蛋白質檢測用融合蛋白及蛋白質檢測方法
【專利摘要】一種蛋白質檢測用融合蛋白，其為使包含G蛋白的C1結構域、G蛋白的C2結構域及G蛋白的C3結構域中的至少一個蛋白質結構域與將大腸桿菌堿性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸殘基Asp置換成Gly且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的雙重突變體D153G/D330N、將大腸桿菌堿性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸殘基Asp置換成His且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的雙重突變體D153H/D330N、或將大腸桿菌堿性磷酸酶(BAP)的第328位的氨基酸殘基Lys置換成Arg且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的雙重突變體K328R/D330N融合而得的。
【專利說明】
蛋白質檢測用融合蛋白及蛋白質檢測方法
技術領域
[0001] 本發明涉及蛋白質檢測用融合蛋白及蛋白質檢測方法。
【背景技術】
[0002] 生物試樣中存在各種蛋白質，作為用于對特定蛋白質進行檢測、定量的方法，已知 有ELISA(Enzyme_Linked TmmunoSorbent Assay，酶聯免疫分析)等。
[0003] ELISA是使用酶標記抗體利用抗原抗體反應定量地檢測試樣中所含的抗原等特定 蛋白質的方法，是免疫檢查等中通用的方法之一。ELISA中，已知的是直接吸附法、三明治 法N克爭法等。
[0004] 例如，使針對吸附于固相表面的目標物質(抗原）的一抗通過抗原抗體反應進行結 合。洗去未反應的一抗后，添加帶有酶標記的標記二抗，再次通過抗原抗體反應進行結合。 在其中洗去未反應的標記二抗、添加顯色底物時，與抗原的量成比例地引起顯色反應。通過 吸光光度計等對所生成的顯色物質的吸光度進行測定，由使用已知濃度的標準品制作的標 準曲線能夠對抗原的量進行定量。
[0005] 但是，這樣的方法中，對于與目標物質(抗原)特異性結合的一抗，需要與其特異性 結合的標記二抗，在檢測多種目標物質(抗原）時，需要準備分別與多種一抗特異性結合的 標記二抗，通用性差。
[0006] 一直以來，作為蛋白質檢測用的酶，已知有堿性磷酸酶，其中，廣泛使用的是CIAP (Calf Intestine Alkaline Phosphatase，小牛腸堿性磷酸酶）XIAP是由牛的小腸純化而 得的，一直被廣泛地使用，近年來，通過基因重組而制作的CIAP也有售。但是，前者生產成本 高，難以保持穩定的品質。此外，后者的情況下，為了降低生產成本而用酵母等表達進行生 產，但是大多情況下發生糖鏈的過度附加、背景、粘性等問題。此外，CIAP雖然活性高，但穩 定性、特別是熱穩定性差，難以長期維持活性，無法用于需要加熱的基因相關應用。進而，稀 釋時其活性也會降低，因此在長時間、以低濃度使用的實際應用中，無法充分發揮其高活性 特性。
[0007] BAP(Bacterial Alkaline Phosphatase，細菌喊性磷酸酶)雖然穩定性高，但其活 性與CIAP相比僅為數十分之一左右，活性低，因此幾乎不被用于蛋白質檢測中。
[0008] 另一方面，存在如下方法:使用通過化學反應使堿性磷酸酶等酶和G蛋白結合而得 的酶標記G蛋白，來代替標記二抗。G蛋白是來自鏈球菌的細胞壁的蛋白質，具有與幾乎所有 哺乳動物的IgG發生結合的性質。若使用這樣的酶標記G蛋白，則能夠與多種免疫種（免疫 種)的一抗結合，即使在對多種目標物質(抗原)進行檢測的情況下，也可以不準備與各物質 分別特異性結合的抗體，通用性高。
[0009] 但是，使用用堿性磷酸酶等酶標記的酶標記G蛋白的方法存在檢測靈敏度低的問 題。此外，也存在熱穩定性差的種類，有時會在處理中失活。
[0010] 非專利文獻1記載了 ：制作使G蛋白（SpG)的Cl結構域結合于海螢熒光素酶的N末端 的融合蛋白，但沒有抗體結合能力，與在兩者間插入了連接子力一)GGGGS的蛋白結果 相同。
[0011] 非專利文獻2記載了 G蛋白的基因序列、氨基酸序列、結構、各結構域的功能等。
[0012] 非專利文獻3記載了對BAP的特定位置的氨基酸殘基進行了置換的雙重突變體、例 如D153G/D330N、D153H/D330N等，對活性、穩定性、最適pH、底物、金屬離子的親和性和活性 進行了考察。
[0013] 專利文獻1中記載了對BAP的特定位置的氨基酸殘基進行了置換的突變體D153G、 K328R及雙重突變體V99A/K328R，記載了用于三明治ELISA、競爭法等用途。
[0014]專利文獻2中記載了MP的第329位、第330位、第153位/第328位的突變體，并記載 了進行與抗原的融合蛋白的制作和競爭ELISA。
[0015] 專利文獻3中記載了K328R等BAP突變體，記載了與抗體進行化學結合進行ELISA。
[0016] 現有技術文獻 [0017]專利文獻
[0018] 專利文獻1:日本專利第3560972號公報 [0019] 專利文獻2:日本特開平9-098780號公報 [0020] 專利文獻3:日本專利第2620416號公報 [0021]非專利文獻
