為30 mL:5 mL:l g。
[0039]步驟4)所得到的正己烷萃取層用液相色譜法分離出瑪咖酰胺類單體化合物。
[0040]下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0041 ] 實施例1
I)挑選健康的瑪咖鮮果洗凈，均勻的切片，置于鼓風干燥箱中，在40°C條件下干燥12h，再經粉碎機粉碎，過40目篩后，得瑪咖粉。
[0042]2)準確稱取I g瑪咖粉(天平稱取1.0 g±0.01 g)于50 mL離心管中，加入30 mL乙醚后瓶蓋擰緊，置于多用途恒溫超聲波提取器中于40°C條件下超聲提取30 min(超聲處理時的參數條件為:工作時間1.5 S，間隙時間1.0 S，變幅桿Φ6，輸出功率50%)ο超聲完成后搖勾，然后2900Xg離心15 min，取上清。
[0043]3)將上清液倒入100 mL圓底燒瓶中，旋轉蒸干后加入5 mL乙醇，充分搖勻溶解提取物后吸取至容量瓶中，加入5 ml I mol/L氫氧化鈉溶液后，于30°C水浴加熱反應50 min。
[0044]4)將上步反應后的溶液蒸干后加入5 mL正己烷和30 mL純水，超聲溶解，萃取，過濾后取正己烷萃取層。
[0045]5)將上步收集的正己烷萃取層(瑪咖酰胺的總含量為23.21%)，用液相色譜法分離出瑪咖酰胺類單體化合物，芐基-十六烷酰胺純度達到97.34%，間甲氧基-芐基-亞麻酰胺和芐基-亞麻酰胺總純度為96.43%，間甲氧基-芐基-亞油酰胺和芐基-亞油酰胺總純度為97.85%o
[0046]圖1為按照《瑪咖干制品質量標準》中瑪咖酰胺提取方法得到的高效液相色譜圖，圖2為本實施例正己烷萃取層的高效液相色譜圖，樣品具有相同的處理方法和稀釋條件。
[0047]分別對圖1、圖2色譜圖中峰I?3通過質譜正離子模式，進行全掃描分析，檢測出峰I包含兩種分子離子([M+H] +，398.2759和368.2539);峰2也包含兩種分子離子([M+H] +，400.2996和370.2842)；峰3代表的是([M+H] +，346.2952)，分別對應著瑪咖中五種主要瑪咖酰胺類化合物，即間甲氧基-芐基-亞麻酰胺(397.60)，芐基-亞麻酰胺(367.57 )，間甲氧基-芐基-亞油酰胺(399.62)，芐基-亞油酰胺(369.59)和芐基-十六烷酰胺(345.57)。可見本發明方法可以提取出主要瑪咖酰胺類化合物。
[0048]經計算，圖1和圖2中瑪咖酰胺總含量分別為13.35%和23.21%，相對于《瑪咖干制品質量標準》中的提取方法，本發明方法所提取的樣品中瑪咖酰胺的相對含量上升了 73.9%，其中峰1、峰2，、峰3所對應的瑪咖酰胺單體化合物的含量分別增加2 O 3.9 %、171.8 %和167.0%。本方法所得到產物的脂肪酸等雜質含量減少，產品的純度高，瑪咖酰胺類化合物得率提尚O
[0049]實施例2
I)挑選健康的瑪咖鮮果洗凈，均勻的切片，置于鼓風干燥箱中，在40°C條件下干燥12h，再經粉碎機粉碎，過40目篩后，得瑪咖粉。
[0050]2)準確稱取I g瑪咖粉(天平稱取1.0 g±0.01 g)于50 mL離心管中，加入40 mL乙醚后瓶蓋擰緊，置于多用途恒溫超聲波提取器中于45°C條件下超聲提取25 min(超聲處理時的參數條件為:工作時間1.5 S，間隙時間1.0 S，變幅桿Φ6，輸出功率50%)ο超聲完成后搖勾，然后2900Xg離心18 min，取上清。
[0051 ] 3)將上清液倒入100 mL圓底燒瓶中，旋轉蒸干后加入6 mL甲醇，充分搖勻溶解提取物后吸取至容量瓶中，加入4 ml I mol/L氨水后，于25°C水浴加熱反應60 min。
[0052]4)將上步反應后的溶液蒸干后加入2 mL正己烷和20 mL的純水超聲溶解、萃取，過濾后取正己烷萃取層。
[0053]5)將上步收集的正己烷萃取層(瑪咖酰胺的總含量為18.04%)，用液相色譜法分離出瑪咖酰胺類單體化合物，芐基-十六烷酰胺純度達到96.38%，間甲氧基-芐基-亞麻酰胺和芐基-亞麻酰胺總純度為97.59%，間甲氧基-芐基-亞油酰胺和芐基-亞油酰胺總純度為98.81%。
