α-螺旋細胞穿透肽多聚體、其產生方法及其用圖
【專利摘要】本發明涉及α?螺旋細胞穿透肽多聚體，其制備方法及其用途，且具體地，涉及包含多個兩向肽的肽多聚體，用于制備所述肽多聚體的方法，包含所述肽多聚體作為有效成分的用于預防或治療HIV的組合物和包含所述肽多聚體和生物活性物質的用于將所述活性物質遞送入細胞的組合物。
【專利說明】
α-螺旋細胞穿透肽多聚體、其產生方法及其用途
技術領域
[0001] 本發明涉及Ct-螺旋細胞穿透肽多聚體，其制備方法及其用途，且更具體地，涉及包 含多個兩性肽的肽多聚體，用于制備所述肽多聚體的方法、包含所述肽多聚體作為活性成 分用于預防或治療HIV的組合物和包含所述肽多聚體和生物活性物質用于細胞內遞送所述 生物活性物質的組合物。
【背景技術】
[0002] 抗微生物肽(AMP)是從宿主的原發免疫反應產生以保護宿主免于外部入侵的病原 體的天然肽。其主要損傷入侵病原體的細胞膜由此控制入侵的病原體。然而，一些證據最近 表明此類抗微生物肽可通過抗微生物肽損傷細胞膜的機制之外的機制控制入侵的病原體。 也就是說，這些抗微生物肽可通過結合于病原體中它們的靶標來控制細菌以阻斷病原體的 功能。一般地，抗微生物肽攜帶與DNA或DNA的負電荷結合的正電荷，表明病原體的DNA或RNA 具有作為靶標的潛力。已顯示其中抗微生物肽穿透線粒體(其為病原體中的細胞器)以誘導 細胞死亡由此控制病原體的機制也是可能的。這是因為線粒體的表面帶有負離子。
[0003] 如上文表明，抗微生物肽不通過破壞病原體的膜殺傷病原體，而可通過與細胞中 的其他靶標結合來殺傷病原體。這也可通過如下事實來證明：具有穿透細胞的能力的細胞 穿透肽(CPP)區別于能夠殺傷病原體的抗微生物肽。天然存在的細胞穿透肽主要在病毒中 發現。由于其應使用宿主細胞的全部功能用于病毒生存，因此這些肽為具有細胞穿透能力 而非細胞殺傷能力的肽。其典型的實例包括TAT肽、Rev肽等，其幫助病毒穿透細胞而不殺傷 宿主。源自觸角蛋白（Antennapedia protein)的穿透肽是包含16個氨基酸且具有優異的細 胞穿透能力的典型細胞穿透肽（韓國專利No. 1095841)。與抗微生物肽相似，所述穿透肽具 有的特性為其富集帶正電的精氨酸/賴氨酸(圖1)。
[0004] 細胞穿透肽氨基酸組成最獨特的特性在于其富集了堿性氨基酸如精氨酸和賴氨 酸。由于包含由酰胺鍵連接的7或9個連續精氨酸殘基的肽也用作細胞穿透肽，這些正電荷 對于帶負電荷的細胞表面的識別是必需的。此外，出于盡管攜帶相同的正電荷，但精氨酸殘 基比賴氨酸殘基更豐富的事實，可以看出胍基相比簡單的氨基是更容易處理負電荷的官能 團。
[0005] 這樣的細胞穿透肽應具有低于抗微生物肽的理論上可忽略的細胞毒性。由于這種 細胞穿透肽的低細胞毒性，研究了可將多種物質(其需要細胞內遞送)與細胞穿透肽連接以 將這些物質引入細胞的方法。寡核苷酸如DNA或RNAi或能夠導致生物改變或細胞毒性的化 合物(抗癌藥)或特異性蛋白也可用作與細胞穿透肽連接并導入細胞的負載(圖2)。
[0006] 細胞穿透肽穿透細胞的機制主要分為兩種方法，其中之一是涉及需要熱量的胞吞 作用和直接穿透的方法。已知所述機制取決于每種細胞穿透肽的特征而變化或使用兩種方 法的組合使細胞穿透肽進入細胞。
[0007] 可出現的是具有細胞穿透能力同時不具有細胞毒性的細胞穿透肽不能夠獲得，因 為細胞穿透能力和無細胞毒性是矛盾的條件。由于此事實，多種細胞穿透肽還具有抗微生 物肽的特征。盡管細胞穿透肽是具有最大化的進入細胞的能力而不損傷細胞的肽，但細胞 膜可由于這些細胞穿透肽破裂，且帶正電的細胞穿透肽可與帶負電的細胞內物質如DNA或 RNA相遇，由此引起細胞毒性。
[0008] 細胞穿透肽的形態學特性與抗微生物肽的那些相似。為穿透細胞膜，細胞穿透肽 應具有帶正電荷的親水性基團以識別帶負電的細胞膜，且還應能夠在膜條件中形成α-螺旋 形狀同時識別存在于細胞膜中的疏水性分子。由于這些原因，細胞穿透肽和抗微生物肽應 具有兩性(疏水性和親水性)特征。因此，許多細胞穿透肽是α_螺旋肽，其典型實例為α-螺旋 細胞穿透肽如穿膜肽(penetratin)和HIV Tat。然而，即使當這些肽在最低可能濃度(微摩 爾級）使用時也可顯示合意的細胞穿透效果，且因此需要開發即使以納摩爾濃度使用時也 顯示合意的細胞穿透能力的肽。
[0009] 在此背景下，本發明人已發現，當包含親水性和疏水性氨基酸的兩性肽在一個或 多個特定的氨基酸位置含有接頭時，肽的細胞穿透能力可顯著增加，由此完成本發明。
【發明內容】
[0010] 技術問題
[0011] 本發明的目的是提供可有效遞送入細胞同時在細胞中顯示減少的細胞毒性的包 含α-螺旋細胞穿透兩性肽的肽多聚體、其制備方法和其用于預防或治療HIV及細胞內遞送 生物活性物質的用途。
[0012]技術方案
[0013] 為實現上述目的，本發明提供包含多個同質或異質α-螺旋兩性肽的肽多聚體。
[0014] 本發明還提供用于制備肽多聚體的方法，其包括下列步驟：
[0015] 構建包含親水性和疏水性氨基酸的α-螺旋肽；
[0016] 選擇多種同質或異質的α-螺旋肽;和
[0017]在選自下組的一個或多個氨基酸位置連接多個所選的α-螺旋肽:i、i+3、i+4、i+7、 1+8、1+10和1+11(其中1是整數）。
[0018] 本發明還提供用于預防或治療HIV的組合物，其包含上述α-螺旋肽多聚體作為活 性成分。
[0019] 本發明還提供用于細胞內遞送生物活性物質的組合物，其包含權利要求1-I8任一 項的肽多聚體及所述生物活性物質。
[0020] 附圖簡述
[0021] 圖1是包含多個精氨酸或賴氨酸殘基的已知細胞穿透肽的列表。
[0022]圖2是顯示將細胞穿透肽遞送入細胞的機制的示意圖。
[0023]圖3顯示根據本發明實施方案的兩性α-螺旋肽單體或二聚體。
[0024]圖4顯示根據本發明實施方案的肽的細胞穿透能力的分析結果。每個誤差條代表 標準偏差(η = 3)，且***和n.s.分別指示ρ〈0.001和與對照無顯著差異。
[0025]圖4a顯示與HeLa細胞溫育12小時后LK-I(A)、LK-2( )、LK-3(·)、LK-4(.)和R9 (▼)在不同肽濃度的FACS結果。
[0026] 圖4b顯示用FITC-標記的LK-3(10nM)處理的HeLa細胞的CLSM(共聚焦激光掃描顯 微術)圖像，其中將核用Hoechst 33442(藍色)染色；
