血糖儀在快速檢測環境污染物生物毒性中的應用
【專利摘要】本發明公開血糖儀在快速檢測環境污染物生物毒性中的應用，其檢測方法包括如下步驟：1)制備微生物菌液；2)將微生物菌液、葡萄糖溶液、培養基和待測樣本混合并孵育；3)用血糖儀檢測待測樣本中葡萄糖的濃度；4)評價待測樣本的生物毒性。血糖儀用于樣品中葡萄糖濃度檢測時具有檢測時間短、成本低廉、便于操作等特點。因而血糖儀結合微生物用于樣本生物毒性的檢測，具有省時，經濟，易于操作的特點，且為生物毒性檢測的提供了新的途徑，同時還為污水和污染土壤的治理方案確定提供依據。
【專利說明】
血糖儀在快速檢測環境污染物生物毒性中的應用
技術領域
[0001] 本發明涉及急性生物毒性檢測領域，尤其是涉及基于微生物對葡萄糖消耗的程 度，利用血糖儀快速檢測環境污染物的生物毒性。
【背景技術】
[0002] 隨著環境污染問題的日漸突出，生物毒性檢測，尤其是生物毒性的快速檢測，其重 要性愈發凸顯。傳統上用魚和水蚤來檢測生物毒性，但往往響應慢、耗時長、費用高。微生 物繁殖速度快，價格低廉，是檢測生物毒性的理想材料。
[0003] 目前利用微生物檢測環境污染物生物毒性的方法可分為兩大類：比色法和電化學 法。
[0004] 顧名思義，比色法根據色度的深淺判斷生物毒性的相對大小，最成功的范例是 Microtox?.和 Toxi-Chromo test?。Microtox'利用的是費希爾弧菌（Vibrio fischeri)。 費希爾弧菌是發光細菌的一種，主要生存在海水環境中，能天然發出熒光。當有毒物質存在 時，其所發出的熒光的強度減弱，因而根據熒光的強弱即可判斷出某一物質毒性的相對大 小。Toxi-Chromo_test?_;利用誘導過的大腸桿菌。誘導過的大腸桿菌能表達半乳糖苷 酶，該酶對重金屬離子有較高的敏感度，并且能水解特定的底物進而產生顏色。當有毒物質 存在時，0 _半乳糖苷酶被抑制，從而被水解的底物量減少，形成的顏色較淺，根據顏色的深 淺即可判斷出某一物質生物毒性的相對大小。盡管MicrotOX?和Toxi-Chromo test?.均 已商業化，但仍然只存在很大的限制：首先，需要專門的分光光度計，成本高，不利于廣泛應 用；其次，費希爾弧菌菌種稀有，價格昂貴。大腸桿菌的誘導過程復雜，對操作人員也存在潛 在的安全風險。
[0005] 電化學法主要利用苯醌、鐵氰化鉀等電子介體。電子介體能參與微生物的呼吸作 用被還原，還原態的電子介體在電極表面氧化產生氧化電流。有毒物質的存在會抑制微生 物的呼吸作用，從而被還原的電子介體量減少，導致最終的氧化電流降低。因此，根據氧化 電流的大小可以判斷某一物質生物毒性的相對大小。但電化學方法需要電化學工作站等專 業儀器，價格昂貴。同時，電化學法要求操作人員對電化學知識有一定的了解，并且對電化 學工作站有較高的熟練度。這些都限制了電化學方法的應用和推廣。
[0006] 因此，需要提供一種成本低廉，易于操作的檢測環境污染物急性生物毒性的方法。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于提供一種血糖儀在快速檢測環境污染物生物毒性中的應用。
[0008] 優選地，血糖儀為便攜式血糖儀，更優選為商業化的便攜式血糖儀。
[0009] 血糖儀在檢測環境污染物生物毒性中的應用，其檢測方法包括如下步驟：
[0010] 1)制備微生物菌液；
[0011] 2)將微生物菌液、葡萄糖溶液、培養基和待測樣本混合并孵育；
[0012] 3)用血糖儀檢測待測樣本中葡萄糖的濃度；
[0013] 4)評價待測樣本的生物毒性。
[0014] 所述微生物為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌或真菌；其中所述革蘭氏陰性菌為大 腸桿菌、嗜冷桿菌、亞硝化單胞菌，優選為大腸桿菌；所述革蘭氏陽性菌為枯草芽孢桿菌、變 形桿菌、放線菌，優選為枯草芽孢桿菌；所述真菌為酵母菌、白色念珠菌、白色隱形菌，優選 為酵母菌。