[0022] 非專利文南犬I:Engineering of functional chimeric protein G-Vargula luciferase,ANALYTICAL BIOCHEMISTRY,249(2),pp.147-152(1997)
[0023] 非專利文南犬 2 : Expression and purification of a truncated recombinant streptococcal protein G1Biochem J.,267(1),pp.171-177(1990)
[0024] 非專利文南犬3: Improving Escherichia coli Alkaline Phosphatase Efficacy by Additional Mutations inside and outside the Catalytic Pocket., Chembiochem.,2,pp.517-523,(2001)
【發明內容】
[0025] 發明要解決的課題
[0026] 本發明在于，提供一種通用性高、檢測靈敏度高、且穩定性高的蛋白質檢測用融合 蛋白及使用其的蛋白質檢測方法。
[0027]用于解決課題的手段
[0028] 本發明為一種蛋白質檢測用融合蛋白，其為使包含G蛋白的Cl結構域、G蛋白的C2 結構域及G蛋白的C3結構域中的至少一個的蛋白質結構域與將大腸桿菌堿性磷酸酶(BAP) 的第153位的氨基酸殘基Asp置換成Gly且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的雙重突 變體D153G/D330N、將大腸桿菌堿性磷酸酶(BAP)的第153位的氨基酸殘基Asp置換成His且 將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的雙重突變體D153H/D330N、或將大腸桿菌堿性磷酸 酶(BAP)的第328位的氨基酸殘基Lys置換成Arg且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的 雙重突變體K328R/D330N融合而成的。
[0029] 此外，前述蛋白質檢測用融合蛋白中，前述蛋白質結構域優選A蛋白的B結構域、G 蛋白的C2結構域及G蛋白的C3結構域結合而成的結構域。
[0030] 此外，本發明為一種蛋白質檢測方法，使前述蛋白質檢測用融合蛋白和對象物中 存在的蛋白質直接或間接結合，對所結合的前述蛋白質檢測用融合蛋白的堿性磷酸酶部分 作為標記部分進行檢測。
[0031] 發明效果
[0032] 本發明中，通過使包含G蛋白的Cl結構域、G蛋白的C2結構域及G蛋白的C3結構域中 的至少一個的蛋白質結構域與大腸桿菌堿性磷酸酶（BAP)的雙重突變體D153G/D330N、 D153H/D330N、或K328R/D330N融合，從而能夠提供一種通用性高、檢測靈敏度高、且穩定性 高的蛋白質檢測用融合蛋白及使用其的蛋白質檢測方法。
【附圖說明】
[0033] 圖1為表示本實施方式的蛋白質檢測用融合蛋白的一例的結構的示意圖。
[0034]圖2為表示實施例1中的、pG-D153G/D330N(pG結合位點：N末端）的表達量的圖 (2SLN培養基、以培養上清為3mL的規模進行培養、3個重復、箭頭表示pG-D153G/D330N的泳 動位置）。
[0035] 圖3為表示實施例1中的、pG-D153G/D330N(pG結合位點:N末端）的表達量的圖（TMN 培養基、以培養上清為3mL的規模進行培養、3個重復、箭頭表示pG-D153G/D330N的泳動位 置)。
[0036] 圖4為表示實施例1中的、pG-D153H/D330N(pG結合位點：N末端）的表達量的圖 (2SLN培養基、以培養上清為3mL的規模進行培養、3個重復、箭頭表示pG-D153H/D330N的泳 動位置）。
[0037] 圖5為表示實施例1中的、pG-D153H/D330N(pG結合位點:N末端）的表達量的圖（TMN 培養基、以培養上清為3mL的規模進行培養、3個重復、箭頭表示pG-D153H/D330N的泳動位 置)。
[0038] 圖6為表示實施例1中的、pG-K328R/D330N(pG結合位點：N末端）的表達量的圖 (2SLN培養基、以培養上清為3mL的規模進行培養、3個重復、箭頭表示pG-K328R/D330N的泳 動位置）。
[0039] 圖7為表示實施例1中的、pG-K328R/D330N(pG結合位點:N末端）的表達量的圖（TMN 培養基、以培養上清為3mL的規模進行培養、3個重復、箭頭表示pG-K328R/D330N的泳動位 置)。
[0040]圖8為表示實施例1中的、pG-K328R/D330N(pG結合位點：C末端）的表達量的圖 (2SLN培養基、以培養上清為3mL的規模進行培養、3個重復、箭頭表示pG-K328R/D330N的泳 動位置）。
[0041 ] 圖9為表示實施例1中的、pG-K328R/D330N(pG結合位點：C末端）的表達量的圖（TMN 培養基、以培養上清為3mL的規模進行培養、3個重復、箭頭表示pG-K328R/D330N的泳動位 置)。
