一種黃腐酚的制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種制備黃腐酚的方法，其中，將一種含黃腐酚的提取物與水混合，過渡金屬鹽溶液添加到所獲得的混合物中，然后將得到的黃腐酚沉淀收集，干燥，得到高于90％純度的黃腐酚。
【專利說明】一種黃腐酚的制備方法
[0001] 本發明提供一種從萃取后的廢啤酒花、啤酒花植物顆粒或啤酒花中提取高純度的 黃腐酚的方法。所獲得的黃腐酚的純度高，可直接應用于膳食補充劑，飲料及作為治療產品 原料。
[0002] 黃腐酚(Xn)或（（E)-1-[2,4-二羥基-6-甲氧基-3-(3-甲基丁-2-烯基）-苯基]-3_(4_羥基苯基）-丙_2_稀-1-酮）（（E)_l_[2，4-dihydroxy-6-methoxy-3-(3-methylbut-2_enyl)-phenyl ]-3-(4_hydroxyphenyl )-prop-2-en_l-〇ne)是異戊二稀化查耳酮類的天 然產物，它主要來源于啤酒花(Humulus Lupus (hop))的雌花序。它僅微量存在于啤酒中。 該化合物包含a不飽和羰基連接的兩個苯環：
該分子中存在游離羥基，很容易異構化成一種黃酮生物合成的中間體一一黃烷酮。相 對于啤酒花的其他成分，黃腐酚更親脂，因其結構中存在異戊二烯取代基。應當注意的是， 在活的生物系統中，異戊二烯化的(法尼基或香葉基香葉基)結構單元能夠促進許多細胞內 分子附著于細胞膜中，這決定了其相應的活性。同理，在黃腐酚中，這種結構單元顯著調節 了該化合物的生物活性，更重要的是，影響了它的物理化學特性和亞細胞分布。
[0003] 體外和體內研究還顯示，黃腐酚通過許多機理減少了炎癥和氧化過程。其中一個 很重要的過程是：消除氧自由基及其活性形式(RTF)，抑制環氧合酶(COX I和⑶X II)的活 性，減少前列腺素，N0，TNFa，NFkB的產生和中和膜磷脂(membrane phospholipide)的過氧 化。
[0004] 黃腐酚的抗氧化和抗炎活性與其分子中的羥基和異戊烯基取代基相關。a，0 -不 飽和羰基基團也很重要。該基團參與生物學上重要的親核試劑的邁克加成反應，例如:蛋白 質的L-半胱氨酸和其它含巰基的分子，所獲得的共價加成物使得與黃腐酚結合的各種分子 喪失生物活性。
[0005] 黃腐酚的廣譜活性可能來自其與重要的生物分子的結合能力。最典型的案例為黃 腐酚對聚合酶a合成酶，拓撲異構酶I，堿性磷酸酶，芳香酶，二酰基甘油酰基轉移酶，MAPK信 號通路蛋白，FAK激酶，Akt和STAT或NF-kB轉錄因子的影響。XN誘導的所述蛋白質的活性的 降低引起細胞多效性，如腫瘤細胞的增殖，細胞循環，粘附和迀移干擾。
[0006] 值得注意的還有涉及神經保護屬性的信息。在MCA0引起的局灶性腦缺血大鼠模型 中，即體內局灶性腦缺血模型中，黃腐酚顯著減少腦缺血性壞死區。因此黃腐酚也被認為減 小了由的定粉樣肽(AP)引起的神經毒性作用。已知AP介導是自由基機理，這也是阿爾茨海 默氏病的主要成因之一，其機理是通過增加自由基的產生和神經細胞脂質過氧化，導致它 們的細胞凋亡。 CN 105829275 A 說明書 2/4頁
[0007] 另外，除了對受體的作用，黃腐酚的活性的機制還和其對脂質膜的選擇活性相關。 黃腐酚與模型脂膜的互動機制的研究顯示，主要作用在于其對細胞膜的動力學及膜結構的 重大修改。即使極低濃度的黃腐酚也能強烈作用于脂質膜的親水片段，引起雙層膜的厚度 的變化。已知新煙堿類，由于疏水性高，能很容易地穿透脂膜，黃腐酚與脂膜的相互作用能 顯著降低新煙堿類的穿透性，這解釋了除了其對尼古丁受體的阻斷作用外的強大的活性。
[0008] 就其化學結構而言，黃腐酚為多酚結構，然而，與多酚不同的是，其幾乎不溶于熱 水，但易溶于醇類或醇類和水的混合溶劑中。