[0027]圖4c顯示在IOnM的胞吞作用抑制條件下根據本發明的肽的相對細胞穿透能力； [0028]圖4d顯示在500nM的胞吞作用抑制條件下根據本發明的肽的相對細胞穿透能力-對照（白色）、渥曼青霉素(wortmannin)(灰色）、阿米洛利(amiloride)(深灰色）和4°C (黑 色)；
[0029] 圖5顯示使用根據本發明實施方案的肽測量遞送入細胞的RNAi量的結果。
[0030] 圖6顯示指示根據本發明實施方案的肽的細胞內遞送機制的共聚焦顯微術照片 (圖6中的Ac意為乙酰基）。
[0031] 圖6a顯示500nM FITC(異硫氰酸熒光素)-標記的單體肽(37°C，24小時）（左側）和 用50yg/mL渥曼青霉素處理的500nM FITC-標記的單體肽(37°C，24小時）（右側）；
[0032] 圖6b顯示500nM Ac-FITC二聚體(37°C，24小時）（左側）和使用50yg/mL渥曼青霉素 處理的500nM Ao-FITC二聚體(37°C，24小時）（右側）；
[0033] 圖6c顯示用15yg/mL阿米洛利處理的500nM FITC-標記的單體肽（37°C，24小時） (左側)和500nM FITC單體肽(4°C，2小時）（右側）；
[0034] 圖6d顯示用15yg/mL阿米洛利處理的500nM Ac-FITC二聚體肽（37°C，24小時）（左 偵U)和500nM Ac-FITC二聚體肽(4°C，2小時）（右側）；
[0035] 圖6e顯示500nM Ac-dimal-FITC二聚體肽（37°C，24小時）（左側）和使用50yg/mL渥 曼青霉素處理的500nM Ac-dimal-FITC二聚體肽(37°C，24小時）（右側）；
[0036] 圖6f顯示用15yg/mL阿米洛利處理的500nM Ac-dimal-FITC二聚體肽（37°C，24小 時）（左側)和500nM Ac-dimal-FITC二聚體肽(4°C，2小時）（右側）。
[0037] 圖7顯示根據本發明實施方案的肽的細胞毒性測試結果。
[0038]圖8顯示在HeLa細胞中以IOnM和IOOnM肽濃度通過根據本發明的肽的Tat-介導的 轉錄延伸的抑制-對照（白色）、IOnM(灰色)和100nM(深灰色）：
[0039] a)TAR-luc/0-肌動蛋白的相對mRNA表達；
[0040] b)TAR-luc/18S rRNA的相對mRNA表達；
[0041 ] c)TAR-luc/TAR 的相對 mRNA 表達。
[0042] 每個誤差條代表標準偏差(n = 3)，且(*)、（**)、（***)和n. s ·分別為0·01 < p〈0 · 1、 0 · 001 < p〈0 · 01、p〈0 · 001和與對照無顯著差異。
[0043]圖9顯示在HeLa細胞中通過根據本發明的肽的熒光素酶活性的抑制且圖9中的每 個誤差條代表標準偏差(n = 3):
[0044] a)通過LK-I抑制的熒光素酶活性；
[0045] b)通過LK-2抑制的熒光素酶活性；
[0046] c)通過LK-3抑制的熒光素酶活性；
[0047] d)通過LK-4抑制的熒光素酶活性。
[0048] 圖10顯示在RAW 264.7細胞中測量LK肽IC5q值的結果。
[0049] 圖 11顯不在T-類淋巴母細胞(T-lymphoblastoid cells)(M0LT-4/CCR5)中通過根 據本發明的肽的HIV-I p24抗原產生的抑制，且圖11中的每個誤差條代表標準偏差(n = 3):
[0050] a)通過LK-3的HIV-I p24抗原產生的抑制；
[0051 ] b)通過LK-4的HIV-I p24抗原產生的抑制。
[0052]圖12顯示通過MTT測定法分析肽的細胞毒性的結果：
[0053] a)HeLa 細胞；
[0054] b)RAW 264.7細胞。
[0055] 圖13顯示實施LDH測定法以分析肽去穩定化細胞膜的程度的結果：
[0056] a)HeLa 細胞；
[0057] b)RAW 264.7細胞。
[0058]圖14顯示根據pTat的表達水平檢查LK肽抑制能力的減少的結果。
[0059]圖15顯示通過HPLC測量二聚體D肽和單體D肽的穩定性的結果：a)25%人血清/ RPMI 1640中的20M二硫化物二聚體D; b) 25 %人血清/RPMI1640中20M的肽2。
[0060] 圖16顯示通過HPLC測量LK-4肽的穩定性的結果：25%人血清/RPMI1640中20M的 LK-4〇
[0061 ]圖17顯示在0.5mM GSH存在下（其為體內還原條件)通過HPLC的肽二聚體D和扭結D 的穩定性:a)0.5mM還原形式的谷胱甘肽/RPMI 1640中20M的二硫化物二聚體還 原形式的谷胱甘肽/RPMI 1640中20M的扭結肽。藍色（I)，0小時;紅色(2)，5小時;紅色(2)，5 小時;粉色(4)，15小時。
[0062]圖18顯示測量以平行或反向平行的方式連接的肽二聚體溶血活性的結果。
[0063]圖19顯示其中LK二聚體中一些Leu殘基用Ala取代的結構的螺旋輪圖。
[0064]圖20顯示圖19中所示的二聚體的細胞穿透能力的結果。
[0065]圖21是顯示具有Lys至Glu取代(K2，K4-E2，E4)的肽結構的螺旋輪圖。
[0066]圖22顯示測量圖21的肽對于HeLa細胞的細胞穿透能力的結果。
[0067]圖23顯示測量通常包含SEQ ID NO: 1的肽對于HeLa細胞的細胞穿透能力的結果。 [0068]圖24顯示具有不同長度的肽對于HeLa細胞的細胞穿透能力的結果。
[0069]用于實施本發明的最佳方式
[0070] -方面，本發明涉及包含多種同質性或異質性α-螺旋兩性肽的肽多聚體。
[0071] 本發明的肽可為新型細胞穿透肽，其形狀在細胞內遞送之前和之后變化，且因此 可具有優異的細胞穿透能力同時在細胞中展示減少的細胞毒性。為此，使用了能夠最大地 擴增細胞穿透肽中存在的α-螺旋形狀的方法和使用特殊細胞質環境使得此α-螺旋可在細 胞質中容易消失的方法。
[0072] 通過本發明，開發了其中合成具有人工增加的α-螺旋含量的肽的方法。當用合成 的肽處理細胞時，肽的細胞內穿透能力將由于高α-螺旋含量而增加，且α-螺旋將在細胞中 去除以最小化肽的毒性。
[0073] 常規的細胞穿透肽在這方面存在問題，由于它們具有與抗微生物肽相似的結構特 性，當它們穿透細胞時，它們與其細胞內靶標結合以引起細胞毒性。這是由于在通過細胞膜 前細胞穿透肽的形狀與它們穿透入細胞后的形狀相似。因此，本發明人提供了在穿透入細 胞之前和之后形狀可極大改變的肽。