[0042] 圖10為表示實施例2中的、利用Ni-NTA柱進行的表達蛋白（pG-D153G/D330N)的純 化的圖（載體:PBIC4、pBIC7、pBIC8、培養基:2SLN、箭頭表示pG-Dl53G/D330N的泳動位置）。 [0043] 圖11為表示實施例2中的、利用Ni-NTA柱進行的表達蛋白（pG-D153G/D330N)的純 化的圖（載體:PBIC4、pBIC7、pBIC8、培養基:TMN、箭頭表示pG-Dl53G/D330N的泳動位置）。 [0044] 圖12為表示實施例2中的、利用Ni-NTA柱進行的表達蛋白（pG-D153H/D330N)的純 化的圖（載體:PBIC7、pBIC8、培養基:2SLN、箭頭表示pG-Dl53H/D330N的泳動位置）。
[0045] 圖13為表示實施例2中的、利用Ni-NTA柱進行的表達蛋白（pG-D153H/D330N)的純 化的圖（載體:PBIC7、pBIC8、培養基:TMN、箭頭表示pG-Dl53H/D330N的泳動位置）。
[0046] 圖14為表示實施例2中的、利用Ni-NTA柱進行的表達蛋白（pG-K328R/D330N(pG結 合位點:N末端））的純化的圖（載體:pBIC4、pBIC8、培養基:2SLN、箭頭表示pG-K328R/D330N 的泳動位置）。
[0047] 圖15為表示實施例2中的、利用Ni-NTA柱進行的表達蛋白（pG-K328R/D330N(pG結 合位點:N末端））的純化的圖（載體:pBIC4、pBIC8、培養基:TMN、箭頭表示pG-K328R/D330N的 泳動位置）。
[0048] 圖16為表示實施例2中的、利用Ni-NTA柱進行的表達蛋白（pG-K328R/D330N(pG結 合位點：C末端））的純化的圖（載體:pBIC2、pBIC3、pBICl、培養基:2SLN、箭頭表示pG-K328R/ D330N的泳動位置）。
[0049] 圖17為表示實施例2中的、利用Ni-NTA柱進行的表達蛋白（pG-K328R/D330N(pG結 合位點：C末端））的純化的圖（載體:pBICl、pBIC3、培養基:TMN、箭頭表示pG-K328R/D330N的 泳動位置）。
[0050] 圖18為表示實施例3中的、PG-D153G/D330N及PG-D153H/D330N純化標準品（Fr. 1) 的ALP活性的圖（45°C下測定、圖中數值為9個重復測定的平均值土標準偏差）。
[0051 ] 圖19為表示實施例3中的、PG-K328R/D330N純化標準品（Fr. 1)的ALP活性的圖（45 °C下測定、圖中數值為9個重復測定的平均值土標準偏差）。
[0052]圖20為表示實施例3中的、pG-D153G/D330N(pG結合位點：N末端）的蛋白印跡結果 的圖。
[0053]圖21為表示實施例3中的、pG-D153H/D330N(pG結合位點：N末端）的蛋白印跡結果 的圖。
[0054]圖22為表示實施例3中的、pG-K328R/D330N(pG結合位點：N末端）的蛋白印跡結果 的圖。
[0055]圖23為表示實施例3中的、pG-K328R/D330N(pG結合位點：C末端）的蛋白印跡結果 的圖。
[0056] 圖24為表示pG-BAP突變體(D153G/D330N)的氨基酸序列的圖。
[0057] 圖25為表示pG-BAP突變體(D153H/D330N)的氨基酸序列的圖。
[0058]圖26為表示pG-BAP突變體(K328R/D330N(pG結合位點：N末端））的氨基酸序列的 圖。
[0059]圖27為表示pG-BAP突變體(K328R/D330N(pG結合位點：C末端））的氨基酸序列的 圖。
[0060] 圖28為表示PBIC載體圖譜的圖（在分泌信號的下游直接插入了目標基因。啟動子： 來自于橋石短芽孢桿菌(B. choshinensis)的P22、P2蛋白質基因的5 '序列、Rep:質粒自我復 制相關蛋白、Ori :質粒復制起點、Nmr:新霉素耐性基因）。
【具體實施方式】
[0061] 以下說明本發明的實施方式。本實施方式是用于實施本發明的一個例子，本發明 不受本實施方式限定。
[0062] 本實施方式的蛋白質檢測用融合蛋白是使包含G蛋白的Cl結構域、G蛋白的C2結構 域及G蛋白的C3結構域中的至少一個的蛋白質結構域與大腸桿菌堿性磷酸酶(BAP)的雙重 突變體 D153G/D330N、D153H/D330N、或 K328R/D330N 融合而成的。
[0063] 作為與檢測對象蛋白直接或間接結合的蛋白質結構域，本發明人等著眼于G蛋白。 G蛋白是來自于鏈球菌的細胞壁的蛋白，具有與幾乎所有哺乳動物的IgG發生結合的性質。 研究將該G蛋白用堿性磷酸酶標記后能否作為標記二抗等的替代物來利用。
[0064] 此外，作為與檢測靈敏度及穩定性有關的酶標記、即堿性磷酸酶，本發明人等著眼 于大腸桿菌堿性磷酸酶(BAP)的第153位或第328位的氨基酸殘基與活性有關、第330位的氨 基酸殘基與穩定性有關這一點，選出大腸桿菌堿性磷酸酶（BAP)的雙重突變體D153G/ D330N、D153H/D330N、及 K328R/D330NC3BAP 的雙重突變體 D153G/D330N 及 D153H/D330N 與此前 常用的CIAP相比穩定性高、與BAP(Wild type，野生型)相比活性高。