[0009] 提取后的啤酒花是黃腐酚的良好來源，包括釀造業和啤酒生產業產生的酒花浸膏 的廢料。提取后的廢啤酒花中包含的黃腐酚估計高達1%，具體取決于啤酒花植物的種屬。 [0010]現有技術中，黃腐酚的制備技術眾多。專利DE19939350 A1公開了一種富含黃腐酚 的啤酒花提取物的制備方法，所述專利中，使用水和乙醇的混合溶劑為提取溶劑。所得的提 取物含5- 15 %的黃腐酚。
[0011]專利EP 1 424 385 B1公開了一種以壓縮的C02為溶劑從含黃腐酚生料中提取黃 腐酸的方法，該方法需要高于500bar的壓力及高于60°C的溫度。
[0012]中國專利CN 101440029公開了一種從啤酒花植物及含黃腐酚的產品中提取黃腐 酚的方法。該方法使用有機溶劑輔以超聲波萃取，之后與硅藻土混合，過濾，以水和甲醇混 合溶劑洗出，濃縮，沉淀及干燥，得到86 %純度的的黃腐酚。
[0013]專利EP2187899 B1公開了從啤酒花植物中制備高黃腐酚含量的組合物的方法，該 方法中將一種鹽加入含有黃腐酚的溶液中，所述鹽的濃度控制在0.05-0.5M之間，隨后調整 溶液pH值至10.5-12.0之間，過濾所獲得的沉淀，酸化濾液至pH為7-8，以獲得40-95%純度 的黃腐酚沉淀。
[0014] 專利US11/790365公開了一種高(60-90%)的黃腐酚含量的粉末的制備方法，所述 方法包括通過堿性溶液產生一個富集黃腐酚提取物的懸濁液，分離不溶性產物，通過酸中 和溶解的黃腐酚使之沉淀，分離沉淀出的產物。
[0015] 專利CN101433592公開了使用各種吸附樹脂制備高純度黃腐酚的方法。
[0016] 綜上所述，通過對現有技術的分析顯示，有必要開發一種簡單，廉價的制備高純度 的黃腐酚的方法。
[0017] 解決該問題的方法是發展一種從萃取后的廢啤酒花，啤酒花類植物顆粒或啤酒花 中制備黃腐酚的新方法。
[0018] 因此，本發明提供一種制備黃腐酚的方法，其中： a) 將一種含黃腐酚的提取物和水混合； b) 將一種過渡金屬的鹽溶液加入到所得到的混合物中； c) 收集所得黃腐酚沉淀，干燥后得到純度大于90%黃腐酚。
[0019] 優選地，步驟b中，所述鹽的濃度為0.001-10摩爾/升;更優選地，所述鹽的濃度為 0.001-0.05摩爾/升或大于5摩爾/升. 優選地，所述步驟b中，在加入鹽后還包含： bl)堿化溶液到pH值大于7; b2)濾出第一批沉淀，將濾液酸化至pH值低于7; b3)酸化后的濾液濃縮，得到的黃腐酚的沉淀。 4
[0020] 優選地，所述步驟bl中，溶液堿化至pH值在7.5-10.5之間或高于12。
[0021] 優選地，含黃腐酚的提取物是通過以一種可與水混溶的有機溶劑提取啤酒花廢 渣、啤酒花、啤酒花植物顆粒或以上的混合物得到的，所述溶劑用量為每公斤原料使用0.1-10升溶劑。
[0022] 優選地，所述可與水混溶的溶劑選自酮或醇或其混合物。更優選地，所述溶劑選自 丙酮、甲醇、乙醇、丙醇或以上的混合物。
[0023]優選地，所述提取的溫度為5_65°C ? 優選地，所述含黃腐酚的提取物和水的比例為每升提取物使用0.1-5升水，更優選地， 所述含黃腐酚的提取物和水的比例為每升提取物使用1-3升水。
[0024] 優選地，步驟b)中，所述過渡金屬鹽濃度為0.01-0.05M。
[0025] 優選地，所述過渡金屬鹽為Cu( II)鹽或Zn( II)鹽。
[0026] 優選地，所述過渡金屬鹽為氯鹽，硝酸鹽或硫酸鹽。
[0027] 更優選地，所述過渡金屬鹽為CuCl2，CuS〇4，ZnCl2或ZnS〇4。
[0028]使用本方法得到的黃腐酚純度至少高于90%，通常高于95%，本方法不需使用復雜 的色譜系統或硅膠負載。