[0015] 其中制備微生物菌液的方法包括：
[0016] 1)將微生物接種于培養基中培養至對數生長期；
[0017] 2)收集菌體，獲得菌體沉淀；
[0018] 3)洗滌菌體沉淀；
[0019] 4)用分散液分散菌體沉淀。
[0020] 上述方法中，培養微生物的培養基為本領域所公知的適于微生物生長的培養基， 例如大腸桿菌接種的培養基為LB培養基、S0B培養基或S0C培養基等，優選LB培養基；所述 枯草芽孢桿菌的培養基為牛肉膏蛋白胨培養基、LBG培養基，優選為牛肉膏蛋白胨培養基； 所述酵母菌的培養基為YH)培養基、YPED培養基、YPEG培養基等，優選YH)培養基。
[0021] 進一步地，培養微生物的條件也是本領域公知的，包括但不限于，大腸桿菌的培養 條件為37°C于LB培養基中培養16h ;枯草芽孢桿菌的培養條件為37°C于牛肉膏蛋白胨培 養基培養24小時；酵母菌的培養條件為30°C于YH)培養基中培養16小時。
[0022] 在上述方法中，優選地，用離心法收集培養的菌體，以獲得菌體沉淀。
[0023] 菌體沉淀的洗滌溶液可采用常規的緩沖液，以去除菌體培養中可能影響后續測試 結果的物質。如磷酸緩沖液、Tris-Hcl緩沖液、HEPEs緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液或氯化鈉 溶液。優選地，所述洗滌溶液為〇. 85%的氯化鈉溶液、PBS溶液、TBS溶液或TBE溶液。
[0024] 優選地，所述分散液為水溶液、氯化鈉溶液或培養基，優選為水溶液。
[0025] 葡萄糖是大部分微生物生長所必需的營養物質。有毒物質的存在會抑制微生物的 生長和繁殖，使得微生物對葡萄糖的消耗量降低。因此，根據葡萄糖消耗量的多少，即可判 斷出某一物質毒性的相對大小。血糖儀是目前已大規模生產推廣的專門用于人體血液中葡 萄糖含量的便攜式設備，能夠快速的檢測血液中葡萄糖的濃度，因而我們提出利用血糖儀 檢測待測樣品中的葡萄糖濃度，優選地用商業化的血糖儀檢測污染物對菌體的生物毒性。
[0026] 優選地，用抑制率評價待測樣本中生物毒性，抑制率的計算公式如下所示：抑制率 (% ) = (Nc-Ne)/NcX100%
[0027] 其中Ne為第一待測樣本的葡萄糖濃度，Ne為第二待測樣本的葡萄糖濃度。
[0028] 第一待測樣本和第二待測樣本的孵育時間與孵育溫度相同。優選地，檢測環境污 染物生物毒性的方法所用的微生物為大腸桿菌或枯草芽孢桿菌時，孵育溫度為37°C ;優選 地，檢測環境污染物生物毒性的方法所用的微生物為真菌時，孵育溫度為30°C。
[0029] 優選地孵育時間為30-90分鐘。優選地，微生物為大腸桿菌時，孵育時間為60分 鐘；優選地，微生物為枯草芽孢桿菌時，孵育時間為30-90分鐘；優選地，微生物為真菌時， 孵育時間為30-90分鐘。
[0030] 當第一待測樣本和第二待測樣本為不同的環境污染物樣本時，抑制率表示環境污 染物間生物毒性的相對大小。
[0031] 第一待測樣本可為對照樣本，所述對照樣本是指將微生物菌液、葡萄糖溶液、培養 基和對照溶液混合并孵育，其中對照溶液為水溶液、培養基、氯化鈉溶液，優選為水溶液。此 時抑制率表示的是第二待測樣本相對于對照樣本的生物毒性的大小。
[0032] 另外本方法也可用于檢測不同物質的生物毒性，可將待測物質配置成不同濃度 的待測樣本，檢測不同待測樣本的葡萄糖濃度，并計算每個樣本的抑制率，繪制葡萄糖 濃度-抑制率的曲線，根據抑制率曲線，可以算出最大半數抑制濃度IC 5。(maximum half inhibition concentration)，即當抑制率為50 %時物質的濃度。IC5。是評價某一物質生物 毒性大小的重要指標。
