一種通過基因瞬時表達對整株植物定點改造的方法【專利摘要】本發明公開了一種通過基因瞬時表達對整株植物定點改造的方法。本發明提供的對整株植物中目的基因靶標片段進行定點改造的方法，包括如下步驟：以目的植物的整個植株為瞬時表達對象，在所述目的植物中瞬時表達特異于所述靶標片段的核酸酶，在所述核酸酶的作用下，所述靶標片段被剪切，再通過所述植物的自身DNA修復，最終實現對所述靶標片段的定點改造。本發明通過瞬時表達特異性核酸酶不僅省去了組織培養，在整株植物水平上獲得突變；而且不依賴植物的基因型和受體范圍，可廣泛的應用于不同物種的不同品種之間；同時可以直接獲得T1突變體并能將產生的突變穩定的遺傳到后代，更為重要是產生的突變體植物里沒有外源基因的整合，具有較高的生物安全性。【專利說明】一種通過基因瞬時表達對整株植物定點改造的方法
技術領域：
[0001]本發明屬于植物基因工程領域，涉及一種通過基因瞬時表達對整株植物定點改造的方法。【
背景技術：
】[0002]轉基因是指利用分子生物學手段將外源基因轉移到某種特定生物體中，使其生物性狀或機能發生部分改變。1983年，世界上第一例轉基因植物抗病毒煙草在美國培育成功后，轉基因研究開始迅速發展；1986年，抗病毒棉花成功研制并在美國進入田間試驗；1987年，抗蟲基因、耐除草劑基因轉入作物；1992年，中國商業化種植轉基因煙草；1995年，加拿大開始商業化種植轉基因抗除草劑油菜；1996年，轉基因抗蟲棉和耐除草劑大豆在美國大規模種植。目前全球已擁有120多種轉基因植物，其中大豆、棉花、玉米等51種轉基因作物已開始商品化生產。[0003]進入21世紀，轉基因問題受到越來越多的關注，主要是轉基因食品安全性受到極大爭議，各國政府對轉基因生物安全管理愈加保守，對轉基因作物市場化前的監控愈加嚴格:如果一項技術或產品被認為是轉基因，將花費大量的時間與金錢對該技術或產品進行監管。國際CropLife調查發現，一項轉基因事件的監督管理大約需要5.5年，花費約3500萬美金才能投放市場。此外，已經市場化的轉基因作物并不能被大眾認可，如全球第一種允許上市的轉基因番茄最終由于銷量不佳而下架。因此，通過非轉基因方法對作物進行改良具有重要意義。[0004]當前對作物的遺傳改良或基因修飾都有很多缺陷，例如，傳統雜交育種方法需要多個世代，耗時費力，且受物種間生殖隔離限制和不良基因連鎖的影響;物理或化學誘變方法，如輻射誘變，EMS誘變等，可以在基因組上隨機產生大量突變位點，但是鑒定突變位點十分困難。[0005]基因組定點修飾工具是近年來興起的新技術，主要包括三大類型序列特異性核酸酶：鋅指核酸酶（Zincfingernuclease,ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)和成族的規律間隔的短回文重復序列及其相關系統（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPRassociated，CRISPR/Cas9system)。它們的共同特征是能夠作為核酸內切酶切割特定的DNA序列，創造DNA雙鏈斷裂(Double-strandbreak，DSB)ASB能夠激活細胞內固有的修復機制非同源末端連接（Non-homologousendjoining，NHEJ)和同源重組(11〇111〇1〇8〇118^(3〇11113；[仙1：；[011，冊)對細胞中的0嫩損傷進行修復，在修復過程中，對該特定的DNA序列進行定點編輯。[0006]利用轉基因技術將上述工具轉入作物中，可以克服傳統育種的效率低、耗時長、特異性差的缺點，但由于此過程涉及轉基因，因此需要通過后代分離篩選出不含修飾工具的定點突變體，這是目前被認可的獲得無轉基因痕跡定點突變體的重要方法。由于此方法涉及到外源基因先要整合到植物基因組中，然后通過后代分離去除外源基因，因此，這種獲得突變體的方法仍存在一定的爭議，需要尋求更安全有效的方法避開轉基因，同時對作物進行定點改造。[0007]常規的轉基因手段如農桿菌、基因槍、原生質體等方法需要組織培養，植物組織培養指從植物體分離出符合需要的組織、細胞、原生質體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養以獲得再生的完整植株。組織培養過程容易產生體細胞突變，同時受基因型和受體范圍的限制，需要較長時間的培養才能得到植物體，耗費大量的人力、物力。原位轉化則是指不需要組織或細胞培養手段而達到植物在活體而非離體狀態下的轉化。原位轉化通常以整株植物為作用對象進行轉化，如花粉管通道、花序浸染、莖尖再生、子房注射及農桿菌注射葉片等。原位轉化可以避免組織培養過程，操作簡單且不需要精良的實驗室設備；同時此種方法不依賴植物基因型，可廣泛的應用于不同物種的不同品種之間，并且可以直接獲得轉基因后代。所以，通過瞬時表達體系可以實現對植物基因組的改造，有利于基因編輯技術在植物上的有效利用。【
發明內容】[0008]本發明的目的是提供一種通過基因瞬時表達對整株植物基因組進行定點改造的方法。[0009]本發明所提供的對植物目的基因中靶標片段進行定點改造的方法，具體可包括如下步驟：以目的植物的整個植株為瞬時表達對象，在所述目的植物中瞬時表達特異于所述靶標片段的核酸酶，所述核酸酶靶向并剪切所述靶標片段，再通過所述植物的自身DNA修復，完成對所述靶標片段的定點改造。同時此過程不涉及組織培養的過程。[0010]在所述方法中，在所述目的植物中瞬時表達特異于所述靶標片段的核酸酶的方法包括如下步驟:直接向所述目的植物中導入特異于所述靶標片段的核酸酶或向所述目的植物中導入用于表達特異于所述靶標片段的核酸酶的遺傳物質，將導入所述核酸酶或所述遺傳物質后的植物在無選擇壓力的情況下種植生長，所述核酸酶或未整合在所述目的植物的染色體上的所述遺傳物質被細胞降解；[0011]所述遺傳物質為重組載體(如DNA質粒)或DNA線性片段或體外轉錄的RNA。[0012]在無選擇壓力情況下，植物自身的防御機制會抑制外源基因的進入并將已進入的外源基因降解。因而，將所述瞬時表達的整株植物體進行種植生長，外源基因（包括用于表達特異于所述靶標片段的核酸酶的遺傳物質的任何片段)不會整合入植物基因組中，最終獲得的植物體為非轉基因的定點改造植物體。[0013]在所述方法中，向所述目的植物中導入所述核酸酶或所述遺傳物質時，在所述目的植物上的導入部位可為任何能夠導入所述核酸酶或所述遺傳物質的部位，具體如花粉管、花序、莖尖、子房或葉片等。