[0029] 本發明方法所得黃腐酚純度使用HPLC測定。參數如下：SUPEIXOSIL LC-PAH色譜 柱，15厘米X4.6毫米，5微米粒徑;柱溫:20°C;A相為95%乙腈0.3%HC00H;B相為2%乙腈 0.3 % HC00H;流速:2毫升/分鐘;進樣量:20微升;檢測波長:370和290納米。
[0030]以下結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0031] 實施例1 250克萃取后的廢啤酒花(post-extraction spent hops)倒入丙酮(0 ? 75升），機械攪 拌1小時，經濾紙過濾析出物，得到的濾液(0.65升)加入水(1.3L)，每升溶液加入300毫升濃 度為10克/升的氯化銅溶液(最終濃度控制在〇. 022M)，加入氯化銅后，溶液的pH值穩定至約 4.5。實際上，加入氯化銅后，立即出現沉淀物，綠色的殘余草酮和葉綠素的結塊從黃色溶液 中分離出來，該溶液中存在黃腐酚。一小時后，加入NaOH將pH值提高至約10以沉淀過量的 銅，在容器的底部可觀察到了泥樣沉淀和銅的氫氧化物沉淀。以濾紙濾去沉淀物，得到的濾 液用HC1酸化至pH 6,在旋轉蒸發儀上濃縮，得到黃腐酚的結晶。將其濾出后在烘箱中干燥 (50-60 °C的溫度），得到206毫克97.8 % HPLC純度的黃腐酚的結晶。所述提取方法的產率是 黃腐酚在廢啤酒花中的總含量的82%。
[0032] 實施例2 以類似實施例1的步驟獲得黃腐酚，不同點在于加入氯化銅后，濾去沉淀出的綠色污 泥，濾液在旋轉蒸發儀上濃縮，析出90.8%HPLC純度的黃腐酮。
[0033] 實施例3 以類似實施例1的步驟獲得黃腐酚，不同點在于加入的是10克/升的硫酸鋅溶液代替了 氯化銅。加入鋅鹽溶液后，溶液的pH值穩定在6左右，觀察到沉淀。一小時后，加入NaOH，溶液 pH值提升至約10。一小時后，容器的底部觀察到進一步地沉淀。經濾紙濾去沉淀物。濾液用 HC1酸化至pH 6,經旋轉蒸發儀濃縮后得到黃腐酚的結晶，將其濾出后在烘箱中干燥(50-60 °C的溫度），得到97.8%HPLC純度的黃腐酚的結晶。所述提取方法的產率是黃腐酚在廢啤酒 花中的總含量的79%。
[0034] 實施例4 250克萃取后的廢啤酒花倒入0.75升甲醇，機械攪拌1小時，經濾紙過濾析出物，得到的 濾液以體積比1: 2倒入水中（1份濾液比2份水）。所得溶液每升加入300毫升濃度為10克/升 的氯化銅溶液，鹽的最終濃度控制在0.022M。lh后，出現沉淀物，其為分離于黃色溶液的綠 色的物質結塊。加入NaOH將pH值提高至約10,一小時后，在容器的底部可觀察到了泥樣綠色 沉淀。以濾紙濾去沉淀物，得到的濾液用HC1酸化至pH 6,在旋轉蒸發儀上除去剩余的溶劑， 得到黃腐酚的結晶的懸濁液。將其經濾紙濾出后在烘箱中干燥(55°C的溫度），得到196毫克 95.8 % HPLC純度的黃腐酚的結晶。所述提取方法的產率是黃腐酚在廢啤酒花中的總含量的 78% 〇
[0035] 實施例5 以類似實施例1的步驟獲得黃腐酚，除了加入氯化銅（II)外，還加入了濃度為10 g/1 的Cu( II)的硫酸鹽(CuS〇4)，得到94.8%HPLC純度的黃腐酮。
[0036] 實施例6 以類似實施例1的步驟獲得黃腐酚，不同點在于使用高濃度的氯化銅(II)溶液，濃度范 圍為0.022-0.044M。得到的黃腐酮純度為96.3 - 97.8%。
[0037] 實施例7 以類似實施例1的步驟獲得黃腐酚，不同點在于第一步濾液與水的體積比為1:1，氯化 銅溶液濃度為0.022M。得到的黃腐酮純度為96.8%。
[0038] 實施例8 以類似實施例1的步驟獲得黃腐酚，不同點在于以2-丙醇取代丙酮，氯化銅溶液濃度為 0.02211，得到93.8%純度的黃腐酚。
[0039] 對比例1 250克萃取后的廢啤酒花倒入丙酮(0.75升），機械攪拌1小時，經濾紙過濾析出物，濾液 濃縮得到32.8%純度的黃腐酚。