[0033] 所述環境污染物為有機污染物、無機污染物或二者的混合物；優選地，所述無機污 染物是可溶于水的無機化合物，如重金屬鹽、無機酸、無機堿等有毒物質；優選地，所述有機 污染物是難溶于水的有機化合物，如苯、苯酚、鄰苯基苯酚、二氯苯酚等。
[0034] 另外，本發明還可用于被治理污水的生物毒性的檢測，污水中含有多種生物毒性 物質，如重金屬、有機污染物等。現在污水的治理包括用水生動物來改善水質，但是當污水 的生物毒性高時，投放水生動物無法存活，不但不能凈化污水還會造成經濟上的浪費，因而 當污水的生物毒性達到合理的范圍時，投放水生動物才能達到進一步改善水質的目的。本 發明的方法能夠非常方便快捷的檢測污水的生物毒性，為污水治理方案的確定提供支持。
[0035] 不僅如此，本發明還可用于被污染土壤的生物毒性的檢測。受污染土壤中含有多 種生物毒性物質，如重金屬離子、有機污染物等。目前土壤修復包括植物吸附、微生物修復、 生物聯合修復等方法。但這些方法只能在量上告知土壤中污染物的含量修復到了何種程 度，而不能告訴人們土壤修復到不同程度時所對應的毒性。因此，通過土壤的生物毒性，能 進一步指導土壤的修復工作，將土壤的修復程度及其對生物的影響結合起來，為土壤修復 提供更多的參考信息。
[0036] 本發明的有益效果如下：
[0037] 本發明利用了目前已商業化使用的血糖儀對樣品中葡萄糖的含量進行檢測。血糖 儀用于樣品中葡萄糖濃度檢測時具有檢測時間短、成本低廉、便于操作等特點。因而血糖儀 結合微生物用于樣本生物毒性的檢測，具有省時，經濟，易于操作的特點，且為生物毒性檢 測的提供了新的途徑，同時還為污水的治理方案確定提供依據。
【附圖說明】
[0038] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0039] 圖1示出實施例1中基于微生物和商業化便攜式血糖儀檢測環境污染物生物毒性 的可行性驗證。
[0040] 圖2示出實施例2中檢測不同濃度Cd2+對大腸桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0041] 圖3示出實施例3中檢測不同濃度As2+對大腸桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0042] 圖4示出實施例4中檢測不同濃度Pb2+對大腸桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0043] 圖5示出實施例5五中檢測不同濃度3, 5-二氯苯酚對大腸桿菌生物毒性的抑制 率曲線。
[0044] 圖6示出實施例6中檢測不同濃度鄰苯基苯酚對大腸桿菌生物毒性的抑制率曲 線。
[0045] 圖7示出實施例7中檢測不同濃度苯酚對大腸桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0046] 圖8示出實施例8中檢測不同濃度Cd2+對枯草芽孢桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0047] 圖9示出實施例9中檢測不同濃度Pb2+對枯草芽孢桿菌生物毒性的抑制率曲線。
[0048] 圖10示出實施例10中檢測不同濃度苯酚對枯草芽孢桿菌生物毒性的抑制率曲 線。
[0049] 圖11示出實施例11中檢測不同濃度鄰苯基苯酚對枯草芽孢桿菌生物毒性的抑制 率曲線。
[0050] 圖12示出實施例12中檢測不同濃度3, 5-二氯苯酚對酵母菌生物毒性的抑制率 曲線
[0051] 圖13示出實施例13中檢測不同濃度鄰苯基苯酚對酵母菌生物毒性的抑制率曲線