[0014]在一個實施方式中，當所述導入部位為花粉管時，按照包括如下步驟的方法進行導入:在授粉后向柱頭注射所述重組載體或所述DNA線性片段或所述RNA的溶液或所述核酸酶的溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源的所述遺傳物質或所述核酸酶導入受精卵細胞(即花粉管通道法）。[0015]在一個實施方式中，當所述導入部位為花序時，按照包括如下步驟的方法進行導入:用含有所述重組載體或所述DNA線性片段的農桿菌浸染花序(即花序浸染法）。[0016]在一個實施方式中，當所述導入部位為莖尖時，按照包括如下步驟的方法進行導入:用含有所述重組載體或所述DNA線性片段的農桿菌浸染莖尖(即莖尖再生法）。[0017]在一個實施方式中，當所述導入部位為子房時，按照包括如下步驟的方法進行導入:在授粉后向子房注射所述重組載體或所述DNA線性片段或所述RNA的溶液或所述核酸酶的溶液，將外源的所述遺傳物質或所述核酸酶導入受精卵細胞(即子房注射法）。[0018]在一個實施方式中，當所述導入部位為子房時，按照包括如下步驟的方法進行導入:在授粉后向子房注射含有所述重組載體或所述DNA線性片段的農桿菌（即農桿菌子房注射法）。[0019]在一個實施方式中，當所述導入部位為葉片時，可按照包括如下步驟的方法進行導入:用含有所述重組載體或所述DNA線性片段的農桿菌注射葉片（即葉盤法）。[0020]在所述方法中，特異于所述靶標片段的所述核酸酶可為鋅指核酸酶(ZFN)和類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9核酸酶等所有能實現基因組編輯的核酸酶。[0021]在本發明的一個實施方式中，所述核酸酶具體為CRISPR/Cas9核酸酶。相應的，所述遺傳物質為能轉錄向導RNA和表達Cas9蛋白的重組載體或DNA線性片段;或所述遺傳物質由能轉錄向導RNA的重組載體或DNA線性片段(或分別轉錄crRNA和tracrRNA的兩個重組載體或DNA線性片段），以及能表達Cas9蛋白的重組載體或DNA線性片段或RNA組成；或所述遺傳物質由向導RNA(或crRNA和tracrRNA)以及能表達Cas9蛋白的重組載體或DNA線性片段或RNA組成;所述向導RNA為由crRNA和tracrRNA通過部分堿基配對結合而成的具有回文結構的RNA;所述crRNA含有能夠與所述靶標片段互補結合的RNA片段。[0022]在進一步的實施方式中，在所述重組載體或DNA線性片段中，啟動所述向導RNA的編碼核苷酸序列轉錄的啟動子為U3啟動子或者U6啟動子。[0023]更加具體的，所述能轉錄向導RNA和表達Cas9蛋白的重組載體為在pHSN401質粒的兩個酶切位點Bsal之間正向插入所述"能夠與所述靶標片段互補結合的RNA片段"的編碼核苷酸序列后得到的重組質粒，或在PBUE411質粒的兩個酶切位點Bsal之間正向插入所述"能夠與所述靶標片段互補結合的RNA片段"的編碼核苷酸序列后得到的重組質粒。所述轉錄向導RNA的重組載體為在pZmU3-gRNA質粒的兩個酶切位點Bbsl之間正向插入所述"能夠與所述靶標片段互補結合的RNA片段"的編碼核苷酸序列后得到的重組質粒;所述表達Cas9蛋白的重組載體為PJIT163-Ubi-Cas9載體。[0024]在本發明一個實施方式中，當特異于所述靶標片段的所述核酸酶為TALEN核酸酶時，所述用于表達特異于所述靶標片段的核酸酶的遺傳物質可為同時表達成對TALEN蛋白的重組載體(DNA質粒），或同時表達成對TALEN蛋白的DNA線性片段;或同時表達成對TALEN蛋白的RNA;所述TALEN蛋白由能夠識別所述靶標片段并與其結合的DNA結合域和FokI結構域組成；[0025]在本發明一個實施方式中，當特異于所述靶標片段的所述核酸酶為鋅指核酸酶時，所述用于表達特異于所述靶標片段的核酸酶的遺傳物質可為同時表達成對ZFN蛋白的重組載體(DNA質粒），或同時表達成對ZFN蛋白的DNA線性片段;或同時表達成對ZFN蛋白的RNA;所述ZFN蛋白由能夠識別所述靶標片段并與其結合的DNA結合域和FokI結構域組成。[0026]在所述方法中，所述定點改造具體為:對植物基因組中的靶標片段的核苷酸進行插入突變、缺失突變和/或替換突變。在一個實施方式中，所述靶標片段在目的基因的編碼區內。在一個實施方式中，所述靶標片段在目的基因的轉錄調控區如啟動子內。在一個實施方式中，所述目的基因可以是結構基因或非結構基因。在一個實施方式中，所述改造導致所述目的基因喪失功能。在一個實施方式中，所述改造導致所述目的基因獲得或改變功能。[0027]在一些實施方式中，所述植物可為任何基因型的植物，不受基因型限制。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物，例如，玉米、小麥、大豆、棉花、煙草、擬南芥、黑麥、刺梨、枇杷、番木瓜、狗薔薇、金釵石斛、甘藍、苦蕎麥、橡膠樹等。[0028]當所述植物為單子葉植物或雙子葉植物(如玉米、小麥、大豆、棉花、煙草等等)時，所述方法中采用的遺傳物質或所述核酸酶導入方法可為花粉管通道法;當所述植物為單子葉植物或雙子葉植物(如擬南芥、小麥、黑麥等等)時，所述方法中采用的遺傳物質導入方法可為花序浸染法；當所述植物為單子葉植物或雙子葉植物(如玉米、刺梨、枇杷、番木瓜、狗薔薇等等)時，所述方法中采用的遺傳物質導入方法可為莖尖再生法；當所述植物為單子葉植物或雙子葉植物(如小麥、大豆、棉花、金釵石斛等等)時，所述方法中采用的遺傳物質或所述核酸酶導入方法可為子房注射法；當所述植物為單子葉植物或雙子葉植物(如煙草、甘藍、苦蕎麥、橡膠樹等等)時，所述方法中采用的遺傳物質導入方法可為葉盤法。[0029]在本發明的一個實施方式(實施例1)中，所述植物為單子葉植物玉米(具體如玉米雜交種HiII及自交系B73、鄭58等）；所述核酸酶為CRISPR/Cas9;所述目的基因為玉米內源基因21111?1(;所述靶標片段為5'-46(：1^64〇^06〇^〇1^(：-3'；所述轉錄向導1?嫩的重組載體具體為在pZmU3-gRNA質粒的兩個酶切位點Bbsl之間正向插入5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'所示DNA片段后得到的重組質粒;所述表達Cas9蛋白的重組載體具體為PJIT163-Ubi-Cas9載體;所述轉錄向導RNA和表達Cas9蛋白的重組載體具體為在pBUE411質粒的兩個酶切位點Bsal之間正向插入5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'所示DNA片段后得到的重組質粒。