[0074]甚至在大多數的情況中α-螺旋肽在100%水溶液中維持低α-螺旋含量，且大多數 肽在水性細胞質中具有50%或更少的低α-螺旋含量。根據本發明的兩性肽或包含所述肽的 二聚體在細胞外環境中維持高α-螺旋含量，但所述肽結構可在細胞外和細胞內環境中在其 中高α-螺旋含量在細胞質中被破壞的條件下變化。也就是說，可生成打開-關閉開關，其中 螺旋開關在細胞外環境或細胞膜中關閉并在細胞質中打開。在這種情況中，可歸因于肽 的α-螺旋的多種細胞毒性可在細胞質中最小化。如果肽具有高α-螺旋含量，則其將不會由 多種肽酶降解，但將生成隨機的形狀同時以螺旋形狀平衡，且具有隨機形狀的肽將容易 地由多種肽酶的作用降解，且因此其細胞毒性可被最小化。因此，當螺旋含量在細胞外環 境中最大化以最大化細胞穿透能力且在細胞質中去除時，歸因于螺旋的細胞毒性可被最 小化。滿足這些條件的肽作為細胞穿透肽是最適合的。
[0075] 作為用于增加細胞穿透能力的方法，可增加兩性肽的α-螺旋含量。可使用如下方 法，其中α-螺旋含量通過共價鍵合α-螺旋的上部和下部分支而急劇增加，且通過該方法，還 可增加肽的細胞穿透能力。考慮到這一點，為增加 α-螺旋含量，多種兩性肽可具有位于選自 下組的一個或多個氨基酸位置的接頭:例如1、1+3、1+4、1+7、1+8、1 + 10和1 + 11(其中1是整 數）。該接頭可優選位于選自下組的兩個或多個氨基酸位置:i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+l(^Pi+ 11(其中i是整數）。此處，多個兩性肽可彼此平行連接同時維持N-末端至C-末端方向。可替 換地，多個肽的一部分可以N-末端至C-末端方向連接，且其他部分可以反向平行方式以C-末端至N-末端方向連接。顯示通過平行或反向平行方式連接肽獲得的肽多聚體顯示相同的 活性(圖18)。通過包含此接頭的肽多聚體，可維持α-螺旋含量。
[0076] 與此相關的是，韓國專利公開(Laid-Open Publication)No.2013-0057012和美國 國專利公開No. 2010-0292164公開了使用二硫鍵以在兩個肽之間連接。然而，沒有如本發明 所述的實例，其中α-螺旋含量通過將接頭定位于兩個或多個氨基酸位置以制備多聚體。根 據本發明的肽多聚體中肽的螺旋含量在細胞穿透前(例如在其中三氟乙醇和緩沖劑以1: 1比率混合的細胞膜條件中）可為80%，優選至少85%，更優選多至100%。
[0077] 在一個實施方案中，肽的氨基酸并無具體限制，只要其能夠維持α-螺旋結構同時 顯示兩性特征。例如，親水性氨基酸可以是選自下組的一個或多個:精氨酸、賴氨酸和組氨 酸，且疏水性氨基酸可以是選自下組的一個或多個:亮氨酸、纈氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪 氨酸和異亮氨酸。
[0078]所述肽可包含例如5-50個氨基酸，優選10-60個氨基酸，更優選7-23個氨基酸，其 可形成作為穩定的二級結構的α-螺旋結構。可見，根據本發明的肽依賴于其長度顯示細胞 穿透能力。例如，可見包含少于7個氨基酸的肽顯示顯著增加的穿透能力，甚至在納摩爾濃 度，且具體地，包含16-23個氨基酸的肽在IOnM或更低的濃度都顯示細胞穿透能力（圖24)。
[0079] 為將親水性氨基酸的氨基收集至α-螺旋的一側，可將1-3個親水性氨基酸交替排 列，且其余序列可包含1-3個交替排列的疏水性氨基酸。例如，1-3個親水性氨基酸可與1-3 個疏水性氨基酸交替排列，且因此所述兩性肽可包含7氨基酸序列，其中兩性肽的i+3和i+4 位置的至少一個具有與i位置的氨基酸有相同極性的氨基酸。優選地，所述兩性肽可包含一 個或多個7氨基酸序列，其中一個或兩個親水性氨基酸與一個或兩個疏水性氨基酸交替排 列。此處，如果i是親水性氨基酸，則i+3和i+4位置的至少一個應為親水性氨基酸，且如果i 是親水性氨基酸，則i+3和i+4位置的至少一個應為疏水性氨基酸。
[0080] 上述具有7氨基酸的序列可包含例如由下式所示的一個或多個氨基酸序列：
[0081 ] XYXXYYX YXYYXXY XYYXYYX yxxyxxy xyyxxyx YXXYYXY xyyxxyy YXXYYXX
[0082] ΧΧΥΧΧΥΥ yyxyyxx xxyyxyy YYXXYXX XXYYXXY YYXXYYX
[0083] 其中X是親水性氨基酸且Y是疏水性氨基酸。
[0084] 本文中，兩性肽可以25%或更多的量包含能夠展示最高疏水性的疏水性氨基酸， 例如選自下組的一個或多個殘基:亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和異亮氨酸， 且所述肽可通過由這些疏水性氨基酸形成的疏水性穿透細胞。本發明人使用丙氨酸(A)取 代疏水性氨基酸亮氨酸(L)，且作為結果發現如果疏水性氨基酸不以25%或更多的疏水性 氨基酸定位，則所述肽不顯示合意的細胞穿透效果（圖19和20)。
[0085] 此外，兩性肽可以33%或更多的量包含選自下組的一個或多個帶正電的親水性氨 基酸殘基:精氨酸、賴氨酸和組氨酸。如果所述兩性肽以33%或更多的量包含帶正電的親水 性氨基酸，則其可通常確保合意的細胞穿透能力。以少于33%的量(親水性氨基酸的約1/3) 包含帶正電的親水性氨基酸的肽(其中帶正電的氨基酸用至少兩個帶負電的氨基酸取代） 甚至在IyM的高濃度很難穿透細胞，因為其不確保凈電荷對于細胞穿透是足夠的。本發明人 發現，當帶正電的賴氨酸(K)殘基中的賴氨酸(K)殘基1和3用谷氨酸(E)取代時，以33%或更 少的量包含帶正電的親水性氨基酸的肽不顯示合意的細胞穿透效果，甚至在IOOnM的濃度， 但當將肽制備為二聚體時，細胞穿透能力可增加約100倍(圖21和22)。
[0086]在一個實施方案中，兩性肽可包含由下列SEQ ID NO: 11所不的序列：
[0087] KLLKLLK(SEQ ID NO:11)。
[0088] 本文中，（LK)n的氨基酸可額外地結合于SEQ ID NO: 11的序列的右端，且(LK)m的 氨基酸可額外地結合SEQ ID NO: 11的序列的左端，其中η和m可各自獨立地為0-2的整數。具 體地，兩性肽可以是由SEQIDN0:12所示的氨基酸序列LKKLLKLLKKLLKL或由SEQIDN0:13 所示的氨基酸序列KLLKLLKKLLKLLK。
[0089]接頭可包含在肽之間連接的任何鍵從而顯示根據本發明的合意的特性。例如，接 頭可包含共價鍵。共價鍵無具體限制，只要其為可增加 α-螺旋含量而不抑制肽的功能的共 價鍵。例如，所述共價鍵可為選自下組的一個或多個:半胱氨酸之間的二硫鍵/二硫骨、馬來 酰亞胺鍵、酯鍵、硫醚鍵和由點擊反應(click reaction)形成的鍵。