[0065] 這里，BAP的雙重突變體D153G/D330N是將MP的第153位的氨基酸殘基Asp置換成 Gly且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的突變體，D153H/D330N是將BAP的第153位的 氨基酸殘基Asp置換成His且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的突變體，K328R/D330N 是將BAP的第328位的氨基酸殘基Lys置換成Arg且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的 突變體。
[0066] 本發明人等進行了深入研究，發現通過使包含G蛋白的Cl結構域、G蛋白的C2結構 域及G蛋白的C3結構域中的至少一個的蛋白質結構域與MP的雙重突變體D153G/D330N、 D153H/D330N、或K328R/D330N融合，可獲得通用性高、檢測靈敏度高、且穩定性高的蛋白質 檢測用融合蛋白。
[0067] 作為蛋白質結構域，只要包含作為G蛋白的IgG結合結構域的Cl結構域、C2結構域 及C3結構域中的至少一個即可，沒有特別限制，從不易從抗體脫離等觀點出發，優選包含G 蛋白的C2結構域和G蛋白的C3結構域進行連結的結構域。此外，從G蛋白對抗體等的反應性 提高等觀點出發，優選包含A蛋白的E結構域、A蛋白的D結構域、A蛋白的A結構域、A蛋白的B 結構域、A蛋白的C結構域中的至少一個，更優選包含A蛋白的B結構域。特別優選A蛋白的B結 構域、G蛋白的C2結構域和G蛋白的C3結構域結合而成的結構域。
[0068] 既可以是使G蛋白的C2結構域與融合型堿性磷酸酶的C末端側融合而成的產物，也 可以是使其與N末端側融合而成的產物。從表達穩定性等觀點出發，優選使G蛋白的C2結構 域與融合型堿性磷酸酶的N末端側融合而成的產物。
[0069]本實施方式的蛋白質檢測用融合蛋白可以具有His標簽等標簽，所述His標簽是標 簽肽的一種，由6個左右的連續的組氨酸(Hi s)殘基構成。
[0070] 圖1示意性示出本實施方式的蛋白質檢測用融合蛋白的一個例子的結構。本實施 方式的蛋白質檢測用融合蛋白例如是：在MP的雙重突變體D153G/D330N、D153H/D330N、或 K328R/D330N的N末端側結合有A蛋白的B結構域、G蛋白的C2結構域及G蛋白的C3結構域、且 在BAP的雙重突變體的C末端側附加有His標簽的蛋白；在MP的雙重突變體D153G/D330N、 D153H/D330N、或K328R/D330N的C末端側結合有A蛋白的B結構域、G蛋白的C2結構域及G蛋白 的C3結構域、且在G蛋白結構域的C末端側附加有His標簽的蛋白。
[0071] 本實施方式的蛋白質檢測用融合蛋白可以通過基因工程手法、以使包含G蛋白的 Cl結構域、G蛋白的C2結構域及G蛋白的C3結構域中的至少一個的蛋白質結構域與BAP的雙 重突變體D153G/D330N、D153H/D330N、或K328R/D330N融合而成的融合蛋白形式來表達而獲 得。此外，此時還可以對G蛋白結構域或BAP的雙重突變體的N末端側或C末端側賦予His標簽 等標簽。
[0072]融合蛋白的純化可以利用附加于N末端或C末端的純化用肽標簽（例如，（His)6_ tag(六組氨酸標簽)）通過凝膠過濾色譜、固定化金屬離子親和色譜等來進行。
[0073] 融合蛋白的氣基酸序列的確認可以通過對編碼該蛋白的質粒載體的基因序列進 行DNA測序來進行確認。融合蛋白的純化的確認可以用SDS-PAGE等來進行。
[0074] 根據本實施方式的蛋白質檢測用融合蛋白，能夠對幾乎所有動物種類的一抗進行 檢測。本實施方式的蛋白質檢測用融合蛋白的檢測靈敏度比現有的標記G蛋白高、穩定性也 高。此外，檢測靈敏度與現有的標記二抗相同或更高，通用性高。若使用本實施方式的蛋白 質檢測用融合蛋白，則能夠與多種免疫種的（一次)抗體結合，可以不針對每個免疫種準備 二抗，通用性高。
[0075] 該蛋白質檢測用融合蛋白是來自于細菌的蛋白質，不存在翻譯后修飾的問題，可 以用微生物的表達體系進行制作。此外，若利用分泌表達體系，則能夠高效率地進行生產。 與對來自動物的蛋白進行提取、純化或用動物細胞對來自動物的蛋白進行表達、生產的情 況相比，能夠更廉價地進行制造。
[0076]來自于動物的CIAP等含有糖鏈。據稱，糖鏈是吸附于測定容器、膜等的原因之一， 有時會產生高背景。但是，BAP的雙重突變體由于不存在作為高背景的原因的糖鏈修飾，因 此不易產生在來自于動物的酶中可見的由背景及高粘性導致的操作問題等。
[0077]酶部分與BAP相比活性高，與CIAP相比穩定性優異，在高溫下也具有一定程度的耐 性，因此還可以用于必須進行溫度處理的基因檢測（雜交)等的靈敏度的提高中。此外，與現 有的pG-CIAP相比，能夠以高靈敏度檢測蛋白質。
[0078] <蛋白質檢測方法>
[0079] 本實施方式的蛋白質檢測方法是使前述蛋白質檢測用融合蛋白與存在于對象物 中的蛋白質直接或間接結合、對所結合的蛋白質檢測用融合蛋白的堿性磷酸酶部分作為標 記部分進行檢測的方法。