[0030]在本發明的另一個實施方式(實施例2)中，所述植物為雙子葉植物擬南芥;所述核酸酶為CRISPR/Cas9;所述目的基因為擬南芥內源基因AtPTPA;所述靶標片段為5'-ACGATATCCGCCGATTTCAC-3'；所述轉錄向導RNA和表達Cas9蛋白的重組載體具體為在pHSN401質粒的兩個酶切位點Bsal之間正向插入5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3'所示DNA片段后得到的重組質粒。[0031]采用所述方法對待改造植物的目的基因中的靶標片段進行定點改造，從而使所述目的基因喪失功能后獲得的突變植株或其后代(非轉基因突變植株)也屬于本發明的保護范圍。[0032]本發明還提供了一種培育非轉基因突變植物的方法。[0033]該方法具體可包括如下步驟:采用如上所述方法對目的植物的目的基因中的靶標片段進行定點改造，進而獲得所述目的基因喪失功能、且基因組中未整合外源基因的植物，即為所述非轉基因突變植物。[0034]在本發明中，所述轉基因植物指外源基因整合入基因組中的植物;所述非轉基因植物指外源基因未整合入基因組中的植物。[0035]本發明將以整株植物為作用對象的瞬時表達體系與基因組編輯技術相結合，即利用花粉管通道、花序浸染、莖尖再生、子房注射及葉片侵染等方法將序列特異性核酸酶導入整株植物的細胞或組織中，通過序列特異性核酸酶的瞬時表達過程實現對植物基因組的改造，可以直接獲得具有較高的生物安全性的突變體后代。以花粉管通道為例:利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道(花粉管引導組織），將編碼序列特異性核酸酶的DNA溶液或RNA溶液或序列特異性核酸酶的蛋白緩沖液導入受精卵細胞或生殖細胞(精子或卵子），由于這些細胞仍處于未形成細胞壁的類似"原生質體"狀態，并且正進行活躍的DNA復制、分離和重組，因此序列特異性核酸酶會對其進行高效地編輯，被改造的受精卵細胞或生殖細胞逐漸發育為新的突變體。由于編碼序列特異性核酸酶的RNA或序列特異性核酸酶會被植物細胞降解，同時整個過程在無選擇壓力的情況下進行，使得編碼序列特異性核酸酶的DNA也會被植物細胞降解，因此不涉及外源基因的整合，產生的突變體具有較高的生物安全性。[0036]本發明的優勢在于:不僅省去了組織培養，在整株植物水平上獲得突變;而且不依賴植物的基因型和受體范圍，可廣泛的應用于不同物種的不同品種之間；同時可以直接獲得T1突變體并能將產生的突變穩定的遺傳到后代，更為重要的是產生的突變體植物里沒有外源基因的整合，具有較高的生物安全性。【附圖說明】[0037]圖1為原生質體中瞬時表達gRNA:Cas9系統對玉米內源基因ZmIPK定點突變結果。其中，a為電泳圖譜。Marker從下往上依次為（250、500、750、100(^口）；第1泳道為1&^1?^，泳道2和3為導入了gRNA:Cas9系統的原生質體DNA的PCR產物經內切酶SacI酶切結果，泳道4為野生的原生質體DNA的PCR產物經內切酶Sad酶切結果，泳道5為野生型的原生質體PCR產物。b為部分突變體測序結果。[0038]圖2為在玉米品種Hill中利用花粉管通道方法瞬時表達gRNA:Cas9系統對玉米內源基因Zmiro的定點突變及測序結果。其中，a為電泳圖譜。Marker從下往上依次為（100、250、500、750、100(^?);第1泳道為1^^1?^，第2-12泳道為檢測突變體?0?產物33(^酶切結果，第13泳道為野生型對照PCR產物經Sad酶切結果。b為部分突變體測序結果。[0039]圖3為在玉米品種B73中利用花粉管通道方法瞬時表達gRNA:Cas9系統對玉米內源基因ZmIPK的定點突變及測序結果。其中，a為電泳圖譜。Marker從下往上依次為（100、250、500、750、lOOObp);第1泳道為Marker，第2-6泳道為檢測突變體PCR產物SacI酶切結果，第7泳道為野生型對照PCR產物經Sad酶切結果。b為部分突變體測序結果。[0040]圖4為在玉米品種鄭58中利用花粉管通道方法瞬時表達gRNA:Cas9系統對玉米內源基因Zmiro的定點突變及測序結果。其中，a為電泳圖譜。Marker從下往上依次為（100、250、500、750、100(^?);第1泳道為1&^1?^，第2-9泳道為檢測突變體?0?產物3&(31酶切結果，第10泳道為野生型對照PCR產物經Sad酶切結果。b為部分突變體測序結果。[00411圖5為分別利用pZmU3-gRNA-Cl及pJIT163-Ubi-Cas9載體上的2對引物擴增利用花粉管通道得到的不同玉米品種ZmIPK基因突變體凝膠電泳圖。a為采用引物對ZmU3-F/ClR的擴增結果；b為采用引物對Cas9-1F/Cas9-1R的擴增結果。其中，Marker從下往上依次為(100、250、500、750、100(^口）；第1泳道為1&^1?^，第2-10泳道為檢測突變體，第11泳道為陽性對照（質粒pZmU3-gRNA-Cl或pJIT163-Ubi-Cas9)。[0042]圖6為原生質體中瞬時表達gRNA:Cas9系統對擬南芥的內源基因AtPTPA定點突變結果。a為電泳圖譜。Marker從下往上依次為（100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp);第1泳道為Marker，泳道2和3為導入了含有gRNA:Cas9系統的原生質體DNA，PCR產物經內切酶EcoRV酶切結果，泳道4為野生的原生質體DNA的PCR產物經內切酶EcoRV酶切結果;泳道5為野生型的原生質體PCR產物。b為部分未切開條帶測序結果。[0043]圖7為花序浸染法瞬時表達gRNA:Cas9系統對擬南芥的內源基因AtPTPA的定點突變結果。其中，a為電泳圖譜。Marker從下往上依次為（100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp);第1泳道為Marker，第2-9泳道為檢測突變體PCR產物EcoRV酶切結果，第10泳道為野生型對照PCR產物經EcoRV酶切結果。b為部分突變體測序結果。[0044]圖8為利用pHSN401-C2載體上的引物擴增擬南芥AtPTPA基因突變體凝膠電泳圖。a為采用引物對PHSN401-1F/C2R的擴增結果;b為采用引物對CAS9-2F/CAS9-2R的擴增結果。其中，Marker從下往上依次為（100、250、500、750、1000、2000、3000、500(^口）；第1泳道為Marker，第2-9泳道為檢測突變體，第10泳道為陽性對照(質粒pHSMOl)。