輔助鑒別具有不同胸肌系水力雞的方法及其專用引物的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種輔助鑒別具有不同胸肌系水力雞的方法及其專用引物。本發明首先提供了一種輔助鑒別具有不同胸肌系水力的雞方法，是檢測待測雞基于特異SNP的基因型為CC基因型、CT基因型還是TT基因型，CT基因型雞的胸肌系水力高于CC基因型；所述特異SNP為如下(a1)或(a2)：(a1)雞基因組中序列表的序列3所示DNA自5’末端第337位核苷酸；(a2)雞基因組中引物F和引物R的靶序列中自5’末端第337位核苷酸；引物F為序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；引物R為如下(b3)或(b4)：(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子。本發明對于雞的育種具有重要意義，也對于進一步研究雞的系水力形成機理具有重要意義。
【專利說明】
輔助鑒別具有不同胸肌系水力雞的方法及其專用引物
技術領域
[0001] 本發明涉及一種輔助鑒別具有不同胸肌系水力雞的方法及其專用引物。
【背景技術】
[0002] 隨著生活水平的提高、經濟的發展，人們對于雞肉的品質和口味的要求越來越高。 我國作為雞肉的生產和消費大國，在一味追求產肉能力的家禽產業在發展的同時，也面臨 著產肉量增加的同時所帶來的肉質品質下降的觸尬境地。Andersen指出，在肌肉的加工過 程中，系水力是最重要的肉品質指標之一。Otto等人也認為系水力是衡量肉品質的最重要 指標。水分損失的同時會帶來可溶性蛋白質的損失，Savage等人報道每毫升流失的水中約 含有112mg的蛋白質，同時水分損失也會造成可溶性風味物質的流失。而Luciano等指出水 分流失會帶走肌肉中的血紅素，對肉色造成影響。因此，水分的存在對肌肉的物理形態、風 味、肉色等都具有重要的意義。
[0003] 鑒于系水力對肌肉肉質的影響至關重要，在家禽育種工作中，希望選擇系水力高 的個體留種。但雞胸肉的系水力在活體時難以度量，只能依靠同胞或后裔測定選種。測定耗 時，且資金投入大，難應用于育種實踐。因此分子標記的快速發展，為標記輔助選擇的應用 提供了有利條件。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種輔助鑒別具有不同胸肌系水力雞的方法及其專用引物。
[0005] 本發明首先提供了一種輔助鑒別具有不同胸肌系水力的雞方法，是檢測待測雞基 于特異SNP的基因型為CC基因型、CT基因型還是TT基因型，CT基因型雞的胸肌系水力高于CC 基因型；
[0006] 所述特異SNP為如下(al)或(a2):
[0007] (al)雞基因組中序列表的序列3所示DNA自5 '末端第337位核苷酸；
[0008] (a2)雞基因組中引物F和引物R的靶序列中自5'末端第337位核苷酸；
[0009] 引物F為如下(bl)或(b2):
[0010] (bl)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；
[0011] (b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有 相同功能的DNA分子；
[0012] 弓丨物R為如下(b3)或(b4):
[0013] (b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；
[0014] (b4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有 相同功能的DNA分子。
[0015] 所述方法中，具體可采用引物F和引物R組成的特異引物對檢測待測雞基于特異 SNP的基因型。
[0016]所述方法中，具體可采用如下步驟檢測待測雞基于特異SNP的基因型：
[0017] (1)以待測雞的基因組DNA為模板，用引物F和引物R組成的特異引物對進行PCR擴 增，得到PCR擴增產物；