[0080] 本實施方式的蛋白質檢測用融合蛋白及蛋白質檢測方法可以用于例如蛋白印跡、 ELI SA、免疫沉降、免疫組化(免疫染色)等基礎研究領域、病理檢查領域等。
[0081 ] 實施例
[0082] 以下列舉實施例及比較例對本發明進行更具體、詳細的說明，但本發明不受以下 實施例限定。需要說明的是，下述實施例中，室溫是指20~25°C下feS。
[0083] [實施例1]
[0084] 在Brevibaci Ilus表達載體中插入pG-BAP突變體的基因片段，進行表達載體的構 建。完成了表達載體的構建后，實施轉化及規定時間的培養，將培養上清和菌體分離后，確 認培養上清中所含的目標蛋白的生產量。
[0085] <材料及試驗方法>
[0086] 1.表達載體(質粒）
[0087]使用了Brevibaci Ilus的分泌表達暗示各目標蛋白的最適的蛋白質合成速度及分 泌信號可能是不同的。因此，使用了將2種啟動子(pBICl、pBIC2、pBIC3、pBIC4:P22啟動子 (序列號9)、？8105、？8106、？8107、？8108:?2啟動子(序列號10))及4種的分泌信號（？81(：1、 PBIC5:序列號 ll、pBIC2、pBIC6:序列號 12、pBIC3、pBIC7:序列號 13、pBIC4、pBIC8:序列號 14)組合的共計8種表達用載體(參照圖28)。
[0088] 使用的載體:pBICl~pBIC8[HIGETA SYOYU有限公司提供]
[0089] 2.表達載體的構建
[0090]在 pG-BAP 突變體的基因片段（pG-D153G/D330N、pG-D153H/D330N 及 pG-K328R/ D330N)向表達用載體的插入中，利用了無需酶處理的簡便質粒構建法、即BIC法 (Brevibacillus In vivo Cloning) AIC法中，將在編碼目標蛋白的基因的兩端附加有與 直鏈狀表達載體的兩末端相同的15bp的序列的DNA與載體混合，導入感受態細胞。在菌體內 發生同源重組反應，形成表達質粒。對8種載體中的能夠構建載體、能夠獲得目標蛋白表達 用的載體的載體實施下述的表達試驗。
[0091] 3.分泌表達用宿主
[0092] 橋石短芽抱桿菌（Brevibacillus choshinensis)HPD31_SP3株[HIGETA SYOYU有 限公司提供]
[0093] 4 .Brevibac i Ilus 的轉化（DNA 導入）
[0094] 將短芽孢桿菌HPD31-SP3株用MT培養基（添加有20mM MgCl2的TM培養基（參照表 1))在37°C下振蕩培養至對數增殖期，通過離心分離收集菌體。然后，懸浮在50mM Tris-HCl (ρΗ7·5)中，通過離心分離收集菌體后，再懸浮于50mM Tris-HCl(pH8.5)，37°C下振蕩60分 鐘。對所振蕩的懸濁液500yL進行離心分離而收集菌體，加入2ngAiL的表達載體DNA溶液5yL 和0.5M NaS03/70mM磷酸緩沖液（pH6.3) 50yL的混合液，懸濁，靜置5分鐘后，添加40 % PEG6000/70mM磷酸緩沖液(pH6.3) 150yL，用渦旋混合器攪拌、懸濁。
[0095] [表1]
[0096] 表 1
[0098]~5.轉化體的篩選
[0099]對進行了轉化的菌體通過離心分離而收集菌體，懸浮于ImL的TM培養基，37 °C下振 蕩60分鐘。然后，涂抹于TMN(在TM培養基中添加有10yg/mL的新霉素的瓊脂培養基），37°C培 養30小時，對轉化體進行篩選。
[0100] 6.轉化體的培養
[0101] 將3mL的TMN培養基、及2SLN培養基(在2SL培養基(參照表2)中添加50yg/mL的新霉 素)分裝到直徑16mm的試管，接種前項中篩選出的單一菌落。在30°C、120rpm的條件下進行 48小時的振蕩培養。
[0102] [表 2]
[0103] 表2
[0105] 7.菌體和培養上清的分離
[0106] 進行離心分離(5000g、5分鐘）將菌體和培養上清分離。使培養上清通過0.22μπι的 過濾滅菌用過濾器，將菌體去除。
[0107] 8.表達確認
[0108]在培養上清中添加等量的2X樣品緩沖液，100°C下變性5分鐘后，供于SDS-PAGE， 進行了各樣品中的生產蛋白質的大小確認、及表達生產量的推定、比較。
[0109] 〈結果〉
[0110] 1.菌體內及培養上清中的表達確認
[0111] · pG-D153G/D330N(pG結合位點：N末端）
[0112] 對于pG-D153G/D330N，對2種載體及4種信號肽的共8種組合中能夠獲得表達質粒 的4種實施了表達試驗。在2SLN培養基(培養上清）的情況下，pBIC4、pBIC7及pBIC8可確認到 高水平的表達量，各個重復間也幾乎沒有差異，顯示其在進行穩定的表達。獲知:在TMN培養 基中，除了表達量比2SLN培養基多以外也為同樣的傾向，對于pBIC6而言，兩種培養基中都 幾乎不生產目標蛋白（圖2、3) 4G-D153G/D330N的氨基酸序列如圖24及序列號1所示，DNA序 列如序列號2所示。
[0113] · pG-D153H/D330N(pG結合位點：N末端）