[0045]圖9為擬南芥AtPTPA基因突變體后代突變結果。Marker從下往上依次為（100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp);第1泳道為Marker，第2，3，4，5泳道為純合突變體后代，第6,7泳道為分離到的野生型后代，第8、9、10泳道為雜合突變體后代。【具體實施方式】[0046]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。[0047]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。[0048]表達載體pZmU3_gRNA在文獻"Liang，Z?etal?TargetedmutagenesisinZeamaysusingTALENsandtheCRISPR/CasSystem.JournalofGeneticsandGenomics.41:63_68,(2014)"中公開過。[0049]表達載體pJIT163-Ubi_Cas9在文獻"Wang,Y.etal?Simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.NatureBiotechnology.32,947-951(2014)."中公開過。[0050]表達載體pHSN401及pBUE411在文獻"Xing,H.etal.ACRISPR/Cas9toolkitformultiplexgenomeeditinginplants.BMCPlantBiology.14:327,（2014)"中公開過。[0051]玉米品種Hi11在文獻"Armstrong，C?L?，Green，C?E?&Phi11ips，R.L.DevelopmentandavailabilityofgermplasmwithhightypeIIcultureformationresponse.MaizeGenet.Coop.NewsLett.65,92-93(1991)"中公開過。[0052]玉米品種B73在文獻"Russell,W.A.RegistrationofB70andB73parentallinesofmaize.CropSci.12,721(1972)"中公開過。[0053]玉米品種鄭58在文獻"張發林，玉米優良自交系鄭58的育成和應用.作物雜志，2001(4):31-31"中公開過。[0054]擬南芥品種Columbia在文獻"Koorneef，M.etal.LinkagemapofArabidopsisthaliana.JornalofHeredity.74,265-272(1983)"中公開過。[0055]MS培養基配制:MS鹽（318111&，115524)4.438/1，蔗糖3(^/1，植物凝膠38/1411值為5?7，121°C滅菌20分鐘。[0056]LB培養基:Trypton10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，溶解后調pH7.0,固體LB培養基，每升液體培養基中加入15g瓊脂粉，121°C滅菌20分鐘。[0057]原生質體制備和轉化所用溶液如表1-表6所示。[0058]表1擬南芥50ml酶解液[0061]表2玉米50ml酶解液[0063]表3500mlW5[0065]表4250mlWI溶液[0067]表510mlMMG溶液[0070]表64mlPEG溶液[0072]上述表1-表6中的％表不質量體積百分含量，g/100ml。[0073]農桿菌轉化方法：[0074]1)將_80°C保存的感受態細胞置于冰中融化后，加入約2yg質粒DNA，輕彈混勻，于冰上放置30min。[0075]2)將EP管放入液氮中lmin。[0076]3)迅速取出，將EP管轉入37°C水浴(2min)融化后，加入lmlLB液體培養基，于28°C低速振蕩（150rpm)4~5h。[0077]4)lOOOOrpm離心30s收集菌體，去上清，留lOOyl懸浮菌體后均勻涂布于含相應抗生素的篩選平板上。[0078]5)倒置于28°C培養至白色轉化子長出。[0079]實施例1、利用花粉管通道和莖尖再生定點編輯玉米內源基因ZmIPK[0080]一、革E標片段target-ci的設計[0081]Target-Cl:5'-CCGAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'；（GenbankNo?AY172635的ZmIPK基因中，第393-415位）。[0082]二、含有C1核苷酸片段的pZmU3-gRNA質粒及pBUE411質粒的制備[0083]C1是能與靶標Target-Cl互補結合的RNA的編碼DNA。[0084]合成下述帶有粘性末端(下劃線部分)的單鏈引物：[0088]C1-1F/C1R經過引物退火程序形成有粘性末端的雙鏈DNA，插入到pZmU3-gRNA質粒的兩個Bbsl酶切位點之間，即得含有C1的pZmU3-gRNA質粒，質粒經測序驗證陽性質粒，SP在pZmU3-gRNA質粒的兩個酶切位點Bbsl之間正向插入5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'所示DNA片段后得到的重組質粒為陽性，命名為pZmU3-gRNA-Cl。[0089]C1-2F/C1R經過引物退火程序形成有粘性末端的雙鏈DNA，插入到pBUE411質粒的兩個Bsal酶切位點之間，即得含有C1的pBUE411質粒，質粒經測序驗證陽性質粒，即在pBUE411質粒的兩個酶切位點Bsal之間正向插入5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'所示DNA片段后得到的重組質粒為陽性，命名為pBUE411-Cl。[0090]三、轉化gRNA:Cas9系統至玉米原生質體[0091]將含有C1的pZmU3-gRNA-Cl質粒及pJIT163-Ubi-Cas9質粒轉化玉米原生質體，原生質體制備和轉化具體過程為：[0092]1、玉米苗的培養[0093]將玉米雜交種Hill及自交系B73、鄭58的種子分別在水中浸泡過夜，將浸泡后的種子轉移到放有吸水紙的培養皿中加水，光照處理3天，使其發芽(大約lcm)。土壤種植發芽的玉米種子，24°C，培養10-11天，得到玉米苗。