[0052] 圖14示出實施例14中檢測不同污水樣本對大腸桿菌生物毒性的抑制率
[0053] 圖15示出實施例15中檢測不同土壤樣本對大腸桿菌生物毒性的抑制率
【具體實施方式】
[0054] 為了更清楚地說明本發明，下面結合優選實施例和附圖對本發明做進一步的說 明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具 體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發明的保護范圍。
[0055] 實施例1 :大腸桿菌與血糖儀檢測Cu2+的生物毒性
[0056] 大腸桿菌（ATCC 25922)在37°C于LB培養基中培養16小時，其中LB培養基的配 置方法如下：取0. 5g牛肉膏、lg蛋白胨和0. 5g氯化鈉溶于100mL去離子水中，調節pH至 7. 0-7. 4,于高壓蒸汽滅菌中120°C滅菌20min，自然冷卻。
[0057] 離心收集大腸桿菌，6000轉/分離心6min收集菌體；洗滌收集的大腸桿菌，用 0. 85%氯化鈉溶液將菌體重懸進行清洗，再以5000轉/分離心5min收集菌體，重復一次 上述的清洗操作；最后將清洗后得到菌體分散于〇. 85%氯化鈉溶液中，得到濃度為0D_ = 2. 5的菌液。
[0058] 取5個體積為1. 5ml的離心管，分別編號為1、2、3、4、5。其中1作為對照樣本（即 不加任何毒物，但加入與有毒物質相同體積的氯化鈉溶液），其余均為測試管。依次向各管 中加入100 y L的LB培養基，10 y L葡萄糖溶液（2% w/V)，80 y L濃度為0D6M= 2. 5大腸桿 菌菌液和10 y L不同濃度的Cu2+溶液。使各離心管中Cu 2+的終濃度依次為0、2、4、6、8mg/ L。將各離心管置于37°C恒溫培養箱中60分鐘，然后用商業化便攜式血糖儀檢測各離心管 中葡萄糖的濃度。根據濃度的差異，即可算出不同濃度的Cu 2+對大腸桿菌生長繁殖的抑制 率，進而得知Cu2+生物毒性的相對大小。
[0059] 實施例1的結果顯示，隨著銅離子濃度的增大，樣品中葡萄糖濃度也逐步升高，表 明Cu 2+對大腸桿菌的生長繁殖存在抑制作用，使得其對葡萄糖的消耗量降低，即抑制率在 升高。這也表明基于微生物和商業化便攜式血糖儀檢測環境污染物的生物毒性是可行的。
[0060] 實施例2 :大腸桿菌與血糖儀檢測Cd2+的生物毒性
[0061] 按照實施例1的方法檢測Cd2+對大腸桿菌的生物毒性。Cd2+終濃度分別為0、5、10、 15、20、25mg/L時造成的抑制率分別為0、18%、35%、53%、59%、65%，并算得0(1 2+的1(：5。為 14.2mg/L〇
[0062] 實施例3 :大腸桿菌與血糖儀檢測As2+的生物毒性
[0063] 按照實施例1的方法檢測As2+對大腸桿菌的生物毒性。As 2+終濃度分別為0、1、2、 3、4、5、6、7mg/L 時造成的抑制率分別為 0、10%、15%、30%、40%、50%、60%、83%，并算得 As2+的 1C 5。為 5mg/L。
[0064] 實施例4 :大腸桿菌與血糖儀檢測Pb2+的生物毒性
[0065] 按照實施例1的方法檢測Pb2+對大腸桿菌的生物毒性。Pb 2+終濃度分別為0、 25、50、75、100、125、150、175mg/L 時造成的抑制率分別為 0、16%，21%、27%、37%、42%、 53%、68%，并算得？132+的1(：5。為14311^/1。
[0066] 實施例5 :大腸桿菌與血糖儀檢測3, 5-對氯苯酚的生物毒性
[0067] 按照實施例1的方法檢測3, 5-對氯苯酸對大腸桿菌的生物毒性。3, 5-對氯苯酸 終濃度為〇、5、10、15、20mg/L時造成的抑制率分別為0、13. 7%、36.4%、59%、72. 7%，可算 得3, 5-對氯苯酚的IC5。為13mg/L。