[0040] 對比例2 250克萃取后的廢啤酒花倒入丙酮(0.75升），機械攪拌1小時，經濾紙過濾析出物。得到 的濾液(0.65升)倒入水(1.3升）中，每升濾液加入300毫升濃度為30克/升的氯化鈉溶液。然 后，加入NaOH將pH值提高至約12，以濾紙濾去沉淀物，得到的濾液用HC1酸化至pH 5，在旋轉 蒸發儀上濃縮，得到黃腐酚的結晶。將其濾出后在烘箱中干燥（50-60°C的溫度），得到 84.8 %HPLC純度的黃腐酚的結晶。
[0041] 對比例3 以類似對比例2的方法得到黃腐酚，不同點在于沒有使用NaCl，只是堿化pH值到12,得 到的黃腐酚純度為58 %。
[0042] 基于上述實施例，可確知，本發明可通過一個非常簡單和廉價的方法獲得高純度 的黃腐酚。對本領域技術人員來說，顯而易見的是，通過本發明的方法獲得的黃腐酚可以以 已知的方法來進一步純化。
【主權項】
1. 一種制備黃腐酚的方法，其特征在于： a)將一種含黃腐酚的提取物和水混合； b )將一種過渡金屬的鹽溶液加入到所得到的混合物中； c )收集所得黃腐酚沉淀，干燥后得到純度大于90 %黃腐酚。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b中，所述鹽在混合物中的濃度為0.001-10摩爾/升。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟b中，所述鹽在混合物中的濃度為0.001- 0.05摩爾/升。4. 如權利要求1-3中任意一項所述的方法，其特征在于，所述步驟b中，加入鹽溶液后還 包含： bl)堿化溶液到pH值大于7; b2)濾出第一批沉淀，將濾液酸化至pH值低于7; b3 )酸化后的濾液濃縮，得到的黃腐酚的沉淀。5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟bl中，溶液堿化至pH值在7.5-10.5 之間。6. 如權利要求1-5中任意一項所述的方法，其特征在于，含黃腐酚的提取物是通過以一 種能與水混溶的有機溶劑提取萃取后的廢啤酒花、啤酒花、啤酒花植物顆粒或其以上混合 物得到的，所述溶劑用量為每公斤原料使用0.1-10升溶劑。7. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述能與水混溶的有機溶劑選自酮或醇或其 混合物。8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述能與水混溶的有機溶劑選自丙酮、甲醇、 乙醇、丙醇或其中一種或多種的混合物。9. 如權利要求1-8任意一項所述的方法，其特征在于，所述提取的溫度為5-65Γ。10. 如權利要求1-9任意一項所述的方法，其特征在于，所述含黃腐酚的提取物和水的 比例為每升提取物使用0.1-5升水。11. 如權利要求10述的方法，其特征在于，所述含黃腐酚的提取物和水的比例為每升提 取物使用1-3升水。12. 如權利要求1-11任意一項所述的方法，其特征在于，步驟b)中，所述過渡金屬鹽的 濃度為〇. 01-0.05摩爾/升。13. 如權利要求1-12任意一項所述的方法，其特征在于，所述過渡金屬鹽為Cu(II)鹽或 Zn(II)鹽。14. 如權利要求1-12中任意一項所述的方法，其特征在于，所述過渡金屬鹽為氯鹽，硝 酸鹽或硫酸鹽。15. 如權利要求1-14中任意一項所述的方法，其特征在于，所述過渡金屬鹽為CuCl2, CuS〇4，ZnCl2或ZnS〇4。
【文檔編號】C07C49/84GK105829275SQ201480054359
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年9月16日
【發明人】馬里烏什·加戈
【申請人】阿克森生物集團有限公司