[0094]2、原生質體分離[0095]1)取玉米苗幼嫩的葉片，用刀片將其中間部分切成寬度0.5-lmm的絲，將其放入50ml酶解液中消化5小時(先抽真空酶解0.5h，再lOrpm緩慢搖晃4.5h)，得到酶解產物。[0096]注:酶解溫度要保持在20-25°C，且要避光，酶解完輕輕搖晃酶解液，使原生質體釋放出來。[0097]2)加30mlW5稀釋酶解產物，用75um尼龍濾膜過濾酶解液于圓底離心管中（50ml)。[0098]注:尼龍濾膜要浸泡在體積百分含量為75%(體積分數）的酒精水溶液里，用時要用水沖洗，用W5浸泡2min再用于過濾。[0099]3)將圓底管中的溶液23°C，150g離心3min，棄上清，得原生質體。[0100]4)加10mlW5重懸原生質體，150g離心3分鐘，棄上清。[0101]5)加適量MMG溶液懸浮，至于冰上，待轉化。[0102]注:此時需要確定原生質體的濃度，鏡檢（X100)，原生質體數為2X105個/ml至1X106個/ml。[0103]3、玉米原生質體轉化[0104]1)加lOygpZmU3-gRNA_Cl質粒及lOygpJIT163-Ubi_Cas9質粒于2ml離心管，用槍頭吸取200yl原生質體輕彈混勻，靜置3-5min，再加220ylPEG4000溶液，輕彈混勻，避光誘導15min〇[0105]2)加880ylW5(室溫)顛倒混勻，lOOg離心3min，棄上清，得沉淀。[0106]3)向沉淀中加1mlWI溶液，顛倒混勻，輕輕轉至6孔板中（每個孔中已預先加入lmlWI溶液），23°C培養過夜。[0107]四、PCR/RE實驗分析在玉米原生質體中gRNA:Cas9系統對內源基因ZmIPK的突變結果[0108]在玉米原生質體轉化后48小時提取基因組DNA，以其為模板，進行PCR/RE(PolymeraseChainReaction/Restrictiondigestion)實驗分析。同時設置野生型玉米品種HiII的原生質體作為對照。PCR/RE分析方法參考文獻"Shan,Q.etal.RapidandefficientgenemodificationinriceandBrachypodiumusingTALENs.MolecularPlant，6(4):1365-1368,（2013)"，由于玉米內源基因ZmIPK(GenbankNo.AY172635)的靶標片段(GenbankNo.AY172635的第393-415位）上存在限制性內切酶SacI的識別序列（5'_GAGCTC-3'），因而實驗中采用限制性內切酶SacI進行PCR/RE檢測實驗。PCR擴增引物如下：[0109]ZmIPK-lF:5'-TCGCAGCCCCTGGCAGAGCAA-3'；[0110]ZmIPK-lR:5'-GAGACCTGGGAGAAGGAGACGGATCC-3'[0111]PCR/RE實驗分析結果見圖1，結果表明玉米在ZmIPK基因靶位點發生了突變，回收測序未切開條帶，測序結果表明ZmIPK基因發生了堿基插入/刪除（insertion/deletion，indel)類型的突變。[0112]五、利用花粉管通道法定點編輯玉米內源基因ZmIPK[0113]細胞穿膜肽（cell-penetratingpeptides簡稱CPPs)是一類能夠攜帶超出自身100倍的大分子物質包括蛋白質及核酸進入細胞的短肽，近年來研究表明細胞穿膜肽與DNA結合后具有保護DNA完整性防止DNA酶降解的功能。因此，在農業科研及生產中通常將細胞穿膜肽與花粉管通道轉化法相結合，以提高花粉管通道的效率。[0114]1)含穿膜肽的DNA溶液的制備：將固態粉末狀穿膜肽（氨基酸序列為RKKRRQRRRRKKRRQRRR，由上海生物工程公司合成）用無菌水配置成30mg/ml母液，在pZmU3-gRNA-Cl質粒及pJIT163-Ubi-Cas9質粒混合溶液（混合溶液中pZmU3-gRNA-Cl質粒與pJIT163-Ubi-Cas9質粒的質量比為1:1)中按質量比1:1加入穿膜肽，使所得的DNA和穿膜肽的終濃度為25-30μg/ml(兩個質粒終濃度之和為25-30μg/ml，穿膜肽的終濃度為25-30yg/ml)〇[0115]2)選擇大田中長勢旺盛的玉米(Hill、B73及鄭58)作為受體材料，在開花期從受體群體中選擇發育較好的植株進行套袋授粉雜交或自交。授粉18~21h后，先將雌穗上的紙袋摘下，用剪刀剪去距離穗軸頂端2-3厘米的花絲和苞葉，保持花絲切面平齊，加以修剪并使苞葉內的花絲略低于苞葉形成一個小凹槽;然后快速用移液槍在切口處滴注300-400yl步驟1)準備好的含穿膜肽的DNA溶液，將花絲浸泡在DNA溶液中，之后立即重新套上紙袋，每種處理做40-50個果穗。待玉米果穗成熟時，將其分別曬干脫粒。[0116]3)將曬干的玉米種子種植，待萌發后用PCR/RE方法檢測玉米ZmIPK基因突變體(具體檢測方法及采用引物序列參見步驟四）。[0117]不同基因型的玉米均通過花粉管通道的方法獲得了突變體，部分突變體的檢測結果如圖2-圖4所示，結果表明不同的玉米品種均在ZmIPK基因靶位點發生了突變，回收測序未切開條帶，測序結果表明ZmIPK基因發生了堿基插入/刪除（insertion/deletion，indel)類型的突變。可見，本發明所提供的花粉管通道法在整株植物水平上獲得突變不依賴植物的基因型和受體范圍。[0118]六、利用莖尖再生法定點編輯玉米內源基因ZmIPK[0119]1、玉米材料準備：[0120]1)將玉米自交系HiII種子放入三角瓶中，70%(體積分數)酒精消毒5min，5%(體積分數)次氯酸鈉消毒30min，無菌水洗5次。然后加入1.5倍種子體積的水，封口放入28°C，浸4_6h。[0121]2)第二次滅菌，5%(體積分數)次氯酸鈉消毒30min，無菌水洗5次。[0122]3)將滅菌種子放入帶有濾紙的無菌培養皿中萌發，28°C暗培養約3天。將生長狀態一致的萌發種子轉入MS培養基中，28°C暗培養3-4天，待植株長到4-5cm時使用。[0123]2、玉米莖尖再生[0124]1)撥芽尖:在骨節上1.處橫切露出芽尖，然后縱切，在芽尖的中間一刀切到骨節的下方約〇.2_處(一般剛剛過骨節即可），根保留0.8cm左右。[0125]2)將含有C1的pBUE411-Cl質粒轉入農桿菌感受態AGL1中，質粒PCR及酶切鑒定后，陽性菌株用于侵染植物。[0126]3)將陽性菌株涂在LB固體培養基上，28°C暗培養，2天后，刮取少量菌液溶入20mlMS液體培養基中，28°C至懸濁液0D6(x)=0.8左右，加入200yM乙酰丁香酮。