[0068] 實施例6 :大腸桿菌與血糖儀檢測鄰苯基苯酚的生物毒性
[0069] 按照實施例1的方法檢測鄰苯基苯酸對大腸桿菌的生物毒性。鄰苯基苯酸終 濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35、40、45mg/L時造成的抑制率分別為0、5. 9%、12%、 17. 6%、23. 5%、30%、41. 2%、52. 9%、71%、82%，并算得鄰苯基苯酚的1(：5。為33.711^/1。
[0070] 實施例7 :大腸桿菌與血糖儀檢測苯酚的生物毒性
[0071] 按照實施例1的方法檢測苯酚對大腸桿菌的生物毒性。苯酚終濃度分別為0、 10、20、40、60、80、120mg/L 時造成的抑制率分別為 0、4. 2%、16. 7%、33. 3%、41. 7%、50%、 62. 5 %、75 %，并算得苯酚的IC5。為80mg/L。
[0072] 實施例8 :枯草芽孢桿菌與血糖儀檢測Cd2+的生物毒性
[0073] 枯草芽孢桿菌（CGMCC 1. 1086)在37°C于牛肉膏蛋白胨培養基中培養24小時， 其中枯草芽孢桿菌培養基的配置方法如下：取lg蛋白胨、〇. 3g牛肉膏和0. 5g氯化鈉溶于 100ml去離子水中，調節pH至7. 0-7. 4,于高壓蒸汽滅菌中120°C滅菌20min，自然冷卻。
[0074] 離心收集枯草芽孢桿菌，6000轉/分離心6min收集菌體；洗滌收集的枯草芽孢桿 菌，用PBS溶液將菌體重懸進行清洗，再以5000轉/分離心5min收集菌體，重復一次上述 的清洗操作；最后將清洗后得到菌體分散于〇. 85%氯化鈉溶液中，得到濃度為0D_= 2. 5 的菌液。
[0075] 檢測Cd2+對枯草芽孢桿菌的生物毒性。取7個體積為1. 5mL的離心管，分別編號 為1、2、3、4、5、6、7,其中1作為對照樣本（即不加任何毒物，，但加入與有毒物質相同體積的 水），其余均為測試組。依次向各個離心管中加入100 y L的培養液，10 y L葡萄糖溶液（2% W/V)，80 y L濃度為0D_= 2. 5的枯草芽孢桿菌菌液和10 y L不同濃度的Cd 2+溶液。使最 終各離心管中Cd2+的終濃度依次為0、5、10、15、20、25、30mg/L。將各離心管置于37°C恒溫 培養箱中60分鐘，然后用商業化便攜式血糖儀檢測各離心管中葡萄糖的濃度，根據濃度的 差異，即可算出不同濃度的Cd 2+對大腸桿菌生長繁殖的抑制率，上述不同的Cd2+算得的抑制 率分別為 〇、9. 3%、10%、14%、16. 3%、18. 6%、21%。
[0076] 實施例9 :枯草芽孢桿菌與血糖儀檢測Pb2+的生物毒性
[0077] 按照實施例8的方法檢測Pb2+對枯草芽孢桿菌的生物毒性。Pb 2+的終濃度分別 為0、30、60、90、120、150、18011^/1時造成的抑制率分別為0、11.6%、14%、25.6%、34.9%、 48. 9 %、53. 5 %，并算得 Pb2+的 1C 5。為 157mg/L。
[0078] 實施例10 :枯草芽孢桿菌與血糖儀檢測苯酚的生物毒性
[0079] 按照實施例8的方法檢測苯酚對枯草芽孢桿菌的生物毒性。苯酚的終濃度分別 為0、10、20、40、60、80、100、12011^/1時造成的抑制率分別為0,6.4%、8.5%、12.8%、17%、 19. 1%、20%、21. 3%〇
[0080] 實施例11 :枯草芽孢桿菌與血糖儀檢測鄰苯基苯酚的生物毒性
[0081] 按照實施例8的方法檢測鄰苯基苯酚對枯草芽孢桿菌的生物毒性。鄰苯基苯酚 的終濃度分別為0、10、20、30、40、50、60mg/L時造成的抑制率分別為0、10.6%、15%、17%、 19. 1%、21. 3%、23. 4%〇