[0054]實施例3
I)挑選健康的瑪咖鮮果洗凈，均勻的切片，置于鼓風干燥箱中，在30°C條件下干燥12h，再經粉碎機粉碎，過40目篩后，得瑪咖粉。
[0055]2)準確稱取I g瑪咖粉(天平稱取1.0 g±0.01 g)于50 mL離心管中，加入20 mL正己烷后瓶蓋擰緊，置于多用途恒溫超聲波提取器中于35°C條件下超聲提取35 min(超聲處理時的參數條件為:工作時間1.5 S，間隙時間1.0 s，變幅桿Φ6，輸出功率50%)。超聲完成后搖勻，然后2900 Xg離心12 min，取上清。
[0056]3)將上清液倒入100 mL圓底燒瓶中，旋轉蒸干后加入4 mL正丁醇，充分搖勻溶解提取物后吸取至容量瓶中，加入6 mL 0.5 mol/L碳酸銨溶液后，于50°C水浴加熱反應40
mino
[0057]4)將上步反應后的溶液蒸干后加入15 mL正己烷和30 mL的純水超聲溶解、萃取，過濾后取正己燒萃取層。
[0058]5)將上步收集的正己烷萃取層(瑪咖酰胺的總純度為18.08%)，用液相色譜法分離出瑪咖酰胺類單體化合物，其中芐基-十六烷酰胺純度達到97.48%，間甲氧基-芐基-亞麻酰胺和芐基-亞麻酰胺總純度為96.79%，間甲氧基-芐基-亞油酰胺和芐基-亞油酰胺總純度為97.83%o
[0059]實施例4
I)挑選健康的瑪咖鮮果洗凈，均勻的切片，置于鼓風干燥箱中，在40°C條件下干燥12h，再經粉碎機粉碎，過40目篩后，得瑪咖粉。
[0060]2)準確稱取I g瑪咖粉(天平稱取1.0 g±0.01 g)于50 mL離心管中，加入30 mL甲醇后瓶蓋擰緊，置于多用途恒溫超聲波提取器中于40 °(:條件下超聲提取30 min(超聲處理時的參數條件為:工作時間1.5 S，間隙時間1.0 S，變幅桿Φ6，輸出功率50%)ο超聲完成后搖勾，然后2900Xg離心15 min，取上清。
[0061 ] 3)將上清液倒入100 mL圓底燒瓶中，旋轉蒸干后加入5 mL乙醇，充分搖勻溶解提取物后吸取至容量瓶中，加入5 ml 1.5 mol/L氫氧化鈣溶液后，于30°C水浴加熱反應50min。
[0062]4)將上步反應后的溶液蒸干后加入5 mL正己烷和30 mL的純水超聲溶解、萃取，過濾后取正己烷萃取層。
[0063]5)將上步收集的正己烷萃取層(瑪咖酰胺的總純度為20.08%)，用液相色譜法分離出瑪咖酰胺類單體化合物，其中芐基-十六烷酰胺純度達到96.38%，間甲氧基-芐基-亞麻酰胺和芐基-亞麻酰胺總純度為97.71%，間甲氧基-芐基-亞油酰胺和芐基-亞油酰胺總純度為95.43%o
[0064]實施例5
I)挑選健康的瑪咖鮮果洗凈，均勻的切片，置于鼓風干燥箱中，在40°C條件下干燥12h，再經粉碎機粉碎，過40目篩后，得瑪咖粉。
[0065]2)準確稱取I g瑪咖粉(天平稱取1.0 g±0.01 g)于50 mL離心管中，加入30 mL石油醚后瓶蓋擰緊，置于多用途恒溫超聲波提取器中于40 °(:條件下超聲提取30 min(超聲處理時的參數條件為:工作時間1.5 S，間隙時間1.0 s，變幅桿Φ6，輸出功率50%)。超聲完成后搖勾，然后2900 Xg離心15 min，取上清。
[0066]3)將上清液倒入100 mL圓底燒瓶中，旋轉蒸干后加入5 mL乙醇，充分搖勻溶解提取物后吸取至容量瓶中，加入5 ml I mol/L氨水溶液后，于30°C水浴加熱反應50 min。
[0067]4)將上步反應后的溶液蒸干后加入5 mL正己烷和30 mL的純水超聲溶解、萃取，過濾后取正己烷萃取層。
[0068]5)將上步收集的正己烷萃取層(瑪咖酰胺的總純度為21.23%)，用液相色譜法分離出瑪咖酰胺類單體化合物，其中芐基-十六烷酰胺純度達到95.68%，間甲氧基-芐基-亞麻酰胺和芐基-亞麻酰胺總純度為95.61%，間甲氧基-芐基-亞油酰胺和芐基-亞油酰胺總純度為96.47%ο