[0127]4)將切好的植株放入培養皿中，切口朝下，將培養皿傾斜30_45°C放入真空皿中，加入少量沒過切口的農桿菌菌液，浸染20min。期間抽真空lOmin，壓力0.05MP。[0128]5)侵染后，將植株從菌液中取出，用濾紙將多余菌液吸去，而后插入MS培養基中。23°C暗培養3天。[0129]6)共培養結束后，取出材料，洗去培養基，將苗子栽入花盆中（普通土壤占據4/5，表層放蛭石，約占1/5)，移栽后先28°C暗培養2天，而后光照7-10天，可于正常條件下生長至自然結實。將結實后的玉米種子種植，待萌發后用PCR/RE方法檢測玉米ZmIPK基因突變體。[0130]結果表明玉米在ZmIPK基因靶位點發生了突變，回收測序未切開條帶，測序結果表明ZmIPK基因發生了堿基插入/刪除（insertion/deletion，indel)類型的突變。[0131]七、檢測經過花粉管通道得到的玉米突變體中是否存在pZmU3-gRNA-Cl質粒及pJIT163-Ubi-Cas9質粒[0132]根據pZmU3-gRNA-Cl質粒及pJIT163-Ubi-Cas9質粒序列，設計2對引物進行PCR擴增，分別擴增pZmU3-gRNA-Cl質粒與pJIT163-Ubi-Cas9質粒。[0133]ZmU3-F/ClR位于ZmU3與靶標片段之間：[0134]ZmU3-F:5'-CTGCCAAGATCAACAGCAACCA-3'；[0135]C1R:5，-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3，。[0136]理論擴增片段大小約為322bp，序列為序列表中序列1的第467-788位，序列1為pZmU3-gRNA-Cl的序列。[0137]Cas9-1F/Cas9-1R位于pJIT163-Ubi-Cas9載體上：[0138]Cas9-1F:5'-CTTCCCAAGCATTCCCTCCTGT-3'；[0139]Cas9-lR:5'-CTTATGCCGTCCCATGACCTTC-3'。[0140]理論擴增片段大小約為744bp，序列為序列表中序列2的第1573-2316位，序列2為pJIT163-Ubi-Cas9載體的Cas9序列。[0141]結果顯示，所有植物都未能擴增出目的條帶（圖5)，說明本發明在定點改造植物的同時避免了外源基因的插入或攜帶，獲得的突變體具有較高的生物安全性。[0142]八、檢測經過莖尖再生得到的玉米突變體中是否存在pBUE411-Cl質粒[0143]根據pBUE411-Cl質粒序列，設計2對引物進行PCR擴增，分別擴增0sU3p與Cas9部分。[0144]pBUE411-lF/ClR位于0sU3p與靶標片段之間：[0145]pBUE411-lF:5'-GACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTAC-3'；[0146]C1R:5，-AAACAGCTCGACCACGCCGCCGAC-3，。[0147]理論擴增片段大小約為289bp，序列為序列表中序列3的第174-462位，序列3為PBUE411-C1質粒的gRNA序列。[0148]CAS9-2F/CAS9-2R位于pBUE411-Cl載體的Cas9載體上：[0149]CAS9-2F:5'-CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3'；[0150]CAS9-2R:5'-TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC-3'。[0151]理論擴增片段大小約為794bp，序列為序列表中序列4的第1639-2432位，序列4為PHSN411-C1載體的CAS9序列。[0152]結果顯示，所有植物都未能擴增出目的條帶。說明本發明在定點改造植物的同時避免了外源基因的插入或攜帶，獲得的突變體具有較高的生物安全性。[0153]實施例2、利用花序浸染法定點編輯擬南芥內源基因AtPTPA[0154]-、革E標片段target_C2的設計[0155]Target-C2:5'-CCGACGATATCCGCCGATTTCAC-3';(GenbankNo?AF360133所示的AtPTPA基因中，第351-373位）。[0156]二、含有C2核苷酸片段pHSMOl質粒的制備[0157]C2是能與靶標Target_C2互補結合的RNA的編碼DNA。[0158]合成下述帶有粘性末端(下劃線部分)的單鏈引物：[0159]C2F:5，-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3，；[0160]C2R:5'-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3'。[0161]經過引物退火程序形成有粘性末端的雙鏈DNA，插入到pHSMOl質粒的兩個Bsal酶切位點之間，即得含有C2的pHSMOl質粒，質粒經測序驗證陽性質粒，即在pHSMOl質粒的酶切位點Bsal處正向插入5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3'所示DNA片段后得到的重組質粒為陽性，命名為PHSN401-C2。[0162]三、轉化gRNA:Cas9系統至擬南芥原生質體[0163]將步驟二獲得的含有C2的pHSN401-C2質粒轉化至擬南芥品種Columbia的原生質體，原生質體制備和轉化具體過程為：[0164]1、擬南芥的種植：[0165]1)種子處理:將擬南芥品種Columbia的種子置于1.5mL離心管中，75%(體積分數）乙醇浸泡lmin，棄去乙醇，加10%(體積分數)NaCIO浸泡15min，倒掉NaCIO,然后用無菌蒸餾水洗滌5_6遍。[0166]2)將消毒處理后的種子用微量進樣器點到MS培養基上，每次僅點一粒種子，點樣完畢后，將培養基密封，置于4°C春化3-4天。[0167]3)春化完畢后，將培養基轉入培養箱中，培養條件為:溫度21°C，光照強度5500土300Lx，光照時間12h。當植株生長3周時間時進行移植。[0168]4)利用鑷子將幼苗小心的插入土壤(泥炭土:蛭石:珍珠巖=1:1:1，體積比）中，將幼苗根部掩埋，掩埋過程中土質要保持疏松，種下擬南芥后需要澆水并蓋膜3-4天。然后置于21°C、6300±300Lx的光照強度下培養。[0169]2、原生質體分離：[0170]1)取擬南芥品種Columbia幼嫩的葉片（培養約一個月的幼苗），用刀片將其切成0.5mm的絲，放入50ml酶解液中消化5小時(先抽真空酶解0.5h，再lOrmp緩慢搖晃4.5h)。