[0082] 實施例12 :酵母與血糖儀檢測3, 5-二氯苯酚的生物毒性
[0083] 酵母（S288C)在30°C于YH)培養基中培養16小時，其中YH)培養基的配置方法 如下：分別將含2%葡萄糖溶液和含1 %酵母提取物溶液于高壓蒸汽滅菌鍋中120°C滅菌 20min，自然冷卻，然后將二者在無菌條件下混合。
[0084] 離心收集酵母，6000轉/分離心6min收集菌體；洗滌收集的酵母菌，用TBS溶液 將菌體重懸進行清洗，再以5000轉/分離心5min收集菌體，重復一次上述的清洗操作；最 后將清洗后得到菌體分散于〇. 85%氯化鈉溶液中，得到濃度為0D_= 2. 5的菌液。
[0085] 檢測3, 5-二氯苯酚對酵母菌的生物毒性。取7個體積為1. 5mL的離心管，分別編 號為1、2、3、4、5。其中1作為對照樣本（即不加任何毒物，但加入與有毒物質相同體積的 水），其余均為測試管。依次向各個離心管中加入100 yL的培養液，10 yL葡萄糖溶液（2% W/V)，80 y L濃度為0D_= 2. 5的酵母菌菌液和10 y L不同濃度的3, 5-二氯苯酚溶液。使 各離心管中3, 5-二氯苯酸的最終濃度依次為0、5、10、15、20mg/L。將各離心管置于30°C 恒溫培養箱中16小時，上述不同3, 5-二氯苯酚的濃度造成的抑制率分別為0、26%、39%、 52 %、78 %，并算得 3, 5-二氯苯酚的 IC5。為 14. 2mg/L。
[0086] 實施例13 :酵母與血糖儀檢測鄰苯基苯酚的生物毒性
[0087] 按照實施例12的方法檢測鄰苯基苯酸對酵母菌的生物毒性。鄰苯基苯酸的濃度 分別為 〇、10、20、30、40、50、60mg/L 時造成的抑制率分別為 0、17. 4 %、26 %、30 %、39. 1 %、 43. 5 %、52. 1 %，并可算得鄰苯基苯酚的IC5。為57. 6mg/L。
[0088] 由上述實施例可見，大腸桿菌、枯草桿菌和酵母可與血糖儀聯用來檢測重金屬和 有機化合物的生物毒性。
[0089] 實施例14 :環境污染物的檢測（污水）
[0090] 大腸桿菌的菌液制備如實施例1。
[0091] 從垃圾填埋場、化學實驗室無機廢液桶、電鍍廠分別取得污水10mL。取6個樣品 管，分別標記為1、2、3、4，1號為對照管，2-4號管為污水待測樣本管，依次向各管中加入 100 y L的LB培養基，10 y L葡萄糖溶液（2% w/V)，80 y L濃度為0D600 = 2. 5的大腸桿菌 菌液，在1號管中加入10 y L蒸餾水，在2-4號管中依次加入10 y L從垃圾填埋場、化學實 驗室無機廢液桶、電鍍廠取得的污水。將各離心管置于37°C恒溫培養箱中60分鐘，然后用 商業化便攜式血糖儀檢測各離心管中葡萄糖的濃度。根據濃度的差異，即可算出不同污水 樣本對大腸桿菌生長繁殖的抑制率，分別為20%、32%和60%，進而得知不同污水樣本的 生物毒性，同時通過對比不同污水樣本中葡萄糖濃度，可以比較不同污水樣本生物毒性的 尚低。
[0092] 實施例15 :環境污染物的檢測
[0093] 大腸桿菌的菌液制備如實施例1。
[0094] 從北京北四環某加油站、北京某試驗田、海南某礦區附近分別取得污染土壤 5g(分別編號為樣品1、樣品2、樣品3)，將其分別加入1、2、3號10ml的容量瓶，加入蒸 餾水定容至l〇ml，顛倒混勻以充分溶解土壤中的污染物質；然后將溶液轉移至離心管， 12000rpm離心5分鐘，將上清轉移至新的離心管中，作為污染土壤待測樣本。取1、2、3、4個 樣品管，依次向各管中加入100 y L的LB培養基，10 y L葡萄糖溶液（2% w/V)，80 y L濃度 為0D600 = 2. 5的大腸桿菌菌液，在1號管中加入10 y L蒸餾水，在2-4號管中依次加入取 自北京北四環某加油站、北京某試驗田、海南某礦區附近的污染土壤待測樣本l〇yL。將各 離心管置于37°C恒溫培養箱中60分鐘，然后用商業化便攜式血糖儀檢測各離心管中葡萄 糖的濃度。根據濃度的差異，即可算出該三種不同污染土壤樣本對大腸桿菌生長繁殖的抑 制率，分別為23. 8%、4. 8%、16. 7%，進而得知不同污染土壤樣本的生物毒性，同時通過對 比不同土壤樣本中葡萄糖濃度，可以比較不同污染土壤樣本生物毒性的高低。