[0018] (2)用限制性內切酶Bfal酶切步驟(1)得到的PCR擴增產物，得到酶切產物;如果酶 切產物只有一種，且為794bp-814bp(具體可為804bp)，待測雞為CC基因型；如果酶切產物為 兩種，分別為463bp-473bp(具體可為468bp)和331bp-341bp(具體可為336bp)，待測雞為TT 基因型；如果酶切產物為三種，分別為794bp-814bp (具體可為804bp)、463bp-473bp (具體可 為468bp)和331bp-341bp (具體可為336bp)，待測雞為CT基因型。
[0019]所述方法中，具體可采用如下步驟檢測待測雞基于特異SNP的基因型：
[0020] (1)以待測雞的基因組DNA為模板，用引物F和引物R組成的特異引物對進行PCR擴 增，得到PCR擴增產物；
[0021] (2)用限制性內切酶Bfal酶切步驟（1)得到的PCR擴增產物，然后進行瓊脂糖凝膠 電泳;如果僅在750-1000bp之間顯示一條帶(在250-500bp之間不顯示條帶），待測雞為CC基 因型；如果僅在250-500bp之間顯示一條帶或兩條帶(在750-1000bp之間不顯示條帶），待測 雞為TT基因型；如果在750-1000bp之間顯示一條帶且在250-500bp之間顯示一條帶或兩條 帶，待測雞為CT基因型。
[0022]所述瓊脂糖凝膠電泳具體可為3%瓊脂糖凝膠電泳。
[0023]本發明還保護特異引物對甲，由兩條引物組成，其擴增產物包括特異DNA分子;所 述特異DNA分子為雞基因組中引物F和引物R的靶序列。
[0024]本發明還保護特異引物對乙，由兩條引物組成，其擴增產物包括特異DNA分子;所 述特異DNA分子如序列表的序列3所示。
[0025] 本發明還保護特異引物對丙，由引物F和引物R組成。
[0026] 所述特異引物對甲、所述特異引物對乙或所述特異引物對丙的用途為:輔助鑒別 具有不同胸肌系水力的雞。
[0027] 本發明還保護一種試劑盒，所述特異引物對甲、特異引物對乙或特異引物對丙。所 述試劑盒還可包括限制性內切酶Bfal。所述試劑盒的用途為:輔助鑒別具有不同胸肌系水 力的雞。
[0028] 本發明還保護特異引物對甲、特異引物對乙、特異引物對丙或所述試劑盒的應用， 所述應用為輔助鑒別具有不同胸肌系水力的雞。
[0029] 本發明還保護一種雞的育種方法，是選擇以上任一所述方法鑒別得到的CT基因型 的雞進行育種。
[0030] 本發明發現了一個和雞的胸肌系水力緊密相關的單核苷酸多態位點，并基于該多 態設計了特異性引物對以及用該引物對檢測該多態的PCR-RFLP方法。基于該單核苷酸多態 位點的基因型與雞的胸肌系水力顯著相關。用本發明的方法，可以快速簡便的鑒定待測雞 基于該單核苷酸多態位點的基因型。應用本發明的方法可以輔助篩選具有高胸肌系水力的 雞，具有快速、簡便、可以早期篩選等優點，對于雞的育種具有重要意義，也對于進一步研究 雞的系水力形成機理具有重要意義。
【附圖說明】
[0031] 圖1為部分PCR擴增產物的電泳圖。
[0032] 圖2為部分Bfal酶切產物的電泳圖。
【具體實施方式】
[0033] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0034] 明星肉雞：中國農業大學動物科技學院實驗雞場。壽光雞：中國農業大學動物科技 學院實驗雞場。北京油雞：中國農業大學動物科技學院實驗雞場。農大褐蛋雞：中國農業大 學動物科技學院實驗雞場。藏雞：中國農業大學動物科技學院實驗雞場。青腳矮小型隱性白 羽雞：中國農業大學動物科技學院實驗雞場。提及明星肉雞的文獻:楊永升、鄧學梅、李寧、 傅衍、朱睦元、吳常信，MC1R是控制雞黑色素形成的候選主效基因，生物化學與生物物理進 展，2004,31(6)，500-505。提及農大褐蛋雞的文獻:寧中華、吳常信，矮小型褐殼蛋雞育種的 理論與實踐。
[0035]實施例1、檢測雞胸肌系水力的方法的建立及其效果驗證
[0036] 試驗雞群為(共計120只）：明星肉雞雞群(40只母雞）、壽光雞雞群(20只母雞）、北 京油雞雞群(20只母雞）、農大褐蛋雞雞群(20只母雞)和藏雞雞群(20只母雞）。
[0037] 一、雞胸肌滴水損失的測定
[0038]分別檢測試驗雞群中的每個個體的胸肌的滴水損失率，具體如下：