[0171]注:酶解溫度要保持在20-25°C，且要避光，酶解完輕輕搖晃酶解液，使原生質體釋放出來。[0172]2)加30mlW5稀釋酶解產物，用75mi尼龍濾膜過濾酶解液于50ml圓底離心管中。[0173]注:尼龍濾膜要浸泡在75%(體積分數)酒精里，用時要用水沖洗，再用W5浸泡2min再過濾。[0174]3)23°C，60g離心5min，棄上清。[0175]4)用10mlW5輕輕懸起原生質體，搖晃均勾，60g離心5min，棄上清。[0176]5)加適量MMG溶液懸浮，至于冰上，待轉化。[0177]注:此時需要確定原生質體的濃度，鏡檢（X100)，原生質體數為2X105個/ml至1X106個/ml。[0178]3、擬南芥原生質體轉化[0179]1)加20yg含有C2的pHSN401-C2質粒于2ml離心管，用槍頭吸取200yl原生質體輕彈混勻，再加220ylPEG4000,輕彈混勻，避光誘導15-30min;[0180]2)加880ylW5(室溫)顛倒混勻，60g離心5min，棄上清；[0181]3)加lmlW5,顛倒混勻，輕輕轉至6孔板中，已預先加入lmlW5,23°C培養過夜。[0182]四、PCR/RE實驗分析gRNA:Cas9系統對擬南芥內源基因AtPTPA定點突變結果[0183]擬南芥原生質體轉化后48小時提取基因組DNA，以該DNA為模板，進行PCR/RE(PolymeraseChainReaction/Restrictiondigestion)實驗分析。PCR/RE分析方法參考了文獻Shan,Q.etal.RapidandefficientgenemodificationinriceandBrachypodiumusingTALENs.MolecularPlant(2013)，由于擬南芥內源基因AtPTPA(GenbankN〇.AF360133)的靶標片段(GenbankN〇.AF360133的第351-373位）上存在限制性內切酶EcoRV的識別序列（5'-GATATC-3'），因而實驗中采用限制性內切酶EcoRV進行PCR/RE檢測實驗。其中，PCR擴增所用引物為：[0184]PTPA-F:5'-GATGCTCCAGCCACCATATC-3'；[0185]PTPA-R:5'-CAGTTCGGTACACCACTTATATCA-3'。[0186]PCR/RE實驗分析結果見圖6,結果表明擬南芥在AtPTPA基因靶位點發生了突變，回收測序圖6中的條帶，測序結果表明在AtPTPA基因的靶位點發生了堿基插入/刪除(insertion/deletion，indel)類型的突變。[0187]五、利用花序浸染法定點編輯擬南芥內源基因AtPTPA[0188]1)擬南芥材料的準備[0189]在擬南芥初次開花時將花蕾剪掉，促進側枝產生更多的花枝。在用花序浸染法浸染擬南芥之前，先用剪刀剪去已經長成的角果。[0190]2)將含有C2的pHSN401-C2質粒轉入農桿菌感受態GV3101中，質粒PCR及酶切鑒定后，陽性菌株用于浸染植物。[0191]3)陽性農桿菌菌株先用2ml離心管少量搖菌，約8-10小時后轉移到200mlLB培養基中（按1:100的比例接菌)過夜培養到OD600值約0.8~1.0為止，5000g離心15min集菌，用浸染緩沖液(配方：2.16g/LMgCl2?6H20,5%(5g/100ml)蔗糖，0.02%(0.02g/100ml)silwetL-77)重懸細胞用于浸染植物。[0192]4)把100ml浸染緩沖液倒入大皿內，然后把擬南芥的花序浸入侵染2分鐘，侵染過程中要不斷轉動擬南芥，侵染后用濾紙擦干菌液，用黑色塑料袋或者薄膜覆蓋擬南芥，暗培養24小時。由于擬南芥的盛花期較長，所以一般要侵染2-3次。[0193]5)正常培養條件下生長、收獲T1代擬南芥種子并種植，待種子萌芽后對AtPTPA基因進行PCR/RE檢測（具體檢測方法及采用引物序列參見步驟四），得到的500株植物中有20株AtPTPA基因突變體。同時設置野生型擬南芥品種Columbia作為對照。[0194]檢測結果如圖7所示，結果表明在AtPTPA基因靶位點發生了突變，回收測序圖中的條帶，測序結果表明在AtPTPA基因的革巴位點都發生了堿基插入/刪除（insertion/deletion,indel)類型的突變。[0195]6)經過步驟5)產生的20株突變體進行PCR擴增，檢測突變體中是否存在pHSN401-C2質粒，設計2對引物進行PCR擴增(分別位于U6-26p與Cas9部分上）。[0196]pHSN401-lF/C2R位于U6-26p與靶標片段之間：[0197]pHSN401-lF:5'-TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC-3'；[0198]C2R:5'-AAACACGATATCCGCCGATTTCAC-3'。[0199]理論擴增片段大小約286bp，序列為序列表中序列5的第170-455位，序列5為PHSN401-C2載體的gRNA部分序列。[0200]CAS9-2F/CAS9-2R位于pHSN401-C2載體的CAS9載體上：[0201]CAS9-2F:5'-CTCCCTAAGCACTCGCTCCTGT-3'；[0202]CAS9-2R:5'-TTCTGCGTGGTCTGATTCTCCC-3'。[0203]理論擴增片段大小約為794bp，序列為序列表中序列4的第1639-2432位，序列4為PHSN401-C2載體的CAS9序列。利用pHSN401-C2載體上的引物pHSN401-lF/C2R擴增擬南芥AtPTPA基因突變體凝膠電泳圖如圖8中a所示。利用pHSN401-C2載體上的引物CAS9-2F/CAS9-2R擴增擬南芥AtPTPA基因突變體凝膠電泳圖如圖8中b所示。從圖的結果可以看出，步驟5)獲得的擬南芥AtPTPA基因突變體均未擴增到目的片段，證明突變體中已經不存在gRNA:Cas9系統質粒上的片段。[0204]7)經過步驟5)產生的20株突變體的后代中，隨機挑選9株進行PCR/RE檢測，電泳結果如圖9所示。可以看出，步驟5)獲得的擬南芥AtPTPA基因突變體可以穩定遺傳到后代。可見，本發明在定點改造植物的同時避免轉基因的插入或攜帶，免除后續的轉基因的安全問題及大眾擔憂;同時避免了組織培養過程，減少了人力、物力的消耗。【主權項】1.對整株植物中目的基因的靶標片段進行定點改造的方法，包括如下步驟：以目的植物的整個植株為瞬時表達對象，在所述目的植物中瞬時表達特異于所述靶標片段的序列特異性核酸酶，所述核酸酶靶向并剪切所述靶標片段，由此通過所述目的植物的自身DNA修復，完成對所述靶標片段的定點改造。