[0095] 顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對 本發明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可 以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發 明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之列。
【主權項】
1. 血糖儀在快速檢測環境污染物生物毒性中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，檢測方法如下： 1) 制備微生物菌液； 2) 將微生物菌液、葡萄糖溶液、培養基和待測樣本混合并孵育30-60min ; 3) 用市售的便攜式血糖儀檢測待測樣本中葡萄糖的濃度； 4) 評價待測樣本的生物毒性。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述制備微生物菌液的方法包括： 1) 將微生物接種于培養基中培養至對數生長期； 2) 收集菌體，獲得菌體沉淀； 3) 洗滌菌體沉淀； 4) 用分散液分散菌體沉淀，制成微生物菌液。4. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述微生物為革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性 菌或真菌。5. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌為大腸桿菌、嗜冷桿菌 或亞硝化單胞菌，優選為大腸桿菌。6. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述革蘭氏陽性菌為枯草芽孢桿菌、變形 桿菌或放線菌，優選為枯草芽孢桿菌。7. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述真菌為酵母菌、白色念珠菌或白色隱 形菌，優選為酵母菌。8. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟2)中洗滌菌體沉淀的溶液為0. 85% 的氯化鈉溶液、PBS溶液、TBS溶液或TBE溶液。9. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，步驟4)中用抑制率評價待測樣本的生物 毒性，所述抑制率的計算公式為抑制率（％ ) = (Nc-Ne)/NcX100% 其中Ne為第一待測樣本的葡萄糖濃度，Ne為對第二待測樣本的葡萄糖濃度。10. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于，于步驟4)中分散液為水溶液、培養基或 氯化鈉溶液。
【文檔編號】C12R1/125GK105821111SQ201510012584
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月9日
【發明人】只金芳, 方德煜, 高冠岳
【申請人】中國科學院理化技術研究所