[0039] 在140日齡時進行屠宰，取其右側胸大肌約80-100g，稱取重量(失水前的重量W1)， 再將肉樣放入一個小網兜之中，將裝有肉樣的網兜放入一只塑料袋中并使塑料袋充滿空 氣，然后扎好袋口并懸掛24小時（網兜需要處于懸空狀態，不能讓它碰到塑料袋內壁），然后 取出肉樣(取出過程同樣不能使肉樣碰到塑料袋內壁)稱取重量(失水后重量W2)。滴水損失 率(DL) = (W1-W2)/W1 X 100%。
[0040]系水力用滴水損失率數據體現。滴水損失率越高，表示系水力越低。滴水損失率越 低，表示系水力越高。
[0041 ] 二、基因型分型
[0042]分別檢測試驗雞群中的每個個體基于特異SNP的基因型，具體如下：
[0043] 1、取靜脈血，提取基因組DNA。
[0044] 2、以步驟1得到的基因組DNA為模板，采用F和R組成的引物對進行PCR擴增，得到 PCR擴增產物。
[0045] F(序列表中序列1): 5 ' -TGGCATTAAGAGCGTGTAAC-3 ' ；
[0046] R(序列表中序列2) :5'-ATGAATCTCGCTGAGGTGA-3'。
[0047] PCR擴增的反應條件:95°C預變性5min;95°C變性3〇8、60°(：退火3〇8、72°(：延伸3〇8， 35個循環;72°C延伸7min;4°C保存。
[0048]結果表明，以120個個體的基因組DNA為模板均擴增得到約804bp的DNA片段。部分 個體的結果見圖1，泳道M為DM2000Plus Marker，泳道1~8分別為不同個體的PCR擴增產物。 [0049]將各個PCR擴增產物進行測序，均為804bp。測序結果表明，120個個體的PCR擴增產 物均如序列表的序列3所示。PCR擴增產物中，存在一個單核苷酸多態(存在于序列3自5'末 端第337位核苷酸），為C/T變異，將該SNP命名為特異SNP。基于該特異SNP，120個個體中，54 只雞為CC基因型，30只雞為TT基因型，36只雞為CT基因型。
[0050] 3、取步驟2得到的PCR擴增產物，用限制性內切酶Bf al進行酶切(限制性內切酶Bfa I的識別序列與切割位點為:C/TAG)，然后進行3%瓊脂糖凝膠電泳。
[0051 ] 酶切的反應體系:PCR擴增產物10yL，BfaI內切酶(NEB)0.5此，10 Xbuffer 2此，加 雙蒸水至20此。酶切的反應條件:37°C、4~6h。
[0052]結果表明，120個個體的PCR擴增產物酶切后顯示三種帶型。部分個體的結果見圖 2，M為DM2000plus; 1~3分別為不同個體的PCR擴增產物的酶切產物。
[0053] 4、步驟2的結果和步驟3的結果的聯合分析
[0054] CC基因型雞的PCR擴增產物只有一種，不能被Bfal酶切，電泳顯示804bp的一條帶 (位于750bp-1000bp的分子量標記之間），帶型如圖2的泳道2所示。TT基因型雞的PCR擴增產 物只有一種，可以被Bfal酶切，電泳顯示468bp和336bp的兩條帶（由于瓊脂糖檢測的分辨率 低，兩條帶并未分開，只在250_500bp的分子量標記之間出現一條帶），帶型如圖2的泳道3所 示。CT基因型雞的PCR擴增產物有兩種，一種可以被Bfal酶切（電泳顯示468bp和336bp的兩 條帶），另一種不能被Bfal酶切（電泳顯示804bp的一條帶），帶型如圖2的泳道1所示。
[0055]三、關聯分析
[0056]對基因型與滴水損失率進行關聯分析，結果如表1所示。
[0057]表1不同基因型之間滴水損失率均值的多重比較結果
[0059] 注：同行肩注無相同字母代表差異顯著(p〈0.01)，有相同字母表示差異不顯著(p> 0.05);結果均為該基因型所有樣本的平均值。
[0060] 不同基因型的效應差異顯著。CC基因型的滴水損失率顯著高于CT基因型（P〈 0.01)，而TT基因型的滴水損失率與CC基因型和CT基因型的差異不顯著（P>0.05)。結果表 明，CT基因型個體的胸肌系水力大于CC基因型個體。
[0061 ]實施例2、壽光雞母雞胸肌系水力與SNP基因型關聯的檢驗 [0062]試驗雞群為(共計20只）：壽光雞母雞。
[0063] 一、雞胸肌滴水損失的測定
[0064] 分別檢測試驗雞群中的每個個體的胸肌的滴水損失率，方法同實施例1的步驟一。
[0065] 二、基因型分型
[0066]分別檢測試驗雞群中的每個個體基于特異SNP的基因型，具體如下：
[0067] 1、取靜脈血，提取基因組DNA。
[0068] 2、同實施例1的步驟二的2。