[0090] 為保持肽的穩定的α-螺旋，嘗試了使用共價鍵將肽的i位置與i+3、i+4、i+7、i+8、i + 10或i + 11位置鍵合，且多種類型的接頭化合物可用于鍵合。然而，盡管可使用這些接頭化 合物增加 α-螺旋含量，所述接頭化合物和肽由于它們形成更穩定的鍵而具有它們在正常細 胞質條件中不容易降解的缺點。如果螺旋不破壞，則肽可顯示強的細胞毒性。由于此原 因，應排除無目標地增加 α-螺旋含量的技術。
[0091] 考慮到這一點，本發明人發現通過由兩個或多個二硫鍵連接兩性α-螺旋肽獲得的 肽多聚體可以納摩爾或更少與ShRNA形成強鍵合同時具有接近100%的α-螺旋含量。此α-螺 旋含量與單體肽的低α-螺旋含量(水中約10%)進行比較，且其結合親和力也為單體肽的約 100-1000倍。通過此高α-螺旋含量，所述肽的細胞穿透能力可增加，且所述肽可與發夾形狀 的RNAi或shRNA強結合，并因此可為用于將RNAi遞送入細胞的劃時代的（epoch-making)結 構。
[0092] 在現有技術中，使用了采用人工合成的接頭化合物增加肽的α-螺旋含量的方法， 但在本發明中，可從半胱氨酸獲得的二硫鍵可用于增加肽的α-螺旋含量并還可最小化肽的 細胞毒性。
[0093] 本發明人發現，通過在肽的i位置和i+7位置用半胱氨酸取代疏水性氨基酸并通過 二硫鍵連接肽獲得的多聚體顯示高α-螺旋含量且還顯示強親和力，其對于發夾形狀的RNA 靶標對應于與納摩爾相應的kd值。
[0094] 如果兩性肽通過二硫鍵彼此連接，則可在兩性肽的氨基酸之間并入半胱氨酸，從 而肽可通過半胱氨酸之間的二硫鍵連接。
[0095] 本文中，肽可包含由下式所示的一個或多個氨基酸序列：
[0096] CYYXXYXCYYXXYXZff(1)
[0097] XYYCXYXXYYCXYXZff(2)
[0098] XYYXCYXXYYXCYXZff(3)
[0099] XYYXXYCXYYXXYCZW(4);和
[0100] XYYXXYXCYYXXYXCK5)
[0101 ]其中X、Z和W為疏水性氨基酸，Y是親水性氨基酸且C是半胱氨酸。
[0102] 具體地，所述肽可具有選自下組的至少一個序列：下表1中所示的SEQ ID NO:1_ 10。
[0103]
[0105]在滿足上表1中所示的氨基酸序列的肽中，根據本發明的肽可具有由SEQ ID N0:3 或8所示的氨基酸序列。
[0106] 具有由SEQ ID N0:3或8所示的氨基酸序列的肽包含疏水性氨基酸亮氨酸和親水 性氨基酸賴氨酸或精氨酸。所述肽通過這些親水性和疏水性氨基酸展示兩性特征并通過α_ 螺旋結構具有細胞穿透能力。
[0107] 根據本發明的肽多聚體包含同質性或異質性α-螺旋肽。其可為通過連接多個同質 性肽獲得的同質性肽多聚體，或可為異質性肽多聚體，其包含具有優異的細胞內遞送能力 的遞送肽和能夠充當細胞內靶標的配體的異質性肽。
[0108] 多聚體可為其中具有多種功能的肽彼此連接同時保持肽的合意的功能的形式。例 如，多聚體可為二聚體、三聚體、四聚體或五聚體。優選地，其可為二聚體。
[0109] 在另一方面，本發明涉及用于制備肽多聚體的方法，其包括下列步驟:構建包含親 水性和疏水性氨基酸的α-螺旋肽;選擇多個同質或異質的α-螺旋肽;并在選自下組的一個 或多個氨基酸位置連接多個所選的α_螺旋肽:i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+ΙΟ和i+11 (其中i是整 數）。如上文所述的根據本發明的每種元素可同樣應用于制備肽多聚體的方法。
[0110] 在另一方面，本發明涉及用于預防或治療HIV的組合物，其包含α-螺旋肽多聚體作 為活性成分。本發明人已發現，根據本發明的肽多聚體顯示對于shRNA(短發夾RNA)的強結 合親和力，所述shRNA稱為TAR(轉錄活化區），其位于LTR(長末端重復），參與導入HIV-I (人 免疫缺陷病毒-1)的宿主的基因組的有效轉錄）。此外，本發明人已發現，通過由其中含有的 半胱氨酸-半胱氨酸共價鍵連接具有SEQ ID N0:3的序列的肽形成的二聚體也顯示對于稱 為TAR的shRNA的非常強的結合親和力。
[0111] 進一步研究了此關聯性，且作為結果，發現了根據本發明的肽多聚體可特別地充 當Tat-TAR相互作用的抑制劑以抑制HIV-I復制。此外，根據本發明的肽多聚體具有優異的 細胞穿透能力，且因此可充當針對HIV轉錄的細胞內抑制劑。
[0112] 基于此事實，在另一方面，本發明涉及用于預防或治療HIV的組合物，其包含α-螺 旋細胞穿透肽多聚體作為活性成分。
[0113] TAR RNA和病毒Tat蛋白之間的上述相互作用活化病毒基因的轉錄。作為結果，此 相互作用可成為用于開發用于治療由HIV-I引起的疾病的物質的靶標。即使此可能性是已 知的，用于抑制Tat與TAR RNA的結合的藥劑并不存在。這是由于甚至能夠穿透細胞的低分 子化合物不能有效與TAR RNA結合，且大分子很難穿透細胞，即使它們可抑制Tat與TAR RNA 的結合。
[0114] 考慮到這一點，本發明人已發現，α-螺旋細胞穿透肽多聚體可穿透細胞以與TAR RNA結合，由此直接抑制TAR RNA與Tat之間的結合以由此抑制HIV-I基因的轉錄。
[0115]根據本發明的組合物可用于治療HIV感染的患者或實際上或潛在地暴露于HIV的 患者，但不限于此。例如，在確定患者用HIV注射后，即患者的血液在輸血、器官移植、體液交 換、意外的針刺或手術過程中暴露于HIV后，根據本發明的組合物可有效用于治療HIV感染。 [0116]此外，根據本發明的α-螺旋細胞穿透肽多聚體還可用作在線粒體的表面上識別 Bcl2/Bax蛋白以誘導癌細胞的細胞凋亡的肽。
[0117]本發明的組合物可進一步包含一個或多個藥物上可接受的載劑。藥物上可接受的 載劑應與活性成分兼容，且可為選自如下的一者:生理鹽水、無菌水、林格氏溶液(Ringer's solution)、緩沖鹽水、右旋糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇和其兩種或多種的混合物。如 果需要，所述組合物可包含其他常規的添加劑如抗氧化劑、緩沖劑或抑菌劑。此外，稀釋劑、 分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤滑劑可額外地添加至組合物以制備可注射制劑如水溶液、 懸液和乳液。具體地，所述組合物優選作為凍干制劑提供。為制備凍干制劑，可使用本發明 所屬技術領域中已知的常規方法，且還可添加用于凍干的穩定劑。此外，組合物可優選通過 本領域已知的合適方法或通過Remington's Pharmaceutical Science ,Mack Publishing Company，Easton PA中公開的方法根據疾病或組分配制。