[0069]實施例6
I)挑選健康的瑪咖鮮果洗凈，均勻的切片，置于鼓風干燥箱中，在40°C條件下干燥12h，再經粉碎機粉碎，過40目篩后，得瑪咖粉。
[0070]2)準確稱取I g瑪咖粉(天平稱取1.0 g±0.01 g)于50 mL離心管中，加入30 mL乙醇后瓶蓋擰緊，置于多用途恒溫超聲波提取器中于40 °(:條件下超聲提取30 min(超聲處理時的參數條件為:工作時間1.5 S，間隙時間1.0 S，變幅桿Φ6，輸出功率50%)ο超聲完成后搖勾，然后2900Xg離心15 min，取上清。
[0071]3)將上清液倒入100 mL圓底燒瓶中，旋轉蒸干后加入5 mL丙酮，充分搖勻溶解提取物后吸取至容量瓶中，加入5 ml 1.5 mol/L亞硫酸鈉溶液后，于30°C水浴加熱反應50min。
[0072]4)將上步反應后的溶液蒸干后加入5 mL正己烷和30 mL的純水超聲溶解、萃取，過濾后取正己烷萃取層。
[0073]5)將上步收集的正己烷萃取層(瑪咖酰胺的總純度為20.43%)，用液相色譜法分離出瑪咖酰胺類單體化合物，其中芐基-十六烷酰胺純度達到96.58%，間甲氧基-芐基-亞麻酰胺和芐基-亞麻酰胺總純度為96.633%，間甲氧基-芐基-亞油酰胺和芐基-亞油酰胺總純度為95.57%。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種提取瑪咖酰胺類化合物的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)取瑪咖鮮果或干果，切片后干燥，再粉碎得瑪咖粉； 2)將瑪咖粉與有機溶劑混合，超聲提取后，離心取上清液； 3)將上步所得上清液蒸干后，加入有機溶劑溶解，再加入堿性溶液進行反應； 4)將上步反應后的溶液蒸干，加入水和正己烷進行萃取，收集正己烷萃取層； 5)從上步收集的正己烷萃取層中分離出咖酰胺類單體化合物，即可。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中瑪咖粉與有機溶劑的用量比為Ig: (20~40)mLo3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟2)所述有機溶劑選自乙醇、正己烷、乙醚、甲醇、石油醚中的至少一種。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述超聲提取的溫度為35?45°C，時間為25?35 Hiin05.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述有機溶劑的體積用量為4?6mL每克瑪咖粉。6.根據權利要求1或5所述的方法，其特征在于，步驟3)所述有機溶劑選自乙醇、正己烷、乙醚、甲醇、石油醚、正丁醇、丙酮中的至少一種。7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述堿性溶液的濃度為0.5?1.5mol/L，體積用量為3~6 mL每克瑪咖粉。8.根據權利要求1或7所述的方法，其特征在于，步驟3)所述堿性溶液選自氫氧化鈉溶液、氨水、氫氧化I丐溶液、乙酸鈉溶液、亞硫酸鈉溶液、碳酸錢溶液中的至少一種。9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)所述反應為25?50°C水浴反應40?60min010.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟4)所述水和正己烷的體積用量與瑪咖粉的質量比為(10~30)mL:(l?20)mL:l g。
【文檔編號】C07C233/20GK105837462SQ201610270385
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】劉濤, 邵炎, 李蕓, 尹輝, 金小寶, 朱家勇
【申請人】廣東藥學院