[0069] 結果表明，以20個個體的基因組DNA為模板均擴增得到約804bp的DNA片段。
[0070]將各個PCR擴增產物進行測序，均為804bp。測序結果表明，20個個體的PCR擴增產 物均如序列表的序列3所示。基于所述特異SNP，20個個體中，5只雞為CC基因型，5只雞為TT 基因型，10只雞為CT基因型。
[0071] 3、同實施例1的步驟二的3。
[0072] 結果表明：CC基因型雞的PCR擴增產物只有一種，不能被Bfal酶切，電泳顯示804bp 的一條帶(位于750bp-1000bp的分子量標記之間）；TT基因型雞的PCR擴增產物只有一種，可 以被Bfal酶切，電泳顯示468bp和336bp的兩條帶（由于瓊脂糖檢測的分辨率低，兩條帶并未 分開，只在250-500bp的分子量標記之間出現一條帶）；CT基因型雞的PCR擴增產物有兩種， 一種可以被Bfal酶切（電泳顯示468bp和336bp的兩條帶），另一種不能被Bfal酶切（電泳顯 示804bp的一條帶）。
[0073]三、關聯分析
[0074]對基因型與滴水損失率進行關聯分析，結果如表2所示。
[0075]表2壽光雞母雞群體中不同基因型之間滴水損失率均值的多重比較結果
[0077]注：同行肩注無相同字母代表差異顯著(p〈0.05)，有相同字母表示差異不顯著(p> 0.05);結果均為該基因型所有樣本的平均值。
[0078]在壽光雞母雞群體中所述特異SNP的不同基因型對胸肌系水力的效應差異顯著。 CC基因型的滴水損失率顯著高于CT基因型(？〈0.05)，1'1'基因型的滴水損失率與0：基因型和 CT基因型的差異不顯著(P>0.05)。結果表明，可以在群體中選擇CT型個體，減少胸肌的滴水 損失，即提高胸肌的系水力，獲得更好的胸肌品質。
[0079]實施例3、青腳矮小型隱性白羽雞公雞胸肌系水力與SNP基因型關聯的檢驗 [0080]試驗雞群為(共計30只）：青腳矮小型隱性白羽雞公雞。
[0081] -、雞胸肌滴水損失的測定
[0082] 分別檢測試驗雞群中的每個個體的胸肌的滴水損失率，方法同實施例1的步驟一。 [0083] 二、基因型分型
[0084]分別檢測試驗雞群中的每個個體基于特異SNP的基因型，具體如下：
[0085] 1、取靜脈血，提取基因組DNA。
[0086] 2、同實施例1的步驟二的2。
[0087]結果表明，以30個個體的基因組DNA為模板均擴增得到約804bp的DNA片段。
[0088]將各個PCR擴增產物進行測序，均為804bp。測序結果表明，30個個體的PCR擴增產 物均如序列表的序列3所示。基于所述特異SNP，30個個體中，10只雞為CC基因型，10只雞為 TT基因型，10只雞為CT基因型。
[0089] 3、同實施例1的步驟二的3。
[0090] 結果表明：CC基因型雞的PCR擴增產物只有一種，不能被Bfal酶切，電泳顯示804bp 的一條帶(位于750bp-1000bp的分子量標記之間）；TT基因型雞的PCR擴增產物只有一種，可 以被Bfal酶切，電泳顯示468bp和336bp的兩條帶（由于瓊脂糖檢測的分辨率低，兩條帶并未 分開，只在250-500bp的分子量標記之間出現一條帶）；CT基因型雞的PCR擴增產物有兩種， 一種可以被Bfal酶切（電泳顯示468bp和336bp的兩條帶），另一種不能被Bfal酶切（電泳顯 示804bp的一條帶）。
[0091] 三、關聯分析
[0092] 對基因型與滴水損失率進行關聯分析，結果如表3所示。
[0093] 表3青腳矮小型隱性白羽雞公雞群體不同基因型之間滴水損失率均值的多重比較 結果
[0095]注：同行肩注無相同字母代表差異顯著(p〈0.05)，有相同字母表示差異不顯著(p> 0.05);結果均為該基因型所有樣本的平均值。
[0096]在青腳矮小型隱性白羽雞公雞群體中所述SNP的不同基因型對胸肌系水力的效應 差異顯著。CC基因型的滴水損失率顯著高于CT基因型(P〈0.05)，TT基因型的滴水損失率與 CC基因型和CT基因型的差異不顯著(P>0.05)。結果表明，可以在群體中選擇CT型個體，減少 胸肌的滴水損失，即提高胸肌的系水力，獲得更好的胸肌品質。
【主權項】