[0118] 本發明組合物中的活性成分的量和用于施用組合物的方法可一般地基于患者的 病況和疾病的嚴重性由本領域的技術人員確定。此外，組合物可以多種形式配制，包括粉 末、片劑、膠囊、液體、可注射溶液、軟膏和糖漿制劑，且可通過使用單位劑型或多劑量容器 例如密封的安瓿或小瓶提供。
[0119] 本發明的組合物可口服或腸胃外施用。根據本發明的組合物可例如口服、靜脈內、 肌內、動脈內、髓內、硬膜內、心內、經皮、皮下、腹膜內、直腸內、舌下或局部施用，但不限于 此。根據本發明組合物的劑量可取決于患者的體重、年齡、性別、健康狀況和飲食、施用時 間、施用模式、排泄率和疾病的嚴重性等變化，且可由本領域的技術人員容易確定。此外，對 于臨床施用，本發明的組合物可使用已知的技術制備為合適的制劑。
[0120] 此外，本發明涉及用于生物活性成分的細胞內遞送的組合物，其包含α-螺旋細胞 穿透肽多聚體和與所述肽多聚體結合的生物活性物質。
[0121] 根據本發明的肽多聚體的細胞穿透能力可比常規的細胞穿透肽的至少10倍高。具 體地，常規的細胞穿透肽以至少微摩爾濃度使用以將負載遞送入細胞，而根據本發明的細 胞穿透肽多聚體甚至當以等于所使用的常規細胞穿透肽最小濃度的約1/10的濃度使用時， 可確保合意的細胞穿透能力。而且，發現如果將生物活性物質例如RNAi寡核苷酸分子遞送 入細胞，本發明的肽多聚體顯示合意的細胞穿透能力，甚至當其以納摩爾范圍的濃度使用 時。
[0122] 如上文所述，根據本發明，以非常低的濃度(具體地，幾十納摩爾或更低的濃度)使 用細胞穿透肽多聚體。因此，甚至當生物活性物質例如RNAi寡核苷酸分子以與現有技術中 所使用的相比非常低的濃度使用時，其可呈現合意的效果。細胞穿透肽的低濃度和生物活 性物質的低濃度可為可最小化細胞毒性的足夠的條件。
[0123] 當根據本發明的細胞穿透肽多聚體穿透其為還原環境的細胞質時，多聚體中的共 價鍵可破裂以形成單體肽。如果肽多聚體中的共價鍵在細胞中持續保持，所述肽多聚體可 呈現高細胞毒性，因為其一般具有優異的與DNA或RNA結合的能力。然而，共價鍵在細胞質中 破裂的肽多聚體可容易由細胞中的多種蛋白酶水解，因為其化學穩定性顯著減少同時其α-螺旋含量也迅速減少。
[0124] 因此，根據本發明的細胞穿透肽多聚體呈現優異的遞送入細胞的能力，且可實現 理想的效果，甚至當生物活性物質以低濃度使用時。此外，其可在細胞中降解從而其細胞毒 性可最小化。
[0125] 生物活性物質，一種負載，可為與細胞跨膜域結合從而遞送入細胞以由此調節體 內任何生理現象的物質。例如，生物活性物質可為DNA、RNA、siRNA、適體、蛋白、抗體或細胞 毒性化合物，但不限于此。
[0126] 此外，用于調節生物活性或功能或其他遞送載劑的物質可額外地與根據本發明的 肽多聚體結合。在這種情況中，肽多聚體和用于調節生物活性或功能的物質或其他遞送載 劑可形成復合結構。所述物質或遞送載劑可通過例如非共價鍵或共價鍵與多聚體連接。非 共價鍵可為選自下組的一個或多個:例如氫鍵、靜電相互作用、疏水性相互作用、范德華相 互作用、JI-JT相互作用和陽離子-JT相互作用。共價鍵可為可降解鍵或不可降解鍵。可降解鍵 可為二硫鍵、酸可降解鍵、酯鍵、酐鍵，生物可降解鍵或酶可降解鍵，但不限于此。不可降解 鍵可為酰胺鍵或磷酸鍵，但不限于此。
[0127] 細胞毒性化合物可通過非共價鍵如靜電鍵或主客體鍵(host-guest bond)與肽多 聚體連接。例如，細胞毒性化合物可為阿霉素/多柔比星（doxorubicin)、甲氨蝶呤 (methotrexate)、紫杉醇(paclitaxel)、順鉬、博來霉素、泰素(taxol)、小檗堿(berberine) 或姜黃(curcumin)，但不限于此。如果生物活性物質是蛋白或抗體，其可包括與在細胞中某 種靶標結合的任何藥物，且多聚體可通過與蛋白或抗體的N-末端或C-末端融合而導入。
[0128] 在一些情況中，針對癌細胞(MCF7)具有藥物抗性的甲氨蝶呤可與肽多聚體連接從 而其可用作摧毀癌細胞的新型物質。此外，天然為疏水性的生理活性小分子(泰素、小檗堿、 姜黃等)可與肽多聚體連接以增加在其所遞送的細胞中的濃度。此外，抗體、作為抗體片段 的蛋白或蛋白藥物可與本發明的二聚體肽連接并遞送入細胞，且寡核苷酸藥物（siRNA、 asDNA、DNA或適體)也可與二聚體肽連接并遞送入細胞。 實施例
[0129] 下文中，將參照實施例更詳細地描述本發明。對本領域中的普通技術人員顯而易 見的是，這些實施例僅為說明目的而不應理解為限制本發明的范圍。因此，本發明實際范圍 會通過所附的權利要求及其等同物限定。
[0130] 實施例1:肽單體和二聚體的合成
[0131] 使用固相合成方法和Fmoc化學合成單體LK(LKKLLKLLKKLLKLAG)，單體A (CKKLLKLCKKLLKLAG)、B(LKKCLKLLKKCLKLAG)、C(LKKLCKLLKKLCKLAG)、D (LKKLLKCLKKLLKCAG)和E(LKKLLKLCKKLLKLCG)，其各具有兩個半胱氨酸殘基，單體AR (LRRLLRLLRRLLRLAG)，其中LK的氨基酸序列中的全部K殘基都用R取代，單體RA (CRRLLRLCRRLLRLAG)、RB(LRRCLRLLRRCLRLAG)、RC(LRRLCRLLRRLCRLAG)、RD (LRRLLRCLRRLLRCAG)和RE(LRRLLRLCRRLLRLCG)，其各具有兩個半胱氨酸殘基，等。具有附接 于其的二硫化物的二聚體肽通過在空氣氧化條件下氧化純化的單體肽獲得(二聚體A、B、C、 0』、1^、1^、1?(：、1^和1^)。如圖3所示，0丨1^1肽根據米氏反應(]^(31^61代3(^〇11)使用間隔 物（spacer)合成。
[0132] 為觀察穿透細胞的特征，還制備了在其N-末端具有FITC標記的肽。合成的肽的分 子量通過MLDI-TOF質譜儀如下所述分析。