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:在所述目的植物中瞬時表達所述序列特異性核酸酶的方法包括如下步驟：a)直接向所述目的植物中導入序列特異性核酸酶或向所述目的植物中導入用于表達序列特異性核酸酶的遺傳物質，b)將導入所述核酸酶或所述遺傳物質后的植物在無選擇壓力的情況下種植生長，所述核酸酶或未整合在所述目的植物的染色體上的所述遺傳物質被細胞降解；其中所述遺傳物質為重組載體或DNA線性片段或體外轉錄的RNA。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:在向所述目的植物中導入所述序列特異性核酸酶或所述遺傳物質的過程中，在所述目的植物上的導入部位為任何能夠導入所述序列特異性核酸酶或所述遺傳物質的部位。4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述導入部位為花粉管、花序、莖尖、子房、葉片或其他任何能以整株植物為導入對象的部位。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述導入部位為花粉管，則按照包括如下步驟的方法進行導入:在授粉后向柱頭注射所述重組載體或所述DNA線性片段或所述體外轉錄的RNA的溶液或所述序列特異性核酸酶的溶液；所述導入部位為花序，則按照包括如下步驟的方法進行導入：用含有所述重組載體或所述DNA線性片段的農桿菌浸染花序；所述導入部位為莖尖，則按照包括如下步驟的方法進行導入：用含有所述重組載體或所述DNA線性片段的農桿菌浸染莖尖；所述導入部位為子房，則按照包括如下步驟的方法進行導入:在授粉后向子房注射所述重組載體或所述DNA線性片段或所述體外轉錄的RNA的溶液或所述序列特異性核酸酶的溶液；所述導入部位為子房，則按照包括如下步驟的方法進行導入:在授粉后向子房注射含有所述重組載體或所述DNA線性片段的農桿菌；所述導入部位為葉片，則按照包括如下步驟的方法進行導入：用含有所述重組載體或所述DNA線性片段的農桿菌注射葉片。6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述序列特異性核酸酶為CRISPR/Cas9核酸酶、TALEN核酸酶、鋅指核酸酶或所有能實現基因組編輯的核酸酶；具體的，所述序列特異性核酸酶為CRISPR/Cas9核酸酶，所述遺傳物質為能轉錄向導RNA和表達Cas9蛋白的重組載體或DNA線性片段;或所述遺傳物質由能轉錄向導RNA的重組載體或DNA線性片段，以及能表達Cas9蛋白的重組載體或DNA線性片段或RNA組成;或所述遺傳物質由向導RNA，以及能表達Cas9蛋白的重組載體或DNA線性片段或RNA組成；所述向導RNA為由crRNA和tracrRNA通過部分堿基配對結合而成的具有回文結構的RNA;所述crRNA含有能夠與所述靶標片段互補結合的RNA片段；具體的，所述序列特異性核酸酶為TALEN核酸酶，所述遺傳物質為能表達成對TALEN蛋白的重組載體或能表達成對TALEN蛋白的DNA線性片段或能表達成對TALEN蛋白的RNA;所述TALEN蛋白由能夠識別所述靶標片段并與其結合的DNA結合域和FokI結構域組成;或具體的，所述序列特異性核酸酶為鋅指核酸酶，所述遺傳物質為能表達成對ZFN蛋白的重組載體或能表達成對ZFN蛋白的DNA線性片段或能表達成對ZFN蛋白的RNA;所述ZFN蛋白由能夠識別所述靶標片段并與其結合的DNA結合域和FokI結構域組成。7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述定點改造為:對所述靶標片段的核苷酸進行插入突變、缺失突變和/或替換突變。8.非轉基因突變植株，為采用權利要求1-7中任一所述的方法對待改造植物的目的基因中的靶標片段進行定點改造，使所述目的基因喪失功能后獲得的突變植株或其后代。9.一種培育非轉基因突變植物的方法，包括如下步驟:采用權利要求1-7中任一所述方法對目的植物的目的基因中的靶標片段進行定點改造，進而獲得所述目的基因喪失功能、且基因組中未整合外源基因的植物，即為所述非轉基因突變植物。10.根據權利要求1-9中任一所述的方法或非轉基因突變植株，其特征在于:所述植物為任何基因型的植物。11.根據權利要求1-9中任一所述的方法或非轉基因突變植株，其中所述植物選自玉米、小麥、大豆、棉花、煙草、擬南芥、黑麥、刺梨、枇杷、番木瓜、狗薔薇、金釵石斛、甘藍、苦蕎麥和橡膠樹。12.根據權利要求1-9中任一所述的方法或非轉基因突變植株，其中所述植物是玉米；所述序列特異性核酸酶是CRISPR/Cas9核酸酶;所述靶基因是ZmIPK。13.根據權利要求12的方法或非轉基因突變植株，其中所述靶片段是5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'；所述轉錄向導RNA的重組載體為在pZmU3-gRNA質粒的兩個酶切位點Bbsl之間正向插入5'-AGCAGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'所示DNA片段后得到的重組質粒;所述表達Cas9蛋白的重組載體為pJIT163-Ubi-Cas9載體。14.根據權利要求12的方法或非轉基因突變植株，其中所述靶片段是5'-AGCTCGACCACGCCGCCGAC-3'；所述轉錄向導RNA和表達Cas9蛋白的重組載體為在pBUE411質粒的兩個酶切位點Bsal之間正向插入5'-GGCGGTCGGCGGCGTGGTCGAGCT-3'所示DNA片段后得到的重組質粒。15.根據權利要求1-9中任一所述的方法或非轉基因突變植株，其中所述植物是擬南芥;所述序列特異性核酸酶是CRISPR/Cas9核酸酶;所述靶基因是AtPTPA。16.根據權利15的方法或非轉基因突變植株，其中所述靶標片段為5'-ACGATATCCGCCGATTTCAC-3'；所述轉錄向導RNA和表達Cas9蛋白的重組載體為在pHSN401質粒的兩個酶切位點Bsal之間正向插入5'-ATTGGTGAAATCGGCGGATATCGT-3'所示DNA片段后得到的重組質粒。【文檔編號】A01H5/00GK105821073SQ201610055436【公開日】2016年8月3日【申請日】2016年1月27日【發明人】高彩霞,張毅,吳忠義,張康【申請人】中國科學院遺傳與發育生物學研究所