1. 一種輔助鑒別具有不同胸肌系水力的雞方法，是檢測待測雞基于特異SNP的基因型 為CC基因型、CT基因型還是TT基因型，CT基因型雞的胸肌系水力高于CC基因型； 所述特異SNP為如下(a 1)或(a2): (al)雞基因組中序列表的序列3所示DNA自5 '末端第337位核苷酸； (a2)雞基因組中引物F和引物R的靶序列中自5 '末端第337位核苷酸； 所述引物F為如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物R為如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (b4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，采用所述引物F和所述引物R組 成的特異引物對檢測待測雞基于所述特異SNP的基因型。3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，采用如下步驟檢測待測雞基于 所述特異SNP的基因型： (1) 以待測雞的基因組DNA為模板，用所述引物F和所述引物R組成的特異引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物； (2) 用限制性內切酶Bfal酶切PCR擴增產物，得到酶切產物;如果酶切產物只有一種，且 為794bp-814bp，待測雞為CC基因型；如果酶切產物為兩種，分別為463bp-473bp和331bp-341bp，待測雞為TT基因型；如果酶切產物為三種，分別為794bp-814bp、463bp-473bp和 331bp-341bp，待測雞為CT基因型。4. 如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述方法中，采用如下步驟檢測待測雞基于 所述特異SNP的基因型： (1) 以待測雞的基因組DNA為模板，用所述引物F和所述引物R組成的特異引物對進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物； (2) 用限制性內切酶Bfal酶切PCR擴增產物，然后進行瓊脂糖凝膠電泳；如果僅在750-lOOObp之間顯示一條帶，待測雞為CC基因型；如果僅在250-500bp之間顯示一條帶，待測雞 為TT基因型；如果在750-1000bp之間顯示一條帶且在250-500bp之間顯示一條帶，待測雞為 CT基因型。5. 特異引物對甲，由兩條引物組成，其擴增產物包括特異DNA分子;所述特異DNA分子為 雞基因組中引物F和引物R的靶序列； 所述引物F為如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物R為如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (b4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子。6. 特異引物對乙，由兩條引物組成，其擴增產物包括特異DNA分子;所述特異DNA分子如 序列表的序列3所示。7. 特異引物對丙，由引物F和引物R組成； 所述引物F為如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (b2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物R為如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (b4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子。8. -種試劑盒，包括權利要求5所述特異引物對甲、權利要求6所述所述特異引物對乙 或權利要求7所述所述特異引物對丙。9. 權利要求5所述特異引物對甲、權利要求6所述所述特異引物對乙、權利要求7或權利 要求8所述試劑盒的應用，所述應用為輔助鑒別具有不同胸肌系水力的雞。10. -種雞的育種方法，包括如下步驟:選擇權利要求1至4中任一所述方法鑒別得到的 CT基因型的雞進行育種。
【文檔編號】C12N15/11GK105821142SQ201610347688
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】鄧學梅, 葛雅瓊, 秦昊, 高強
【申請人】中國農業大學