[0133] LK-MS[M+H] + : 1861.3(計算的（calcd. )),1862.3(發現的（found)) ,FITC-標記的 LK-MS[M+H] + :2208.4(計算的），2208.0(發現的），C-MS[M+H] + : 1841.2(計算的），1840.8(發 現的），FITC-標記的C-MS[M+H] + :2188.2(計算的），2188.5(發現的）），二聚體C-MS[M+H] + : 3677.4(計算的），3677.9(發現的），FITC-標記的二聚體 C-MS(M+H+): 4024.4(計算的）， 4024.1(發現的）），二聚體MS[M+H] + :2381.3(計算的），2381.7(發現的）），FITC-標記的二聚 體-MS[M+H] + :4519.5(計算的），4520.1(發現的））。
[0134] 實施例2:合成的肽的CD (圓二色譜)分析
[0135] 使用⑶（圓二色譜)觀察合成的單體、二聚體和Dimal肽的二級結構。具體地，二聚 體甚至在水溶液環境中顯示接近100 %的α-螺旋含量。此α-螺旋含量與單體(在水溶液中 30%)非常不同。
[0136] 認為當二硫鍵以α-螺旋的一個方向存在于i和i+7位置時，兩個共價鍵可通過結合 α-螺旋形狀保持高α-螺旋含量。像二聚體肽，Dimal肽也具有高α-含量，因為其使用兩個共 價鍵合成。然而，Dimal肽由于分子的柔軟度具有低于二聚體肽的α-螺旋含量。
[0137] 用其為還原環境的DTT(與細胞質環境相似)處理二聚體/Dimal肽。通過此處理，可 能的是觀察二聚體/Dimal肽在其為還原環境的細胞質中如何變化。觀察到二聚體降解為單 體，且所述單體具有明顯低的α-螺旋含量。然而，Dimal肽甚至當其用DTT處理時保持α-螺旋 結構。
[0138] 實施例3:肽的細胞穿透測試
[0139] 通過FACS實驗在FITC-標記的肽的不同濃度將三種不同的肽的細胞內攝取彼此比 較（圖4)。在高肽濃度(500ηΜ)，二聚體(LK-3)和單體(LK-1或LK-2)顯示了高攝取效率(90% 或更多），其具有極少區別或無區別。然而，在低濃度（IOnM)，觀察到二聚體(LK-3)顯示了高 攝取效率，而單體的攝取效率大大減少至少于10%。
[0140] 具體地，觀察到Dimal肽（LK-4)甚至在低濃度被攝取，但其攝取效率比二聚體的 (90%或更多）低約10-15%。顯示在低濃度和高濃度細胞穿透能力高低順序為：二聚體〉 Dimal> 單體。
[0141] 實施例4:使用二聚體的siRNA遞送
[0142] 使用10種二聚體肽(二聚體A、B、C、D、E、RA、RB、RC、RD和RE)和對照肽，實施了實驗 以檢查RNAi(Dy547-標記的）是否容易穿透細胞。作為對照肽，使用了 LK、Rev、單體C、扭結C 和扭結D。使用了包含0.8yL DharmaFECT的陽性對照。以IOOnM的濃度使用二聚體肽，并以 200nM的濃度使用單體肽，并以50nM的濃度使用RNAi。將每種肽與RNAi混合以制備混合物溶 液。將每種混合物溶液添加至HeLa細胞(2. OxlO3細胞/孔)并溫育24小時。接著，用I3BS洗滌 細胞一次，然后用熒光共聚焦顯微鏡觀察穿透細胞的RNAi的量。
[0143] 如在圖5中可見，遞送入細胞的RNAi的量大小順序為：二聚體RE>二聚體O二聚體 D，但當使用單體肽時，RNAi基本不遞送。
[0144] 實施例5:肽的細胞內穿透機制的分析
[0145]使用FITC-標記的肽和共聚焦顯微術比較肽的攝取機制（圖6)。
[0146]單體在低溫(ATP-非依賴攝取)或在巨胞飲(macropinocytosis)抑制條件略微遞 送，這表明單體可通過能量非依賴機制和能量依賴機制兩者穿透細胞。明顯可見的是，二聚 體通過所述兩機制也顯示優異的細胞穿透能力且具有比單體優異得多的細胞穿透能力。然 而，Dimal肽在低溫時不具有細胞穿透能力且甚至在巨胞飲抑制條件中基本上不進入細胞， 這表明Dimal肽僅進入能量依賴途徑。可見單體和二聚體通過其為能量非依賴途徑的直接 方法進入細胞，且二聚體的二硫鍵的切割在能量非依賴途徑中起重要的作用。
[0147] 實施例6:肽的細胞毒性測試
[0148] 通過用肽處理癌細胞并通過MTT測定法分析細胞的活性來檢查肽的細胞毒性。作 為結果，全部三種肽(單體、二聚體和Dimal)在多至5μΜ的濃度都未顯示細胞毒性。
[0149] 本發明公開了用于最大化具有細胞穿透能力的α-螺旋肽的α-螺旋含量的方法和 通過該方法合成的具有增加的遞送或穿透能力的肽。為最大化α-螺旋含量，將兩個巰基附 接于單體肽，且包含兩個二硫鍵的二聚體肽從單體肽使用空氣氧化條件制備。
[0150] 實施例7:對TAR RNA的結合親和力和α-螺旋含量的測量
[0151] 使用具有SEQ ID Ν0:3的序列的肽，制備了下表2中所示的LK肽。
[0152]整
[0154] 兩性肽二聚體LK-3在每條鏈中包含兩個二硫鍵且對于TAR RNA具有納摩爾或更少 的親和力。由于LK-3中的二硫鍵可在細胞質環境中降解，將可還原單體肽LK-2用作對照。不 可還原二聚體LK-4由通過兩個N，N'-(1，4-亞苯基）二馬來酰亞胺接頭連接的肽鏈組成。在 上表2中，LK-3中的二硫鍵由虛線指示，且LK-4中的N，N'-(1，4-亞苯基)二馬來酰亞胺接頭 由實線指示。
[0155] (1)結合親和力
[0156] 肽與TAR RNA結合的Kd值(解離常數)通過熒光異向性使用羅丹明-Rev肽作為探針 在20°C測量。測量結果指示LK-3和LK-4的親和力是單體肽(LK-1和LK-2)的100-1000倍。
[0157] (2)α_螺旋含量(α-螺旋度)
[0158]使用⑶(圓二色譜），第一α-螺旋度值在PBS(pH 7.4)的模擬膜條件中測量，且第二 值在相同緩沖劑中于50%TFE中測量。測量結果指示二聚體肽的α-螺旋度比單體肽的高。事 實上，顯示LK-3和LK-4顯示約90 %的α-螺旋度。
[0159] (3)細胞穿透能力
[0160]使用由9個精氨酸殘基組成的已知的細胞穿透肽R9將用FITC(異硫氰酸熒光素)標 記的LK肽與HeLa細胞(人類宮頸癌細胞系)溫育。FACS(熒光激活細胞分選)分析的結果（圖 4)指示，在分析中使用的全部濃度，FITC陽性細胞的百分比(細胞穿透能力)高低順序為:R9 〈LK-1和LK-2〈LK-4〈LK-3(圖 4a)。
[0161] 在高濃度(>500nM)，單體和二聚體肽顯示接近100%的細胞穿透率。然而，單體肽 在非常低的濃度（IOnM)顯示僅40%的穿透效率且在IOOnM僅70%的穿透效率，而二聚體肽 具有70-90%的細胞穿透率。對照R9在IOnM顯示非常低的細胞穿透率。作為結果，可見LK肽 的細胞穿透能力通過二聚體的形成大大增加。此外，顯示肽二聚體的相當一部分被遞送入 細胞核（圖4b)。