[0114] 獲得了 5種表達載體的pG-D153H/D330N的情況下，在2SLN及TMN兩培養基中可見高 表達的是PBIC7及pBIC8,具有在TMN培養基中表達量多的傾向。也未確認到各個重復間的偏 差，因此暗示了顯示穩定的表達的可能性。在pBICl、pBIC5及pBIC6中，幾乎未確認到pG-D153H/D330N的表達（圖4、5) 46-015311/033(^的氨基酸序列示于圖25及序列號3，DNA序列 示于序列號4。
[0115] 需要說明的是，pG-D153G/D330N、pG-D153H/D330N兩者的表達量都多，由SDS-PAGE 的條帶強度可以期待g/L水平的生產量。
[0116] · pG-K328R/D330N(pG結合位點：N末端）
[0117] pG-K328R/D330N(pG結合位點：N末端）的情況下，獲得的4種表達載體中生產目標 蛋白的是PBIC4及pBIC8。任一者在各個重復間的偏差小、顯示出穩定的表達，從培養基種類 來看，可確認到PBIC8在TMN培養基中表達量相對地多的傾向（圖6、7) 結合位點:N末端)的氨基酸序列如圖26及序列號5所示，DNA序列如序列號6所示。
[0118] · pG-K328R/D330N(pG結合位點：C末端）
[0119] C末端結合有pG的K328R/D330N的情況下，所獲得的3種表達載體(pBICl、pBIC2、 PBIC3)的結果是:在2SLN培養基中各載體均確認到目標蛋白的生產，在TMN培養基中，pBIC2 的生產量顯著少。我們認為:將N末端結合有pG的情況與C末端結合有pG的情況相比，確認到 生產的表達載體在目標蛋白條帶強度方面沒有較大差異。但是，結合在C末端的表達載體在 3個重復的試驗中不能同等地生產，暗示與結合在N末端的表達載體相比蛋白質表達可能缺 乏穩定性（圖8、9)。?6-1(3281?/1)33(^(?6結合位點:C末端）的氨基酸序列如圖27及序列號7所 示，DNA序列如序列號8所示。
[0120] [實施例2]
[0121 ] 在用Brevi bacillus表達的BAP突變體中，如上所述組氨酸標簽(H6tag)附加在C 末端，可以用Ni-NTA柱比較簡便地進行純化。本實施例中，從培養上清獲得純化標準品。 [0122] <材料及試驗方法>
[0123] 1.目標蛋白的純化
[0124] 使用作為Ni-NTA柱的一種的His SpinTrap Kit(28-9321-71/GE Healthcare)進 行簡單純化。純化操作按照所附的處理說明書進行，使用300~600yL的培養上清，將柱結合 時的培養上清的咪唑濃度、以及結合(洗滌)緩沖液的咪唑濃度設為40mM、洗脫緩沖液的咪 唑濃度設為500mM。此外，將培養上清加到柱中后，進行3次洗滌，實施2次酶洗脫，將洗脫級 分分別設為級分l、2(Fr. l、Fr.2)。
[0125] 2.脫鹽及濃縮
[0126] 純化的突變體酶液含有高濃度的咪唑，進行了預討論，結果確認對酶活性有不良 影響，因此為除去咪唑而實施脫鹽、進行溶劑交換而交換為保存緩沖液(下述）。該操作中， 使用了凝膠過濾法（Zeba Desalt Spin Columns、89890/Thermo Scientific)、或超濾法 (Amicon Ultra Centrifugal Filters、IOK membrane、UFC501024/Millipore)。溶劑交換 后的純化標準品通過超濾（同上)而濃縮4~5倍左右，4°C下保存。
[0127] 保存緩沖液：IOOmM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、lmM MgCh、20yM ZnCl2
[0128] 3.純度確認及蛋白質定量
[0129] 獲得的純化標準品通過SDS-PAGE法確認了純度。凝膠使用了 Min i -PROTEAN (注冊 商標）TGX(商標）預制膠（456-1036/Bio-Rad)。電泳后的凝膠通過用純水洗滌、CBB染色 (Quick-CBB PLUS、178-00551/和光純藥)而使蛋白質條帶可視化。
[0130] 蛋白質定量通過Micro BCA法（BCA Protein Assay Reagent Kit、23227/Thermo Sc i ent i f i c)進行。將規定量的純化標準品和檢測試劑等量混合后，在60 °C下處理I小時，冷 卻，然后測定0D562。使用BSA(Bovine Serum Albumin)作為標準蛋白質制作標準曲線，求出 蛋白質含量。
[0131] < 結果 >
[0132] 1.利用Ni-NTA柱進行的純化
[0133] · pG-D153G/D330N(pG結合位點：N末端）
[0134] 對于表達試驗中表達量多的pG-D153G/D330N中的載體及培養基的組合，由培養上 清使用Ni-NTA柱進行了簡單純化（圖10、11)。供試的任一組合(？8扣4、？8扣7、？8108)的純化 級分中，雜蛋白均被幾乎完全除去，能夠獲得高純度的純化標準品。
[0135] · pG-D153H/D330N
[0136] 在pG-D153H/D330N的情況下，在2SLN培養基及TMN培養基兩者中，pBIC7及pBIC8的 組合也能夠純化出高純度的標準品。此外，純化標準品的分子量也與pG-Dl 53G/D330N為同 樣的結果(圖12、13)。
[0137] · pG-K328R/D330N(pG結合位點：N末端）