[0162] (4)細胞內穿透機制的檢查
[0163] 為了檢查在細胞內穿透中使用的機制，在多種胞吞抑制條件下測試LK肽。LK肽在 低濃度（IOnM)的細胞內穿透通過降低溫度至約4°C或通過用胞吞抑制劑(渥曼青霉素或阿 米洛利)處理幾乎完全抑制。因此，可見LK肽的低濃度由能量依賴的胞吞途徑內化并通過巨 胞飲或網格蛋白（clathrin)介導的胞吞作用穿透，即使LK肽的活性與這些濃度顯著不同 (圖4c)。在高濃度(500nM)，全部LK肽顯示>80%的細胞攝取，且根據不同的機制穿透細胞。 可見LK-4(不可還原二聚體)根據與在低濃度時相似的機制進入細胞（圖4d)。例如，渥曼青 霉素或阿米洛利的細胞內穿透基本上由單體LK-2和二聚體LK-3抑制，且這些肽的內化效率 甚至在4°C未變化。因此，可見LK-2和LK-3在高濃度通過其他類型的能量依賴途徑(其既非 受體介導的胞吞也非巨胞飲)穿透細胞。
[0164] 500nM的包含馬來酰亞胺接頭的不可還原LK-4二聚體的細胞內穿透通過降低溫度 或通過用胞吞抑制劑處理完全抑制。從上述結果，可見肽二聚體在低濃度的能量依賴的細 胞內穿透隨α_螺旋含量減少而更加促進，而單體肽以能量非依賴的方式(例如，孔洞或毪狀 物(carpet)形成)穿透細胞。
[0165] (5)對Tat-TAR相互作用抑制效果的檢查
[0166] 由于LK二聚體肽可以納摩爾濃度遞送入細胞，檢查了 LK二聚體肽是否可抑制宿主 細胞中的病毒靶標。用包含pLTR-luc、HIV-l LTR啟動子和螢火蟲熒光素酶基因的質粒連同 包含pTat和HIV-I Tat基因的質粒轉染HeLa細胞，由此在HeLa細胞中構建熒光素酶報告蛋 白系統。在此系統中，表達的作為反終止子(anti-terminator)的Tat蛋白與在LTR啟動子下 的TAR RNA相互作用以增加熒光素酶基因的轉錄。將LK肽和報告細胞溫育12小時，然后通過 RT-PCR確定mRNA的相對量（圖8)。作為結果，與兩看家基因（β-肌動蛋白和18S rRNA)相比， 熒光素酶基因的mRNA水平以依賴于肽的量的方式減少（圖8a和8b)。此外，為證明LK肽不干 擾與轉染的質粒DNA的結合和轉錄，測量了包含轉錄的全TAR RNA的長熒光素酶基因的轉 錄。顯示TAR-Iuc (長轉錄物)與TAR(全轉錄物）的比率和TAR-Iuc的mRNA與看家基因的mRNA 的比率相似。這表明Tat-TAR相互作用在轉錄水平由LK肽抑制（圖8c)。
[0167] 關于Tat-介導的轉錄的抑制，單體(LK-1和LK-2)甚至在IOOnM顯示少于50%的抑 制性效果，而肽二聚體(LK-3和LK-4)具有較高的細胞穿透能力同時其在IOnM顯示約50%的 抑制性活性且在IOOnM顯示80%的抑制性活性。由于LK-I和LK-2穿透HeLa細胞的能力相似 (圖4a)，看起來LK-2的較強抑制性效果由對TAR RNA較強的親和力引起。由于二硫鍵在還原 的細胞質環境中容易降解，內化后LK-3在細胞質中減少以形成仍以納摩爾親和力與TAR RNA結合的單體LK-2。因此，LK-3的增加的細胞穿透能力是在轉錄水平能夠抑制Tat-TAR相 互作用的主要原因。
[0168] (6) IC5Q 的測量
[0169] LK肽的IC5q值通過熒光素酶測定法測量，且由高到低順序為：LK-l(107nM)>LK-2 (49.611]\〇>1^-4(34.711]\〇兒1(-3(10.311]\〇(圖10)。二聚體1^-3的1〇5()值為單體1^-1的至多1/ 10(at least 10 times lower than)，且認為這是由于增加的細胞穿透能力且由于當LK-3 在細胞質中降解時單體肽的濃度增加兩倍或更多所致。LK-3的IC 5q值與LK-2的解離常數(Kd =9.6nM)基本相同，表明穿透入細胞膜不再充當針對細胞活性的屏障。由于在其他肽藥物 中不存在特定的構建，出現Kd和IC 5q值之間的極大差異。
[0170] 圖10顯示在與作為相似的基于細胞的測量系統的RAW 264.7細胞(小鼠單核細胞/ 巨噬細胞系）中測量LK肽的I C5q值的結果。如在圖10中可見，LK肽的I C5q值為15-150nM。
[0171] (7)HIV_1復制的抑制和細胞毒性分析
[0172]分析了急性感染的T-類淋巴母細胞(M0LT-4/CCR5)中HIV-I復制的抑制（圖11)。 HIV-I復制中LK-3和LK-4的IC5Q值分別為590.1碰和278.5碰，而0(-1的1〇5()值為>2以]\1。比 HeLa或RAW 264.7細胞中更高的IC5q值可部分貢獻于減少肽穿透T-類淋巴母細胞的能力。然 而，LK-3在比用于HIV-I復制的IC5q值高得多的2.56μΜ或更少的濃度未顯示對于宿主細胞顯 著的細胞毒性。顯示LK-4具有略高于LK-3的活性，但對于宿主細胞是細胞毒性的。這指示LK 二聚體(特別是LK-3)可用于HI V-I的治療。
[0173]肽的細胞毒性通過MTT測定法分析。分析結果示于圖12中。當MTT測定法在用肽處 理后24小時實施時，顯示肽對于Hela細胞和RAW 264.7細胞兩者都不是細胞毒性的，直至其 達到約ΙΟμΜ。
[0174] (8)細胞膜的去穩定
[0175] 通過LDH測定法分析了肽去穩定化細胞膜的程度。分析結果示于圖13中。參考圖 13,當在用肽處理后12小時實施LDH測定法時，可見肽對于Hela細胞和RAW 264.7兩者基本 上都不去穩定化細胞膜，直到其達到約2μΜ。
[0176] 由于肽穿透入細胞膜在約IOnM的濃度發生，可見肽的細胞內穿透與細胞膜的去穩 定化沒有直接關聯。
[0177] 顯示LK_3(可還原二聚體)和單體在8μΜ顯示輕微的去穩定化，而LK_4(不可還原二 聚體)甚至在8μΜ顯示極少或不顯示去穩定化。
[0178] (9)Tat_TAR相互作用的抑制類型的檢查
[0179]根據pTat的表達水平分析了 LK肽抑制性能力的減少。基于Hela細胞的系統用不同 量的PTat質粒轉染，通過熒光素酶測量了LK肽的抑制能力。測量的結果示于圖14中。圖14中 每組的細節示于下表3中。
[0180]整
[0183] * 二聚體:LK_3,單體:LK-2
[0184] 參考圖14，可見LK肽的抑制能力根據pTat的表達水平緩慢減少(92.9 % >92.3 % > 72.3 % (在IOOnM LK-3的情況中）。這間接表明Tat和LK肽的競爭性結合與TAR-熒光素酶的 表達具有深度關聯。
[0185] (10)肽穩定性
[0186] 肽的穩定性通過HPLC在37°C測量。肽的半衰期通過指數衰減建模計算，且計算的 結果示于下表4和圖15-17(繪制肽濃度在時間標度中的速率常數）。在圖14中，LK-3中的二 硫化物接頭通過虛線指示，且LK-4中的N，N ' -(1，4-亞苯基)二馬來酰亞胺接頭通過實線表 示。扭結肽和LK-3與多種血清蛋白重疊。生命期短，且半衰期在該條件中未確定。引入的全 部肽在1小時內消失。在二聚體D中也預期相同的結果。
[0187] ^4
[0189] NC:不可計算;N/A:未確定
[0190] 測量了肽二聚體D和單體D在體外在人血清中的穩定性，且測量的結果示于圖15。 參考圖15,可見與LK-3相似的二聚體D在25%人血清中顯示約9小時的半衰期，這是其單體 的半衰期(3小時）的約3倍。這指示通過二硫化物二聚體形成的結構穩定化可抑制由血清中 存在的蛋白酶引起的降解。
[0191] 測試血清中LK-4的穩定性的結果示于圖16。包含不同于二硫鍵的鍵的LK-4的半衰 期在相同條件下測量為2小時。由于LK-4不是在與二聚體D中的相同位置具有二硫鍵的二聚 體，LK-4不能直接與二聚體D比較，但可見肽的穩定性可取決于二聚體形成的位置而變化。
[0192] 在作為體內還原條件的0.5mM GSH中測試肽二聚體D和扭結D的穩定性的結果示于 圖17。作為直接顯示對肽穩定性的結構效果的實施例，當二聚體形成從而將二硫鍵穩定定 位于結構內時，二聚體還原所花費的時間在相同條件下增加。然而，顯示當二硫鍵在分子中 形成從而其相對暴露時，半衰期在1小時內。
[0193] 本領域的任何技術人員會理解的是，基于本發明的公開內容的多種應用和修飾是 可能的而不脫離本發明的范圍。
[0194] 工業實用性
[0195] 如本文所述，包含位于多個α-螺旋兩性肽的一個或多個氨基酸位置的接頭的本發 明的肽多聚體可具有高細胞穿透能力，因為它具有顯著增加的α-螺旋含量。由于此優異的 細胞穿透能力，肽多聚體可將多種生物活性物質有效遞送入細胞，且其細胞毒性可在細胞 內穿透后最小化。因此，本發明的肽多聚體可有效用作用于預防或治療疾病的作用劑。
【主權項】
1. 一種肽多聚體，其包含多個同質或異質的α-螺旋兩性肽。2. 權利要求1的肽多聚體，其中進一步包含位于選自下組的一個或多個氨基酸位置的 接頭：i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+10和i+ΙΙ(其中i是整數）。3. 權利要求2的肽多聚體，其中所述接頭位于選自下組的兩個或多個氨基酸位置:i、i+ 3、1+4、1+7、1+8、1+10和1+11(其中1是整數）。4. 權利要求1的肽多聚體，其中所述兩性肽包含選自下組的一個或多個親水性氨基酸： 精氨酸、賴氨酸和組氨酸。5. 權利要求1的肽多聚體，其中所述兩性肽包含選自下組的一個或多個疏水性氨基酸： 亮氨酸、纈氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和異亮氨酸。6. 權利要求1的肽多聚體，其中所述肽包含5-50個氨基酸。7. 權利要求1的肽多聚體，其中所述肽包含7-23個氨基酸。8. 權利要求1的肽多聚體，其中在所述肽中分別排列1 _3個親水性氨基酸和疏水性氨基 酸。9. 權利要求1的肽多聚體，其中所述兩性肽包含下式所示的7個氨基酸序列中的一個或 多個：其中X是親水性氨基酸且Y是疏水性氨基酸。10. 權利要求1的肽多聚體，其中所述兩性肽中的親水性氨基酸以33%或更多量包含選 自下組的一個或多個帶正電荷的氨基酸殘基:精氨酸、賴氨酸和組氨酸。11. 權利要求1的肽多聚體，其中所述兩性肽的疏水性氨基酸以25%或更多量包含選自 下組的一個或多個殘基:亮氨酸、色氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和異亮氨酸。12. 權利要求1的肽多聚體，其中所述兩性肽包含下列SEQ ID ΝΟ:11所示的序列： KLLKLLK(SEQ ID ΝΟ:11)。13. 權利要求1的肽多聚體，其中所述肽包含下式所示的一個或多個氨基酸序列： CYYXXYXCYYXXYXZW(1) XYYCXYXXYYCXYXZW⑵ XYYXCYXXYYXCYXZW⑶ XYYXXYCXYYXXYCZW⑷；和 XYYXXYXCYYXXYXCff(5) 其中X、Z和W是疏水性氨基酸，Y是親水性氨基酸，且C是半胱氨酸。14. 權利要求13的肽多聚體，其中所述肽包含選自SEQ ID NO: 1-10的至少一個序列。15. 權利要求1的肽多聚體，其中所述肽的α_螺旋含量在其中三氟乙醇和緩沖劑以1:1 的比率混合的細胞膜條件中為至少80%。16. 權利要求1的肽多聚體，其中所述接頭包含在肽之間連接的共價鍵。17. 權利要求16的肽多聚體，其中所述共價鍵為選自下組的至少一個:半胱氨酸間的二 硫鍵、馬來酰亞胺鍵、酯鍵、硫醚鍵和由點擊反應(c 1 i ckr eac t i on)形成的鍵。18. 權利要求1的肽多聚體，其中所述多聚體是二聚體、三聚體或四聚體。19. 一種用于制備肽多聚體的方法，其包括下列步驟： 構建包含親水性和疏水性氨基酸的α_螺旋肽； 選擇多個同質或異質的螺旋肽;和 在選自下組的一個或多個氨基酸位置連接多個所選的α-螺旋肽：i、i+3、i+4、i+7、i+8、 i+10和i+11 (其中i是整數）。20. 權利要求19的方法，其中所述多個所選的α-螺旋肽在選自下組的兩個或多個氨基 酸位置彼此連接:i、i+3、i+4、i+7、i+8、i+ΙΟ和i+11 (其中i是整數）。21. 權利要求19的方法，其中所述多個α-螺旋肽彼此通過在肽之間連接的共價鍵彼此 連接。22. 權利要求21的方法，其中所述共價鍵為選自下組的至少一個：半胱氨酸間的二硫 鍵、馬來酰亞胺鍵、酯鍵、硫醚鍵和由點擊反應形成的鍵。23. 用于預防或治療HIV的組合物，其包含權利要求1-18任一項的α-螺旋肽多聚體作為 活性成分。24. 權利要求23的組合物，其中所述肽多聚體與HIV的TAR(反式激活區）結合。25. -種用于細胞內遞送生物活性物質的組合物，其包含權利要求1-18任一項的肽多 聚體和所述生物活性物質。26. 權利要求24的組合物，其中所述生物活性物質是DNA、RNA、s i RNA、適體、蛋白質、抗 體或低分子化合物。
【文檔編號】A61K47/42GK105829336SQ201480068517
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年10月17日
【發明人】俞載勛, 李衍, 玄純實, 蔣尚穆
【申請人】首爾大學校產學協力團