[0138] 使用2SLN培養基時，pBIC4能夠利用Ni-NTA柱進行純化，能夠獲得高純度的純化標 準品。但是，PBIC8的柱未結合級分中僅存在少量蛋白質，在此后的柱洗滌中也同樣。即使使 用具有高濃度咪唑的洗脫緩沖液也幾乎無法獲得，暗示蛋白質牢固吸附于Ni-NTA柱，可能 無法回收（圖14) ^MN培養基的情況下，pBIC4、pBIC8兩者都能夠純化出目標蛋白（圖15)。僅 僅在使用2SLN培養基的情況下pBIC8吸附于柱的原因目前尚未闡明。
[0139] · pG-K328R/D330N(pG結合位點：C末端）
[0140] 對于pG-K328R/D330N(pG結合位置:C末端）也同樣地對確認了蛋白質表達量的情 況實施了簡單純化（圖16、17) 2SLN培養基的情況下，pBICl、pBIC2及pBIC3能夠獲得純化標 準品，此外，TMN培養基的情況下，pBICl、pBIC3能夠獲得純化標準品。
[0141] [實施例3]
[0142] 對純化獲得的各標準品的酶部分、及抗體結合蛋白部分實際是否能發揮功能進行 了確認，為了研究能否用作蛋白質檢測試劑，以市售的試劑作為對照，實施了堿性磷酸酶 (ALP)活性測定和蛋白印跡中的檢測靈敏度的比較。
[0143] <材料及試驗方法>
[0144] I. ALP活性測定
[0145] 將酶標準品用酶稀釋緩沖液稀釋為規定濃度，在96孔微孔板的各孔中添加5yL。然 后，添加底物(P-NPP:對硝基苯磷酸鹽、149-02342/和光純藥)溶液95yL，使用酶標儀（SH-9000Lab/3 口于電氣）對底物的去磷酸化所引起的吸光度變化(0D410)每隔20~30sec測 定，測定18次。測定溫度設為45 °C。酶的比活性(μπιοI p-NP/mg protein/sec)利用已知濃度 的酶產物(P-NP:對硝基苯酚、299-58641/和光純藥）的標準曲線而求出。需要說明的是，酶 的稀釋及底物、酶產物的溶解、稀釋中使用了下述緩沖液，底物溶液的P-NPP濃度設為ImM。 作為比較對照，使用了用酵母表達的來自牛小腸的ALP即CIAP(AP highly active rec.EIA S，CR，03 535 452/Roche)、&PLAP(PlacentalAlkalinePhosphatase、P3895/Sigma)〇
[0146] 酶稀釋緩沖液：IOOmM DEA-HCl(ρΗ9· 5)、ImM MgCl2
[0147] 底物、酶產物稀釋、溶解緩沖液：1M DEA-HCl(pH9.5)、lmM MgCl2
[0148] 2.基于蛋白印跡的檢測靈敏度研究
[0149] 抗原使用了作為血清蛋白的來自于人的轉鐵蛋白（Calbiochem/616419)。用2X樣 品緩沖液制作了 I Ong~3pg/15yL的稀釋系列，每個泳道上樣15yL，進行SDS-PAGE。制作了轉 印有相同稀釋系列的轉鐵蛋白的Hybond P(PVDF)膜，進行抗原抗體反應后，對檢測靈敏度 進行了比較。詳細步驟以及比較對照中使用的試劑如以下所示。
[0150] 樣品緩沖液（2X ) :62.5mM 1^8-出：1(口!16.8)、2%505、25%甘油、0.01%8?8 (Bromophenol blue、029-02912/Wako)、10%疏基乙醇（M3148/Sigma)
[0151] SDS-PAGE (200V 恒定電壓條件、30min)
[0152] 凝膠:Mini-PROTEAN TGX凝膠 10% (Bio-Rad/456-1035)
[0153] 泳動緩沖液：25mM Tris-HCl(pH8.3)、192mM甘氨酸、0.1%SDS
[0154] 丄
[0155] 印跡(200mA恒定電流條件、40min)
[0156] 膜:Hybond P膜(GE醫療/RPN2020F)
[0157] 轉印緩沖液：25mM Tris-HCl(pH8.3)、192mM甘氨酸、20% 甲醇
[0158] 丄
[0159] 膜洗滌 〇83、311^11\2次）
[0160] TBS(20mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、2.68mM KC1)
[0161] 丄
[0162] 封閉（5%Skim Milk Powder(198-10605/Wako)/TBST、室溫、攪拌、60min)
[0163] TBST(0.1%Tween20/TBS)
[0164] 丄
[0165] 膜洗滌 〇831\511^11\3次）
[0166] 丄
[0167] -抗反應(室溫、攪拌、60min)
[0168] 抗體:兔抗人轉鐵蛋白抗體(DAK0/A0061 )1/2,000稀釋(4.3yg/mL TBST)
[0169] 丄
[0170] 膜洗滌（TBST、5minXM*)
[0171] 丄
[0172] pG-堿性磷酸酶反應(室溫、攪拌、60min)
[0173] pG-ΒΑΡ突變體純化標準品使用Fr. 1
[0174] 處理濃度：0.5yg/mL TBST
[0175] I
[0176] 膜洗滌(TBST、5minXM*)
[0177] I
[0178] 發光檢測
[0179] 每隔150秒獲得圖像，直至7，200秒為止。
[0180] 測定器:ChemiDoc XRS+(170-8265JlPC/Bi〇-Rad)
[0181] 發光底物：CDP-Star Ready-t〇-use(Roche/l2〇4l677〇01)
[0182] 比較對照試劑
[0183] pG_CIAP(Protein G Alkaline Phosphatase Conjugated、PGO〇-〇5/Rockland)
[0184] < 結果 >
[0185] I .ALP活性
[0186] 圖18示出pG-D153G/D330N及pG-D153H/D330N(pG結合位置均為N末端）的ALP活性 測定結果。測定值的偏差稍大，但PG-D153G/D330N的比活性為350~450ymol p-NP/mg prot./min，存在TMN培養基情況下比活性較高的傾向。
[0187] 另一方面，pG_D153H/D330N的比活性為50μηιο1 p-NP/mg prot./min左右，與pG-D153G/D330N相比，該值是顯著低的。
[0188] 圖19示出pG-K328R/D330N(pG結合位點：N末端及C末端）的活性測定結果。雖然確 認到N末端結合時活性值的大小，但N末端、C末端的情況下其比活性均為2 0 0μπι〇 I /mg protein/min左右，我們認為兩者間沒有大差異。
[0189] 由以上結果可知，所制作的pG-ΒΑΡ突變體的ALP活性從高到低分別為：
[0190] pG-D153G/D330N>pG-K328R/D330N>pG-D153H/D330N
[0191 ] 2.基于蛋白印跡的檢測靈敏度
[0192] 使用純化標準品（Fr. 1)進行蛋白印跡并進行了發光檢測，結果如圖20~23所示。 PG-D153G/D330N除了pBIC8(2SLN培養基）以外均能夠檢測3~IOpg的轉鐵蛋白。作為對照的 pG-CIAP為IOOpg左右，因此暗示了 pG-D153G/D330N的檢測靈敏度可能高10~30倍（圖20)。 另一方面，PG-D153H/D330N的檢測靈敏度為30~100pg，與市售的pG-CIAP沒有大差異，可認 為其低酶活性被反映到檢測靈敏度中（圖21) 4G-K328R/D330N的情況下，比pG-D153G/ D330N稍差，但N末端結合有pG、C末端結合有pG的情況下檢測靈敏度均為IOpg左右，暗示可 能比作為對照的pG-CIAP高10倍左右（圖22、23)。
[0193] 基于以上結果可知，由Brevi bacillus分泌表達的目標蛋白保持了抗體結合活 性、ALP活性。此外獲知，在蛋白印跡這一實際應用中，此次供試的pG-D153G/D330N及pG-K328R/D330N與市售的現有產品相比顯示出高檢測靈敏度，作為蛋白質檢測試劑是有用的。
[0194] 在K328R/D330N的情況下，無論是N末端還是C末端結合，在ALP活性、蛋白印跡兩者 中都幾乎沒有性能差異。
[0195] 在D153G/D330N、D153H/D330N的情況下，僅研究了pG的結合位點為N末端的情況， 但這些變異位點為磷酸、Mg 2+及Zn2+的結合位點附近，即使是pG的結合位點為C末端而使立 體結構改變，也不會妨礙PG的抗體結合活性，在性能方面獲得同等結果的可能性高。
[0196] 在K328R/D330N的情況下，表達生產的穩定性方面是N末端的情況更為優異。我們 認為，原因之一是C末端結合有pG時載體難以在宿主內穩定地保持。
【主權項】
1. 一種蛋白質檢測用融合蛋白，其特征在于，是使包含G蛋白的Cl結構域、G蛋白的C2結 構域及G蛋白的C3結構域中的至少一個蛋白質結構域與雙重突變體D153G/D330N、雙重突變 體D153H/D330N、或雙重突變體K328R/D330N融合而成的， 所述雙重突變體D153G/D330N為將大腸桿菌堿性磷酸酶BAP的第153位的氨基酸殘基 Asp置換成Gly、且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的雙重突變體， 所述雙重突變體D153H/D330N為將大腸桿菌堿性磷酸酶BAP的第153位的氨基酸殘基 Asp置換成His、且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的雙重突變體， 所述雙重突變體K328R/D330N為將大腸桿菌堿性磷酸酶BAP的第328位的氨基酸殘基 Lys置換成Arg、且將第330位的氨基酸殘基Asp置換成Asn的雙重突變體。2. 根據權利要求1所述的蛋白質檢測用融合蛋白，其特征在于， 所述蛋白質結構域是A蛋白的B結構域、G蛋白的C2結構域和G蛋白的C3結構域結合而成 的。3. -種蛋白質檢測方法，其特征在于， 使權利要求1或2所述的蛋白質檢測用融合蛋白與對象物中存在的蛋白質直接或間接 結合，對所結合的所述蛋白質檢測用融合蛋白的堿性磷酸酶部分作為標記部分進行檢測。
【文檔編號】G01N33/68GK105829348SQ201480056879
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年10月6日
【發明人】神谷典穗, 松葉恭, 松葉恭一, 永井賢治, 林浩之輔
【申請人】國立大學法人九州大學, 株式會社日立制作所